楊 輝 宗軍君 薛向鋒 侯智斌

(中國人民解放軍陸軍軍官學院 合肥 230031)

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生物戰(zhàn)劑/氣溶膠探測和識別系統(tǒng)綜述*

楊 輝 宗軍君 薛向鋒 侯智斌

(中國人民解放軍陸軍軍官學院 合肥 230031)

生物戰(zhàn)劑/武器具有針對性強(人體、動物或植物)、易于制造、廉價、探測困難、防護代價高、感染群體診治困難等特性,對生物戰(zhàn)劑的防御極具挑戰(zhàn)性。論文對生物氣溶膠/生物戰(zhàn)劑探測識別系統(tǒng)的技術路線(如物理、分子、免疫及配合基檢驗等)、特點和運用情況進行了分析梳理和總結。

生物戰(zhàn)劑; 生物氣溶膠; 探測; 識別

Class Number E835.8

1 引言

人類使用生物戰(zhàn)劑已有2500年的歷史。生物戰(zhàn)劑或生物武器包括微生物和生物毒素,可以致人、動物和植物疾病或死亡。生物戰(zhàn)劑可以極小的經濟代價、隱蔽地感染大面積的人員和其他生物,導致大規(guī)模的傷亡。對生物武器實施有效防護極為困難的原因包括探測復雜、防護代價高昂以及戰(zhàn)劑的極強感染選擇性等,感染后的初始癥狀也不易與常規(guī)感染區(qū)分開,不便于開展醫(yī)學處理。

相對而言,生物探測技術遠未達到化學探測技術的成熟水平。點式探測設備是目前最典型的生物氣溶膠探測系統(tǒng),大多處于外場測試或實驗室研制階段,體積大、結構復雜、價格昂貴、探測虛警率高、探測戰(zhàn)劑種類少,且必須接觸探測對象。利用DNA序列分子特性、抗原標識、質譜分析等進行精確的探測和識別理論上是可行的,遠程遙測系統(tǒng)只能進行空間分布的探測,不能精確確定生物戰(zhàn)劑的類別及濃度。因此,判定生物戰(zhàn)劑性質、成份的傳感器非常復雜,識別設備需特制的、受訓過的鑒別器等。

生物戰(zhàn)劑的探測和識別系統(tǒng)可被區(qū)分為不同的類別。如按移動能力分,可分為手持式便攜式探測裝備、移動實驗室探測裝備、成像設備、固定設施探測系統(tǒng)、遠程遙測系統(tǒng)、生物采樣儀和生物試劑盒等。根據探測識別原理,設備可分為分子識別技術(聚合酶鏈反應PCR,分子雜交和陣列技術)、免疫偵測技術(側流免疫,電化學發(fā)光、酶聯(lián)免疫吸附測定ELISA,時間分辯熒光、生物傳感器),物理技術(流式細胞儀、光纖、采樣準備、熒光、尺度和形狀分析、質譜分析、毛細管電泳、高性能液相色譜法、火焰分光光度測定法、氣相色譜法),配體小分子技術(表面等離子共振)、顯微、標準細菌培養(yǎng)和混合設備技術等。

2 生物戰(zhàn)劑

生物戰(zhàn)劑是活體病原微生物以及相關的生物毒素,它們可以引發(fā)大規(guī)模的人類、動物和/或植物的感染和中毒。生物戰(zhàn)劑根據誘發(fā)媒介的不同,可為分為細菌、病毒、立克次氏體和生物毒素。

生物戰(zhàn)劑來源可分為幾大類：自然源、農業(yè)和牲畜、醫(yī)院環(huán)境及傳染病、工業(yè)和其他來源等。生物氣溶膠的自然來源包括植物孢子、細菌和真菌的病原體。農業(yè)氣溶膠與自然氣溶膠融合在一起,如人們在處理干草時吸入的氣溶膠或灰塵,這些氣溶膠或灰塵可能會含有感染嚙齒動物的污物,在農業(yè)生產和谷物存儲過程產生的真菌毒素,也會引發(fā)感染。微小液滴的疾病傳播不僅僅局限在醫(yī)院里,也能通過流感和病毒感染隨處發(fā)生。工業(yè)生產過程和垃圾廢物填埋也是生物氣溶膠的重要來源,氣溶膠的組分有致病微生物、毒素、過敏源及灰塵粒子等。大多數(shù)有毒和不健康氣溶膠接觸融合后會生成新的生物氣溶膠。

生物戰(zhàn)劑除主要用在戰(zhàn)場上外,現(xiàn)在還可能被恐怖分子利用。生物戰(zhàn)劑可被制成干泡沫劑或液態(tài)劑。相較于液態(tài)劑,干劑存儲時間長,施放效率高,準備方便。生物戰(zhàn)劑可通過空氣、水和食物傳播,也可通過與昆蟲和嚙齒動物的接觸而感染。生物戰(zhàn)劑最危險的傳播方式是氣溶膠形態(tài)的傳播?？紤]到診斷的困難程度,疾病潛伏期的不同,大范圍的覆蓋和傳播途徑,生物氣溶膠是生物戰(zhàn)劑最有效的傳播形態(tài)。

生物戰(zhàn)劑/氣溶膠傳播的數(shù)值建模和仿真研究對生物戰(zhàn)劑的探測起著重要作用。在探測識別過程中必須確認微生物的活性,還必須加強對生物背景的了解。生物背景的分類和研究,要從四個方面入手,即它對人類的致病能力,作用頻率,環(huán)境防御能力,以及治療用的抗原抗體等。

3 生物氣溶膠采樣

氣溶膠便于快速、有效地向大面積人群實施生物攻擊,因此相較于皮膚接觸、食品中毒和媒介傳播,氣溶膠形態(tài)是生物戰(zhàn)劑的最佳傳播方式。

大多探測和識別設備連接著一個采樣器。采樣設備可以捕捉液態(tài)或固態(tài)(如瓊脂)的微粒,微粒的形態(tài)影響著下一步的分析方法,如顯微觀察、培養(yǎng)、生物測定、免疫學檢測等[1～2]。影響微生物經采樣恢復的因素有采樣率、采樣時間、粒子類型、尺寸及分布、濃度因子、環(huán)境因子(如渦流風)、探測方法、采樣器選型(與采集和恢復效率,活性損失相關)等。在采樣過程中,生物氣溶膠的活性保持也非常重要。有三種生物氣溶膠的采樣方式：重力裝置、撞擊器和虹吸吸入式采樣器。

重力采樣法為被動式采樣,它利用了覆膜粒子在顯微鏡載(物)片、瓊脂板上的重力下降和慣性過程,由于不能定量和定性測量,這種方法使用受限。采樣效率取決于粒子尺度、空氣渦流、風速等。典型的有文岑茨采樣器、瓦格納采樣器和利思采樣器等。

撞擊采樣器通過使用電扇或旋轉采集表面來加速空氣,它適用于室內生物氣溶膠的采集采樣,如慣性撞擊器、沖擊式采樣器、旋風分離器和離心采樣器等。慣性撞擊器使用一個風扇或虹吸負壓源產生定速風速,并通過濾網來篩選粒子,一般地,粒子沉積到固態(tài)或半固態(tài)表面,粒子采集具有尺度選擇性,典型代表有Sartorius MD8,Samplair MK2、Air ideal、Air samplair以及SAS等。沖擊式撞擊器利用了空氣經過液體(如水、培養(yǎng)液、礦物油等)后的轉變過程,這個過程中,粒子從空氣中轉換成了液相態(tài),系統(tǒng)的不足體現(xiàn)在粒子的通過性、粒子碰撞、彈跳、液體蒸發(fā)及活性損失等方面,典型系統(tǒng)有AGI、SKC的生物采樣儀等。旋風分離器和離心采樣器使用渦流來產生足夠的慣性,以將粒子沉積到采集面上,粒子經攔截后在液態(tài)(旋液)或半固態(tài)媒介(離心機)中重新生成。典型型號有：研究國際的SASS 2300和2400等。

虹吸吸入采樣器包括狹隘采樣器,級聯(lián)撞擊器和過濾組件等。虹吸采樣器通過直接撞擊細菌培養(yǎng)媒介,沖擊液后續(xù)培養(yǎng)或過濾提留液來提取活性粒子,而非活性粒子可利用顯微檢查載物片檢定出來。最初設計的孢子捕捉器用來捕捉真菌孢子和花粉。粒子通常被捕捉到覆膜玻璃載片上或膠帶上,它的優(yōu)點包括非選擇性采樣和采集后直接分析,缺點包括覆膜的掩蔽問題,不能判定活性等。典型系統(tǒng)有Hirst,Burkhard,Air-o-cell,Allergenco等。

4 分子識別技術

聚合酶鏈反應(Polymerase chain reaction,PCR)是重要的分子識別技術之一,主要用于臨床實驗,以便進行微生物的鑒別。PCR可以將單個或幾個DNA片斷拷貝成指數(shù)倍地放大,還可對特定DNA序列建立起數(shù)千個拷貝。典型的PCR通過重復熱、冷循環(huán)工作。由20～40的快速監(jiān)測溫度變化產生了循環(huán)系列,通常由2～3個分離的溫度變化步驟組成。各個循環(huán)參數(shù)的選擇取決于溫度、時間長度,DNA合成所用的酶類型,二階離子濃度,反應dNTP,以及引子的融點溫度(Tm)等因素。

有數(shù)個基于PCR原理的小型手持設備適合于外場使用,它們的主要性能參數(shù),在單次處理樣品數(shù)上有較大差別(HANAA4個,Bio-SeeqTMPlus6個,RAPID8個),而在探測速度和響應速度方面則差異較小。史密斯探測公司生產的Bio-SeeqTMPlus采用了指數(shù)疊加線性聚合酶鏈反應,即LATE-PCRTM技術。艾達荷科技生產的先進加固病原體識別儀RAPID,基于實時熒光PCR(PT-PCR)平臺上打造,它的另一個設備RAZOR則使用了切邊技術,以便于外場使用;勞倫斯利弗莫爾國家實驗在1999年制成的手持式先進核酸分析儀,可以分析生物樣本,并進一步確定特定DNA序列的存在與否[3～6]。

除此之外,還有其他類型的PCR,如變星公司出品的SmartCycler?和GeneXpert系統(tǒng),羅切應用科學出品的COBAS AMPLICORTM分析儀和LightCyclerTM,兩者作為大型系統(tǒng)的組件,可用于移動實驗室。

5 酶聯(lián)免疫吸附測定和生物傳感器/免疫傳感器

酶聯(lián)免疫吸附測定(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)法基于特定抗體和抗原的相互作用,即基于固相載體表面上抗原和樣本內抗原的競爭作用。兩種抗原在抗體上的有限結合位點上相互競爭。樣本內分析的抗原越多,結合到錨定抗原上的抗體越少。去掉自由物質,針對位點抗體,加入標有二次抗體的酶,后續(xù)反應產生可探測信號,用常用顏色標識。

克隆戴格出品的ArrayTube芯片[7～8]集成了微管集成蛋白質芯片和經典夾心-酶聯(lián)免疫吸附測定過程,該過程應用色度著色技術實現(xiàn)了可視化,著色技術采用與目標分子共軛的(辣根過氧化物酶,HRP)分子,而目標分子又被綁定至AT-陣列來催化四甲基苯醌的局部沉淀反應。最終的沉淀模式圖像可用ArrayTube閱讀器來進行探測。

美國海軍研究實驗室出品的Array生物傳感器系統(tǒng)[9]使用了夾心法和CCD相機來探測生物戰(zhàn)劑。在對不同的戰(zhàn)劑使用捕捉抗體和跟蹤抗體后,它可在同一個載玻片上同時探測和識別不同的目標戰(zhàn)劑,其響應快速(10～15分),靈敏度高、選擇性強。

史密斯探測公司出品的生物探測器,在分子設備的輔助下,運用免疫配體測定化學和一個光尋址電位傳感器,可以同時探測多達8個不同生物戰(zhàn)劑。在免疫特定反應期間,生物毒素和熒光標識抗體與抗熒光抗體(共軛酶脲酶)要同時使用。在探測階段,脲酶的酶反應底物(酶作用物)會改變PH值,PH的改變則由LAPS變換器進行探測。該公司出品的靈巧生物傳感器系統(tǒng)采用了8個傳感器陣列,其樣本被存儲起來以備下一步分析。研究國際公司出品的RAPTOR是一個便攜式、自動化的4通道熒光免疫分析系統(tǒng),可以快速探測蛋白質毒素,病毒和細菌[10～11]。研究國際公司和海軍研究實驗室聯(lián)合出品的Analyte 2000,則是一個4通道的單波長熒光計,它運用衰逝波熒光免疫分析技術來探測生化物質。

熒光空氣動力學粒譜儀(Fluorescent aerodynamic particle sizer,FLAPS)對每個粒子進行同步測量,兩個不同波長上的散射光強度及熒光輻射,分別用兩個高靈敏度光電倍增管進行采集。紫外空氣動力學粒譜儀(UV-APS)是FLAPS粒譜儀的一個變種,它運用飛行時間粒徑測量、光散射和紫外熒光強度來對大氣樣本中的生物戰(zhàn)劑進行非定性測量。TSI公司已推出了FLAPS和UVAPS的商業(yè)產品[12～14]。

由海軍研究實驗室出品的單粒子熒光計數(shù)器[15],對粒子受266nm激光激勵后輻射出的紫外熒光強度進行測量。拜拉爾公司出品的VeroTect[16]則結合了空氣動力學粒譜測量技術和粒子熒光譜技術,可以測量粒徑、形狀幾何參數(shù),并利用280nm波長的激勵激光來測量熒光的強度,利用測得的激光誘導熒光和幾何(粒徑、形狀)參數(shù),VeroTect可獲得其他任何設備不能給出的氣溶膠特征。

6 物理技術

6.1 熒光法

熒光法運用了生物材料中的分子熒光特性(通常在紫外區(qū))。受激成分自發(fā)返回到基態(tài)后即會輻射出不同波長的激光。不同設備間的差異主要表現(xiàn)在光源、激發(fā)波長、測量通道數(shù)等參數(shù)方面。

6.2 毛細管電泳技術

毛細管電泳是一種解析技術,它根據離子電泳淌度(遷移率)的不同,采用外加電壓來分離離子。電泳淌度取決于分子電荷、黏性及原子半徑等。由于結果迅速、分辯率高,所以毛細管電泳的使用占了主導地位。典型產品如安捷倫科技出品的2100生物分析儀。毛細管電泳技術必須與其他技術體系的儀器設備(特別是質譜儀)配合使用來探測識別生物戰(zhàn)劑氣溶膠。

6.3 流式細胞儀/測量術

流式細胞儀利用懸浮樣品細胞光學特性的區(qū)別,可以準確區(qū)分并確定它們的數(shù)量。該方法允許生物粒子在穿過激光束時,同步地測量和分析它們的物理化學參數(shù)。激光束穿過粒子后產生了光折射和散射,折射根據折射方向和角度的不同可分為直接散射-前向散射(FSC)和側向散射(SSC)。FSC與粒子體積與相關而SSC則由粒子的內部復雜度決定。與折射一樣,光散射也通過熒光進行測量。與被分析粒子匹配的熒光染料吸收特定波長的光,在另一波長上產生輻射。使用流式細胞光度計時,吸收譜相同,但出射輻射不同。細胞和無細胞結構(細菌、病毒)并不含熒光片段,但它們可以用熒光基材進行標定,熒光基材與細菌、病毒的DNA相綁定。

BioDETECT AS出品的MICROCYTE? Field是一款商業(yè)化的堅固、便攜式流式細胞儀,能在現(xiàn)場對潛在污染源或可疑材料進行探測和確認,對微生物進行分析,數(shù)據結果可使用兩色柱狀圖或二維散點圖來進行數(shù)據來呈現(xiàn)。

6.4 光學遙測技術

激光雷達作為遙測系統(tǒng),用于在將戰(zhàn)劑抵達其他分析設備前進行遠程探測和識別生物戰(zhàn)劑。激光不是用來采樣,而是用于探測。短促激光脈沖在穿過大氣時與路徑上的大氣分子、氣溶膠、云和塵土相互作用后,可以識別遠至30km～50km的粒子,但不能確定粒子的類型,比如,辯明是否是生物戰(zhàn)劑。

總體上,激光雷達系統(tǒng)可以給出云物理信息(尺度、形狀和相對濕度)和空間云位置(距離、寬度、高度、地面高和漂移速度),但不能識別出生物物質的性質。現(xiàn)有激光誘導熒光傳感器包括洛克希德馬丁出品的生物戰(zhàn)劑預警傳感器BAWS[17],SR-biospectra原型傳感器,以及遠距生物遙測探測系統(tǒng)LR-BSDS等。

生物戰(zhàn)劑預警傳感器BAWS是一個局地點式傳感器,只能探測流經傳感器的粒子,因此可被看成是一個近距激光雷達,激光器到被探測生物粒子的距離只有僅僅的幾厘米。類似地,Biospectra也是一個緊湊型的生物威脅探測短距激光雷達。

6.5 光譜法

普羅引擎公司出品的生物預警監(jiān)視器,工作原理采用的是火焰光譜學。采取連續(xù)工作方式,對大氣中的生物粒子(主要是細菌和毒素)的特定化學結構進行搜索分析,當可疑粒子的濃度迅速上升時即迅速報警。它還可以啟動一個生物采樣器來判定所測粒子的病原體特征。2009年,普羅引擎公司和貝汀科技打造了一個原型機,它由三個生物探測系統(tǒng)組成：MAB、空氣病原體探測生物-空氣采樣器和戰(zhàn)地生物辨別器。法國陸軍采購了該型設備用以執(zhí)行海外任務。首次報警后,該系統(tǒng)能給出危險等級報警的時間為20min以內。

橡脊國家實驗和軌道科學公司共同出品的生化質譜儀模塊Ⅱ(CBMS block Ⅱ)[18],配備在偵察車和其他機動平臺上,對生化戰(zhàn)劑進行探測和識別。CBMS block Ⅱ由一個質譜儀模塊、采樣介入模塊、采樣模塊和一個士兵顯示終端組成。該探測系統(tǒng)采用了生物粒子直接采樣和熱(分)解作用等原理。它采用布魯克達爾托尼克斯開發(fā)的軟件平臺bio profiler,運用MALDI-TOF質譜儀內嵌的蛋白質指紋,與數(shù)據庫的峰值列表進行比對,來對微生物組織進行識別。

紫外空氣動力學粒譜儀(UV-APSTM)[14],運用355nm波長紫外光激勵后產生的420nm～757nm散射光,來測量光散射和飛行時間,進而測量出濃度及1μm～20μm區(qū)間的粒徑。

傅里葉變換紅外光譜儀是一個被動光學技術,用于采集固相、液相或氣相態(tài)的紅外吸收譜、發(fā)射譜、光電導性或拉曼散射特性,優(yōu)點是可以在寬光譜范圍內同步采集光譜數(shù)據。實驗數(shù)據表明,采用可靠的識別算法,可以成功辨別背景材料和瓷土塵,其研究成果證明了FTIR探測生物氣溶膠的可行性。

6.6 集成探測系統(tǒng)

集成探測系統(tǒng)通常由幾個分系統(tǒng)組成。探測分系統(tǒng)響應速度快,可連接監(jiān)測生物戰(zhàn)劑粒子群的濃度廓線和結構。測量廓線的顯著變化標明了生物戰(zhàn)劑的存在,可立即啟動報警或其他措施,啟動采樣設備進行性質判定等。

勞倫斯利弗莫爾國家實驗室出品的biobriefcase[19]是一個集成、小型化氣溶膠采集與分析系統(tǒng),由三個部件組成：氣溶膠采集模塊、PCR模塊和免疫測量分析模塊。該探測器采用了毛細管電泳技術,PCR模塊自動進行DNA提純、濃縮和放大等步驟。系統(tǒng)可以連續(xù)30天不間斷工作,因此可以用作被動監(jiān)測手段。

間歇式生物戰(zhàn)劑探測系統(tǒng)(IBAD)[20]是一個簡易半自動駐點式探測系統(tǒng),用在船(艦)載平臺,由粒子計數(shù)器、粒子濕度旋風采樣器和一個人工手持式免疫色譜檢測鑒別器組成。

生物集成探測系統(tǒng)(BIDS)由五個子系統(tǒng)構成： 1) 車載平臺; 2) 防護裝置; 3) 輔助設備; 4) 電力供應; 5) 生物探測部件。測試設備包括TSI公司的高容積空氣動力學粒度儀HVAPS、流體采集器、生物采樣器或單液滴樣本采集器、犁刀公司的流式細胞儀、分子設備公司的閾值工作站、生物探測器和質譜儀等。生物集成探測系統(tǒng)集成了空氣動力粒徑測量、發(fā)光、熒光、流式細胞測量、質譜測量和免疫測定技術等,并以多等級、多層級結構增強了探測可靠性。理論上,它可探測所有類型的生物戰(zhàn)劑,并對特定戰(zhàn)劑進行甄別和鑒別[15]。

聯(lián)合生物點式探測系統(tǒng)JBPDS是一個全自動的生物探測和識別裝備,它可以集成到車載、船艦或拖車等不同的平臺中,也可以獨立部署。它由探測器、采集器、流體控制子系統(tǒng)和鑒別器組成。鑒別器含有針對特定生物戰(zhàn)劑抗原的抗體。JBPDS采集到和保存的樣本為下一步的確認分析提供了基礎。

加拿大通用動力出品的4WARN關鍵點生物探測系統(tǒng),是一個第三代全自動生物戰(zhàn)劑探測和識別系統(tǒng),它設計靈活,允許用戶根據任務的不同,車載/海上平臺的不同,對其組件進行任意組合。該系統(tǒng)使用了熒光粒子探測和生物實時傳感器技術。針對特定戰(zhàn)劑的探測則使用抗體測定條及其自動閱讀器,或多位點聚合酶鏈反應。系統(tǒng)與液體采樣采集模塊、一塊電池和一個處理器控制單元相互耦合在一起。

勞倫斯利弗莫爾國家實驗室出品的自動化病原體探測系統(tǒng)APDS[21～22],用于對大氣中的病原體和毒素進行連續(xù)采樣?？梢詿o人值守工作一星期。APDS使用被抗體包裹住的小珠來進行探測,其中抗體針對特定的目標。它由一個氣溶膠采集器、一個樣本準備子系統(tǒng)和兩個探測分析子系統(tǒng),一個運用了PCR原理,另一個采用了流式細胞測量原理,并使用抗體來識別病原體。

研究國際出品的biohawk[23],是一個集成了一個氣溶膠采集器的便攜式8通道生物測定系統(tǒng),它利用一個信用卡大小的塑料檢定切片來進行生物測定,在切片內,存放了全部確定目標試劑。

7 結語

本文對生物戰(zhàn)劑和生物氣溶膠的探測和識別原理方法和設備現(xiàn)狀進行了梳理。多家公司出品的設備已經運行在一些潛在的危險地點,如機場、地鐵、體育場、政府大樓和半封閉設施等。部分集成探測系統(tǒng)和光學設備可用于軍事用途,一些設備目前只能用在實驗室,或進行快速掃描測試(如手持式系統(tǒng))。各探測系統(tǒng)信息及其相關應用可在所屬網站上查詢。

生物戰(zhàn)劑探測的趨勢是更高效、操作更方便、小型化和簡便化。除手持設備外,其他設備需要對操作人員進行特殊培訓,如大型復雜系統(tǒng)4WARN。對樣本的探測識別,如采樣、濃度演算、性質判定等目前所需時間較長。

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Detection and Identification System of Biological Aerosols

YANG Hui ZONG Junjun XUE Xiangfeng HOU Zhibin

(Army Officer Academy, Hefei 230031)

Easy and inexpensive manufacturing of biological weapons, complicated detection, expensive protection, difficult treating of affected individuals, selective impact only for people, animals or plants, are all factors making an effective defense against biological warfare agents. The aim of this study is to introduce the systems for the detection and identification of biological aerosols containing dangerous bioagents. The basic techniques used for detection and identification of bioagents are described, including physical, molecular, immunochemical, and other ligand assays. Measuring systems and equipment for the individual techniques are summarized.

biological warfare agents, biological aerosols, detection, identification

2014年7月5日,

2014年8月25日 基金項目:國家自然科學基金項目(編號:41375026)資助。

楊輝,男,博士,副教授,研究方向:激光雷達研制和大氣環(huán)境監(jiān)測、光電子技術、嵌入式系統(tǒng)、移動計算等。

E835.8

10.3969/j.issn1672-9730.2015.01.005