張 楠，邸明偉

（東北林業(yè)大學(xué)，生物質(zhì)材料科學(xué)與技術(shù)教育部重點實驗室，黑龍江 哈爾濱 150040）

pH值對漆酶活化玉米秸稈木質(zhì)素的影響

張 楠，邸明偉

（東北林業(yè)大學(xué)，生物質(zhì)材料科學(xué)與技術(shù)教育部重點實驗室，黑龍江 哈爾濱 150040）

采用漆酶在不同pH條件下對玉米秸稈木質(zhì)素進(jìn)行活化處理，利用FT-IR、紫外分光光度計、GPC、TG等分析方法研究了pH值對漆酶活化木質(zhì)素的影響。結(jié)果表明，漆酶會使玉米秸稈木質(zhì)素發(fā)生脫甲基作用，使得酚羥基含量增加，pH為4.0時活化效果最好。漆酶對玉米秸稈木質(zhì)素既有解聚作用又有聚合作用，pH值較高時綜合表現(xiàn)為解聚作用，pH值較低時則表現(xiàn)為聚合作用。

玉米秸稈木質(zhì)素；活化；漆酶；pH值

1 前言

目前以植物纖維為原料的產(chǎn)業(yè)，如制漿造紙、木材水解、生物質(zhì)煉制、生物質(zhì)能源等，木質(zhì)素基本上都作為廢棄物排出[1，2]，若能開發(fā)利用，可制備生物基高分子材料或者膠粘劑。同時木質(zhì)素本身具有甲氧基、酚羥基、羰基、羧基和醚鍵等多種官能團(tuán)和化學(xué)鍵[3，4]，具有很高的利用和改性價值。然而，工業(yè)生產(chǎn)中產(chǎn)生的木質(zhì)素分子質(zhì)量大、活性較低，使其應(yīng)用領(lǐng)域受到限制，因此對木質(zhì)素進(jìn)行降解活化具有重要的實際意義。木質(zhì)素的降解活化方法有化學(xué)法[5～8]，如加氫還原法、催化氧化法、電化學(xué)法等，還有近年來大量學(xué)者關(guān)注的生物降解方法[9，10]，其中采用漆酶對木質(zhì)素進(jìn)行活化降解是關(guān)注的熱點之一[11～17]。目前相關(guān)漆酶活化木質(zhì)素的研究主要針對水溶性的木質(zhì)素產(chǎn)品，而對玉米秸稈生物煉制的非水溶性木質(zhì)素副產(chǎn)品鮮有涉及，而這類木質(zhì)素副產(chǎn)物由于非水溶性以及高純性，更適合用于膠粘劑的合成與改性。本文即針對這類木質(zhì)素，利用漆酶在不同pH值下對其進(jìn)行活化處理，采用FT-IR、紫外分光光度計、GPC、TG等分析方法研究了酸堿度對漆酶活化處理木質(zhì)素的影響。

2 實驗部分

2.1 實驗材料

玉米秸稈木質(zhì)素，松原來禾化學(xué)有限公司；漆酶，無錫金坤生物科技有限公司，酶活力為3 000 UI/g；冰醋酸、二氧六環(huán)、磷酸二氫鉀、氫氧化鈉、四氫呋喃等試劑均為分析純。

2.2 實驗方法與分析測試

2.2.1 漆酶活化處理木質(zhì)素

將木質(zhì)素置于50 ℃真空干燥箱內(nèi)干燥24 h后備用。將粉體漆酶以蒸餾水為溶劑配成酶活力為20 UI/mL的酶溶液。稱取一定量的木質(zhì)素，溶于二氧六環(huán)和水的混合溶劑中，加入一定量的漆酶后，用冰醋酸調(diào)節(jié)pH值，反應(yīng)溫度設(shè)定為50 ℃。分別在不同pH值（5.5，5.0，4.5，4.0，3.5）下反應(yīng)3 h，反應(yīng)期間持續(xù)通氧。反應(yīng)結(jié)束后，向反應(yīng)液中加入蒸餾水析出木質(zhì)素，抽濾，之后將濾餅置于沸水中使殘余漆酶失活，再次抽濾，干燥后備用。

2.2.2 分析測試

采用美國尼高力（Nicolet）公司的Magna-IR560型傅立葉變換紅外光譜儀對樣品進(jìn)行衰減全反射紅外光譜分析，掃描范圍4 000～650 cm-1，分辨率4 cm-1，環(huán)境氣氛為空氣。根據(jù)文獻(xiàn)[18]的方法測定酚羥基含量：取每種樣品15 mg左右，溶于10 mL二氧六環(huán)，然后依次取2 mL溶液3份，分別用pH=6的KH2PO4和NaOH的緩沖溶液、pH=12的H3BO3和NaOH的緩沖溶液、濃度為0.2 mol/L的NaOH溶液定容為50 mL，采用北京普析通用儀器有限責(zé)任公司的T6新世紀(jì)紫外可見分光光度計，測定各樣品溶液在波長300 nm與360 nm處的吸光度。采用美國安捷倫公司的Agilent1100GPC液相色譜儀進(jìn)行木質(zhì)素分子質(zhì)量測定[19]，檢測條件：G1315B紫外檢測器，標(biāo)樣為聚苯乙烯（PS），流動相：四氫呋喃。色譜分析條件：79911GP-101+79911GP-104型號雙柱串聯(lián)；流速1.0 mL/min，進(jìn)樣量50μL；柱溫30 ℃；柱壓2.9 MPa。采用德國NETZSCH公司的TG209F3熱重分析儀對樣品進(jìn)行熱重分析，掃描溫度范圍30～800 ℃，升溫速率10 K/min，氣氛為空氣，氣體流速50 mL/min。

3 結(jié)果與討論

3.1 紅外分析

未處理以及不同pH值下漆酶處理木質(zhì)素的紅外譜圖如圖1所示。從圖1可以看出，與未處理木質(zhì)素相比，漆酶活化處理后的木質(zhì)素沒有發(fā)生官能團(tuán)的消失或增加，只是一些官能團(tuán)的含量出現(xiàn)了變化。1 596 cm-1、1 510 cm-1和1 426 cm-1處均出現(xiàn)較強(qiáng)烈的苯環(huán)吸收峰，屬于木質(zhì)素芳香環(huán)的骨架振動吸收。漆酶沒有破壞木質(zhì)素的芳香環(huán)結(jié)構(gòu)，處理過程中的反應(yīng)主要發(fā)生在側(cè)鏈和苯環(huán)的活性官能團(tuán)上，因而選取1 510 cm-1處苯環(huán)吸收峰作為內(nèi)標(biāo)峰，分別計算木質(zhì)素其他特征吸收峰與內(nèi)標(biāo)峰的峰面積比值，結(jié)果列于表1。

圖1 未處理木質(zhì)素以及不同pH下漆酶處理木質(zhì)素的紅外譜圖Fig.1 FT-IR spectra of lignin untreated（0） and treated（1～5） with laccase at different pH value

從表1可以看出，經(jīng)漆酶處理后，由O-H的伸縮振動吸收引起的3 300 cm-1吸收峰增加，表明羥基含量增大，且隨著pH值的降低，羥基含量增加，但效果不明顯；當(dāng)pH達(dá)到3.5時，羥基含量增加程度減弱；2 920 cm-1處甲基、亞甲基、次甲基的 C-H吸收峰減弱，表明處理后，木質(zhì)素發(fā)生一定降解，化學(xué)鍵斷裂，生成小分子木質(zhì)素；2 854 cm-1處甲氧基特征峰吸收減弱，表明漆酶處理具有一定的脫甲氧基作用，木質(zhì)素發(fā)生一定的解聚。對比可知，pH值在4.0左右時，漆酶對木質(zhì)素的活化作用效果較好。1 120 cm-1、1 329 cm-1附近紫丁香基結(jié)構(gòu)單元的特征峰和 1 256 cm-1處愈創(chuàng)木基的譜峰吸收減弱，進(jìn)一步證明了漆酶對木質(zhì)素有一定的降解作用。1 030 cm-1處醚鍵C-O略有上升，表明漆酶在對木質(zhì)素活化的過程中，不僅存在解聚降解作用，同時還存在聚合作用，即漆酶會使木質(zhì)素大分子產(chǎn)生一些小分子自由基，這些小分子可能相互結(jié)合，也可能與大分子木質(zhì)素結(jié)合。

表1 木質(zhì)素的吸收峰與內(nèi)標(biāo)峰1 510 cm-1的峰面積比值Tab.1 Area ratio of characteristic peaks and reference peak at 1510 cm-1for lignin

3.2 紫外分析

表2列出了不同pH值下漆酶活化處理后木質(zhì)素的羥基含量。由表2可以看出，經(jīng)漆酶活化處理后，木質(zhì)素的總羥基含量增加，并且隨著pH值的降低，羥基含量先增加后降低。處理過程中木質(zhì)素脫甲氧基產(chǎn)生部分酚羥基，醚鍵形式存在下的酚羥基由于醚鍵的斷裂出現(xiàn)新的酚羥基，但部分酚羥基可能再次與其他木質(zhì)素分子以醚鍵結(jié)合，造成羥基含量下降，這進(jìn)一步印證了紅外光譜的分析結(jié)果。

3.3 GPC分析

通過測定一組分子質(zhì)量不等的聚苯乙烯標(biāo)準(zhǔn)樣品的淋出時間與分子質(zhì)量的數(shù)據(jù)，進(jìn)行作圖、擬合，得到擬合曲線與擬合方程，擬合方程為：Lg（M）=10.60098-0.50533t。由此計算木質(zhì)素的分子質(zhì)量，如圖2和表3所示。

表2 不同pH值下漆酶活化木質(zhì)素的羥基含量Tab.2 Content of phenolic hydroxyl group of lignin treated with laccase at different pH values

圖2 未處理以及漆酶活化處理木質(zhì)素的分子質(zhì)量分布譜圖Fig.2 Molecular weight distributions of lignin untreated and treated with laccase

表3 未處理以及漆酶活化處理木質(zhì)素的分子質(zhì)量統(tǒng)計Tab.3 Statistics of molecular weight of lignin untreated and treated with laccase

表3可以看出，經(jīng)漆酶處理后，木質(zhì)素的分子質(zhì)量既有降低又有升高。數(shù)均分子質(zhì)量隨著pH值的降低先降低后增加；重均分子質(zhì)量在pH=5.5時表現(xiàn)為降低，然后隨著pH的降低開始升高。圖2也表明，經(jīng)過漆酶處理后，分子質(zhì)量在A點處的數(shù)量出現(xiàn)了減少，3號譜線（pH=4.5）的峰高降低，分子質(zhì)量在C點處的數(shù)量明顯減少，分子質(zhì)量在B點處的數(shù)量略有增加。分析認(rèn)為，漆酶對木質(zhì)素既有解聚作用又有聚合作用，漆酶會使木質(zhì)素分子內(nèi)的一些聯(lián)接鍵斷裂，發(fā)生脫羧、脫甲基的作用，使木質(zhì)素分子質(zhì)量降低，并產(chǎn)生小分子片段。C處減少較明顯可能是由于漆酶優(yōu)先作用于較小的木質(zhì)素分子，使小分子木質(zhì)素降解，其中一部分分散到D區(qū)域，另一部分會與大分子木質(zhì)素聚合，導(dǎo)致在分子質(zhì)量更高的B點出現(xiàn)峰。對比pH=4.5、4.0、3.5時的羥基含量和重均分子質(zhì)量，可以認(rèn)為，漆酶的氧化作用使木質(zhì)素發(fā)生脫甲基作用，引起酚羥基含量增大；同時，漆酶可氧化酚羥基變成苯氧自由基[20,21]，進(jìn)行非選擇性交聯(lián)使得分子質(zhì)量增大，導(dǎo)致多分散性增大[22]。漆酶催化氧化過程是其內(nèi)部活性中心銅離子和底物之間電子傳遞的復(fù)雜過程，這個過程中底物將轉(zhuǎn)化為酚氧自由基中間體，形成的自由基中間體很不穩(wěn)定，能夠進(jìn)一步發(fā)生解聚或聚合反應(yīng)[23]。不同pH值的環(huán)境下，漆酶表現(xiàn)活性不同，產(chǎn)生的自由基數(shù)目也不一樣。pH較高（5.5）時，漆酶對木質(zhì)素的降解作用占優(yōu)，此環(huán)境下更多的自由基相互結(jié)合為小分子，只有少部分結(jié)合到大分子木質(zhì)素上。而隨著pH值的降低，漆酶對木質(zhì)素的聚合作用開始增加，當(dāng)pH達(dá)到3.5時，主要表現(xiàn)為漆酶對木質(zhì)素的聚合作用。漆酶與木質(zhì)素的作用過程復(fù)雜，上述分析只是推測，實際的反應(yīng)機(jī)理還需結(jié)合其他分析進(jìn)一步驗證。值得注意的是，由于所用木質(zhì)素種類、來源以及分析測試的影響，本文所得分子質(zhì)量數(shù)據(jù)的數(shù)量級與其他文獻(xiàn)報道的不盡相同。

3.4 TG分析

未處理木質(zhì)素以及不同pH值下漆酶活化處理的木質(zhì)素的TG分析結(jié)果如圖3和表4所示。從表4可以看出，經(jīng)過漆酶處理后，樣品的起始分解溫度降低，證實木質(zhì)素發(fā)生部分降解，生成了小分子木質(zhì)素，使木質(zhì)素整體在低溫區(qū)域的熱穩(wěn)定性下降。經(jīng)過漆酶處理后，終止點溫度出現(xiàn)上升，證明漆酶對木質(zhì)素也有聚合作用，有更大分子質(zhì)量的木質(zhì)素生成，這與GPC測試結(jié)果相符。拐點溫度上升，說明經(jīng)過漆酶處理后，木質(zhì)素的分子質(zhì)量集中區(qū)域向高分子質(zhì)量區(qū)域移動。隨著pH值的降低，漆酶的活性相應(yīng)提高，漆酶使部分木質(zhì)素降解，產(chǎn)生小分子片段與自由基，而自由基大部分會與大分子的木質(zhì)素相結(jié)合，生成更大分子質(zhì)量的木質(zhì)素。

圖3 未處理木質(zhì)素和漆酶處理木質(zhì)素的TGA曲線和DTG曲線Fig.3 TGA and DTG curves of lignin untreated and treated with laccase

表4 未處理木質(zhì)素和漆酶處理木質(zhì)素的熱重曲線數(shù)據(jù)統(tǒng)計Tab.4 Statistics of thermogravimetric curves of ligninuntreated and treated with laccase

4 結(jié)論

漆酶作用于玉米秸稈木質(zhì)素，可以使木質(zhì)素發(fā)生脫甲基作用，酚羥基含量增加，進(jìn)而提高木質(zhì)素的反應(yīng)活性。但較低的pH環(huán)境又會使漆酶催化氧化更多酚羥基，造成酚羥基的消耗，綜合考慮pH值為4.0左右活化處理效果較好。漆酶處理玉米秸稈木質(zhì)素的過程中發(fā)生連接鍵斷裂，伴隨著解聚反應(yīng)，生成小分子木質(zhì)素；同時漆酶又會氧化酚羥基變成苯氧自由基，發(fā)生隨機(jī)聚合現(xiàn)象，生成更大分子質(zhì)量的木質(zhì)素。pH值較高的處理條件下表現(xiàn)為解聚作用，而pH值較低時則表現(xiàn)為聚合作用。

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Effect of pH value on properties of corn stalk lignin treated with laccase

ZHANG Nan, DI Ming-wei
(Key Laboratory of Bio-Based Material Science & Technology (Ministry of Education), Northeast Forestry University, Harbin, Heilongjiang 150040, China)

The activating treatment of corn stalk lignin with laccase was carried out at different pH value, and the effect of pH value on the properties of corn stalk lignin treated with laccase was studied by Fourier transform infrared spectroscopy(FTIR), ultraviolet spectrophotometer, gel permeation chromatography(GPC) and thermal gravimetric analyzer(TGA). The results showed that the demethylation of corn stalk lignin occurred during the treating with laccase and the total phenolic hydroxyl group content of the treated lignin increased. The preferred pH value was chosen as 4.0. Both the depolymerization and the polymerization were presented during the treating of lignin with laccase. The depolymerization of lignin was main reaction for activating with laccase at higher pH value, and the polymerization of lignin was predominant at lower pH value.

corn stalk lignin; activation; laccase; pH value

O636.2

A

1001-5922（2015）06-0042-05

2015-03-10

張楠（1990-），男，在讀碩士研究生。

邸明偉（1972-），男，教授，博導(dǎo)，主要研究方向為生物質(zhì)復(fù)合材料及膠粘劑。E-mail：dimingwei@126.com。

國家林業(yè)公益性行業(yè)科研專項（20150452）、黑龍江省科學(xué)基金資助項目（C201335）、黑龍江省哈爾濱市科技創(chuàng)新人才研究專項資金項目（2014RFXXJ066）。