劉 丹，夏 雪，吳益梅，辜金花，田玉肖，孫 勃

（四川農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，四川雅安 625014）

植物染色體制片效果影響因素的解析

劉 丹，夏 雪，吳益梅，辜金花，田玉肖，孫 勃*

（四川農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，四川雅安 625014）

高質(zhì)量的染色體制片是后續(xù)研究工作的基礎(chǔ)，在實(shí)際操作中要獲得理想的制片并不容易。本文綜述取材時間與根尖長度、預(yù)處理、解離、染液的選擇和制片方法等5項(xiàng)壓片法中影響植物染色體制片效果的主要因素，其中預(yù)處理為關(guān)鍵環(huán)節(jié)。

植物；染色體；制片；影響因素；壓片法

植物染色體制片技術(shù)是遺傳學(xué)經(jīng)典實(shí)驗(yàn)之一，也是從事細(xì)胞學(xué)研究的一項(xiàng)基本實(shí)驗(yàn)技能。該項(xiàng)技術(shù)是進(jìn)行染色體計數(shù)、核型分析和原位雜交等研究的基礎(chǔ)，廣泛地應(yīng)用于植物倍性鑒定、植物分類與親緣關(guān)系研究，在植物遺傳育種中具有重要作用［1］。高質(zhì)量的染色體制片是保證核型分析和原位雜交等后續(xù)工作順利進(jìn)行的首要條件［2］。一張好的制片，首先應(yīng)具有較多的分裂相，特別是中期分裂相；其次應(yīng)具有較好的制片效果，具體表現(xiàn)為染色體分散性好，收縮適中，形態(tài)良好，著絲粒清晰可見等。

常用的染色體制片方法包括壓片法和去壁低滲法［2］，與去壁低滲法相比，壓片法步驟較少，操作簡便，時間快速，節(jié)省材料，容易掌握，效果也較好，在植物特別是農(nóng)作物和園藝作物的染色體制片中被廣泛使用［3-7］；而去壁低滲法則多用于動物和染色體數(shù)目多而小的植物中。壓片法的基本步驟包括取材、預(yù)處理、固定、保存、解離、染色制片和鏡檢觀察。雖然壓片法制備染色體技術(shù)并不復(fù)雜，但在實(shí)際操作中要獲得理想的制片并不容易，主要原因是不同物種最優(yōu)的處理?xiàng)l件往往存在明顯差異。近年來關(guān)于各類植物染色體制片的報道已有很多（表1），但對影響制片效果因素的系統(tǒng)探討與分析卻鮮有報道。結(jié)合已有文獻(xiàn)和作者的研究結(jié)果，本文將著重解析壓片法中影響植物染色體制片效果的各項(xiàng)關(guān)鍵因素，以期為植物染色體制片提供參考。

1 取材時間與根尖長度

高等植物有絲分裂主要發(fā)生在根尖、莖尖生長點(diǎn)和幼葉等的分生組織，理論上所有發(fā)生有絲分裂的組織、愈傷組織和細(xì)胞懸浮液等均可用于染色體的制備，但實(shí)際操作中染色體制片常用根尖作為材料，通常只有根尖不易獲得時才會選取莖尖或幼葉等組織。其主要原因如下，根尖的分生組織有絲分裂旺盛且細(xì)胞壁薄，如葡萄根尖有絲分裂中期的細(xì)胞數(shù)目顯著高于卷須、莖尖和幼葉組織［8-16］；與莖尖等其他分生組織相比，根尖取材容易，操作和鑒定簡便；在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)可在可控環(huán)境條件下采用種子萌發(fā)的形式獲得大量的新鮮幼嫩根尖，不受生長季節(jié)和外界環(huán)境的影響和限制；對于一些稀少珍貴的材料，取用根尖對材料的傷害要遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于取用莖尖等組織；另外，絕大多數(shù)的植物在剪取根尖后仍可繼續(xù)正常生長，并不斷萌發(fā)新根，因此不會影響后續(xù)研究［1］。

制片要獲得較多的分裂相，需要保證植物細(xì)胞處于旺盛的有絲分裂期，因此取材時間就顯得非常關(guān)鍵（表1）。一天中植物分裂旺盛期一般出現(xiàn)在8：00—11：00，但不同物種的細(xì)胞分裂期長短及分裂旺盛的時間點(diǎn)存在一定差異。如黃瓜取材時間在8：40—9：10，中期分裂相較多，制片成功率也較高［3］；而同為瓜類的甜瓜根尖則在8：00左右為最佳取樣時期［4］。筆者所在課題組對黃花芥藍(lán)的取材時間進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，9：00左右效果最好。同時需要注意的是，并不是所有物種都適合在上午取材，如天南星科植物白掌和觀音蓮12：00—14：00取材時分裂相細(xì)胞較多，而8：00—10：00分裂相細(xì)胞較少，這與大多數(shù)植物的常規(guī)取材時間有所不同［10］。另一方面，根尖長度對分裂相的多少也有明顯影響。研究表明，春石斛組培苗根尖長度為10 mm時中期分裂相較多［11］；青花菜的根尖長度在13～15 mm時，中期分裂相數(shù)量最多［5］；不結(jié)球白菜的根尖長度為10～20 mm時，獲得的分裂相比例最多［6］。因此，在進(jìn)行植物制片條件優(yōu)化時，可參考這些時間點(diǎn)嘗試從8：00—11：00設(shè)置梯度以求最快找到最佳取材時間點(diǎn)，同時控制根尖長度為10～20 mm，以便獲取更多的中期分裂相，制出成功的染色體制片。

表1 不同植物染色體制片影響因素及最佳條件

2 預(yù)處理

預(yù)處理的主要目的就是通過阻斷、抑制和破壞紡錘絲的形成使細(xì)胞分裂停滯在中期，進(jìn)而獲得更多的中期分裂相細(xì)胞；同時預(yù)處理還能改變細(xì)胞質(zhì)的黏度，促使染色體分散和收縮，以便于壓片和觀察。因此，預(yù)處理是染色體制片中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。常用的預(yù)處理方法有物理法、化學(xué)法和混合處理法［1］。

預(yù)處理對制片效果的影響主要表現(xiàn)在處理試劑和處理時間兩方面。常用的預(yù)處理試劑包括冰水、對二氯苯、8-羥基喹啉、秋水仙素、α-溴萘及混合試劑組合。有研究表明，對二氯苯處理染色體分散較好［14］；8-羥基喹啉處理能使染色體及縊痕和次縊痕清晰，顯示效果良好，適合染色體較大的植物［14］；秋水仙素處理能高效積累中期分裂相，通常效果較好［8］；α-溴萘適用于禾本科植物（如玉米）和水生植物材料［13］；但以上結(jié)論在不同植物中可能會有所不同［5］。當(dāng)單一試劑效果不佳時，可考慮采用不同預(yù)處理劑的組合。如百里香染色體制片中以0.04%秋水仙素和0.002 mol·L-18-羥基喹啉等體積混合溶液預(yù)處理根尖2～3 h，累積的中期分裂相最多［8］；木薯根尖采用α-溴萘與飽和對二氯苯的混合液預(yù)處理效果最好［12］，均優(yōu)于單一試劑處理。處理時間方面，筆者所在課題組以黃花芥藍(lán)為材料進(jìn)行了研究，結(jié)果表明，預(yù)處理時間不夠會導(dǎo)致染色體聚縮程度不到位，染色體拖尾，呈小蝌蚪狀且邊緣不整齊（圖1中A），這樣的染色體很難進(jìn)行核型分析等后續(xù)研究；而預(yù)處理時間過長，則導(dǎo)致染色體聚縮過度呈現(xiàn)豆?fàn)罨螯c(diǎn)狀，形態(tài)不佳，且無法識別著絲粒位置（圖1中B），不利于后續(xù)分析，而條件合適的染色體無論聚縮程度還是形態(tài)均較理想（圖1中E），類似的結(jié)果在油菜、水稻和芝麻等植物上也被報道［17］。同時還應(yīng)注意的是，不同預(yù)處理試劑對應(yīng)的處理濃度和處理時間也不盡相同。如8-羥基喹啉的濃度多為0.002 mol·L-1，秋水仙素一般為0.01%～0.10%，而對二氯苯則為飽和狀態(tài)。處理時間方面，洋蔥以冰水處理，一般需處理2～3 d［18］，而在飽和對二氯苯溶液中的預(yù)處理只需3 h［15］?？傊?，不同植物適用的預(yù)處理試劑和時間具有一定差異，需根據(jù)具體情況進(jìn)行選取。

3 解離

解離的目的在于軟化和分解細(xì)胞壁，使細(xì)胞間易于分離；同時解離還可以清除部分細(xì)胞質(zhì)，使細(xì)胞質(zhì)背景近于透明化，便于染色體的觀察［1］。常用的解離方法包括酸解法和酶解法。酸解法步驟簡便，容易掌握，經(jīng)過酸解和壓片后，根尖分生組織多呈現(xiàn)單細(xì)胞狀態(tài)，但分裂細(xì)胞的染色體仍包裹在細(xì)胞壁中。因此，酸解法廣泛應(yīng)用于染色體計數(shù)、核型分析和染色體畸變的觀察與分析。酶解法使用纖維素酶和果膠酶，經(jīng)過酶解和壓片后，分生細(xì)胞的原生質(zhì)體從細(xì)胞壁中脫離出來，使得染色體周圍不帶細(xì)胞質(zhì)或僅有少量細(xì)胞質(zhì)，從而得到細(xì)胞背景干凈、染色體分散較好的制片，該方法適合染色體數(shù)目多、形態(tài)小的植物［2］，如部分果樹染色體。因此，酸解法常用于染色體顯帶技術(shù)或姊妹染色單體交換研究［1］。

在實(shí)際操作中，酸解法通常采用1 mol·L-1的鹽酸在60℃下解離若干分鐘，解離時間的長短因物種不同而有所差別。解離時間過短，會導(dǎo)致細(xì)胞壁不夠軟化，細(xì)胞不容易分散，并且染色體和細(xì)胞質(zhì)均被明顯染色，不易區(qū)分；若解離時間過長，染色體和細(xì)胞質(zhì)的著色都變得困難，且分辨度模糊［8］，筆者對黃花芥藍(lán)解離時間優(yōu)化的結(jié)果也驗(yàn)證了這些結(jié)論（圖1中C，D，E）。針對特定物種的制片條件進(jìn)行優(yōu)化時，酸解法和酶解法還可結(jié)合使用。如燕麥屬牧草先用1 mol·L-1的鹽酸在60℃下酸解10 min，再用20 g·L-1的纖維素酶溶液在25℃下酶解處理20 min，染色體即分散良好且沒有細(xì)胞壁覆蓋，制片效果清晰可見［14］。

圖1 不同預(yù)處理時間和解離時間對芥藍(lán)染色體的影響

4 染液選擇

在光學(xué)顯微鏡下對染色體形態(tài)和結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀察時，須先對根尖材料進(jìn)行染色，通常采用染色體染色效果好而細(xì)胞質(zhì)著色少的染液?？捎糜谥参锶旧w制片的染液種類較多，如改良卡寶品紅、醋酸洋紅、醋酸地衣紅、鐵礬-蘇木精和孚爾根試劑等，不同染液的特點(diǎn)也不盡相同。通常改良卡寶品紅染液適合大多數(shù)植物的染色，且僅使染色體著色而細(xì)胞質(zhì)幾乎不著色，進(jìn)而提高染色體與背景的對比度。而1%醋酸洋紅染液只作臨時鏡檢觀察。田秋元等［15］發(fā)現(xiàn)，采用醋酸洋紅對洋蔥根尖細(xì)胞染色制片時，細(xì)胞質(zhì)和染色體對比度小，且染色體模糊不清，不能用于核型分析，而用卡寶品紅染液染色的制片則效果良好。醋酸地衣紅易溶于乙醇，因此操作時需先將70%乙醇保存的材料充分洗凈后再浸入45%冰乙酸溶液中進(jìn)行染色。經(jīng)過鐵礬-蘇木精染色后，染色體能染為深藍(lán)色，而且細(xì)胞壁和細(xì)胞質(zhì)也均能一定程度地著色，染色體在壓片后容易分散但較為堅(jiān)硬，因此必須用45%冰乙酸溶液處理，以使細(xì)胞質(zhì)褪色，染色體變軟，這種染液染色深、反差大、分色清晰，利于制片標(biāo)本的長期保存。孚爾根試劑僅對細(xì)胞核和染色體中的DNA顯色，且顏色均一清晰，細(xì)胞軟化效果好，但壓片時較長的染色體容易相互纏繞且不易分散。使用孚爾根試劑染色時需注意必須采用酸解法進(jìn)行解離，且前處理要求較高，解離時間過長，會導(dǎo)致染色效果消退，消退程度與固定液種類有關(guān)，一般認(rèn)為采用FAA固定液效果要優(yōu)于常用的卡諾固定液。因此，在具體操作中研究人員需根據(jù)試驗(yàn)需求選取合適的染液［1］。

5 制片方法

常用的制片方法包括敲片法、壓片法、涂布法、玻棒搟片法、醋酸烘烤壓片法等［7，19］。制片中出現(xiàn)的常見問題有染色體不夠分散存在重疊；染色體不在同一平面；背景中有較多雜質(zhì)；染色不均勻；制片中出現(xiàn)較多氣泡等等。這些問題均可通過不斷練習(xí)制片方法來解決。其中，敲片法是最傳統(tǒng)的方法，適用性廣，一般不會在操作過程中產(chǎn)生氣泡，但操作時間較長；在酒精燈上烘烤可以加深染色，但烘烤過程中溫度過高會產(chǎn)生很多雜質(zhì)，因此烤片時要注意受熱均勻且時間不宜過長；同時，幾種方法可疊加使用。在操作中還需注意，無論采用哪種制片方法，都不要使蓋玻片被搓動，以便使材料分散壓平，便于觀察。在平時的實(shí)驗(yàn)操作中需要反復(fù)練習(xí)，這樣才能較好地掌握制片技術(shù)，獲得理想的效果。

綜上可知，影響制片優(yōu)劣的主要因素中預(yù)處理是關(guān)鍵環(huán)節(jié)。染色體制片的目標(biāo)就是獲得高質(zhì)量的制片，為后續(xù)的核型分析和原位雜交等研究提供先決條件。不同植物染色體制片的各項(xiàng)關(guān)鍵因素最佳參數(shù)各異，因此，在正式開始研究前，需針對以上各因素進(jìn)行染色體制片的條件優(yōu)化試驗(yàn)，從而獲得針對目標(biāo)植物最優(yōu)且穩(wěn)定的制片條件，以便后續(xù)研究可以正常有序地開展。同時，染色體制片中還存在耗時過長和部分預(yù)處理試劑毒性較大的問題，如何縮短實(shí)驗(yàn)時間及篩選無毒或低毒的預(yù)處理試劑也是未來制片技術(shù)發(fā)展的重要方向。

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（責(zé)任編輯：張瑞麟）

S 184

：A

：0528-9017（2015）10-1654-04

文獻(xiàn)著錄格式：劉丹，夏雪，吳益梅，等.植物染色體制片效果影響因素的解析［J］.浙江農(nóng)業(yè)科學(xué)，2015，56（10）：1654-1657.

10.16178/j.issn.0528-9017.20151044

2015-05-10

四川省教育廳重點(diǎn)項(xiàng)目（14ZA0016）；四川省省級大學(xué)生創(chuàng)新訓(xùn)練計劃項(xiàng)目（201410626036）；四川農(nóng)業(yè)大學(xué)本科質(zhì)量工程項(xiàng)目（04052109）

劉 丹（1996-），女，四川內(nèi)江人，本科生，從事蔬菜細(xì)胞遺傳學(xué)研究工作。E-mail：liudan618419@163.com。

孫 勃。E-mail：14099@sicau.edu.cn。