程莉莉，關(guān)鳳芝，吳廣文，于瑩，黃文功，趙東升，袁紅梅，侯佳欣

(黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟(jì)作物研究所，哈爾濱150086)

栽培亞麻與紅花亞麻種間雜交及其幼胚挽救的研究

程莉莉，關(guān)鳳芝*，吳廣文，于瑩，黃文功，趙東升，袁紅梅，侯佳欣

(黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟(jì)作物研究所，哈爾濱150086)

為了探討野生亞麻資源在栽培亞麻育種中的應(yīng)用，對(duì)栽培亞麻與紅花亞麻進(jìn)行種間雜交以及幼胚挽救研究。結(jié)果表明;最佳的幼胚剝離時(shí)期是授粉后15-19d;剝離的幼胚能夠在MS+0.1mg/L NAA+5 mg/L玉米素+15g/L蔗糖+15 g/L葡萄糖+0.8%瓊脂，pH5.6培養(yǎng)基中誘導(dǎo)出愈傷組織。初步建立了亞麻種間雜交幼胚挽救技術(shù)體系，此研究為紅花亞麻應(yīng)用于栽培亞麻育種奠定了基礎(chǔ)。

亞麻;遠(yuǎn)緣雜交;胚挽救

栽培亞麻(Linum usitatissimum)，隸屬亞麻科亞麻屬，是我國(guó)重要的纖維經(jīng)濟(jì)作物［1-2］。培育優(yōu)質(zhì)、高纖、耐逆性強(qiáng)的栽培亞麻品種，成為了亞麻育種的主要工作目標(biāo)［3］。遠(yuǎn)緣雜交是作物育種中廣泛應(yīng)用的一種方法，栽培亞麻和野生亞麻種間雜交能夠?qū)喡檫M(jìn)行品種改良以及種質(zhì)創(chuàng)新［4-5］。紅花亞麻(Linum grandiflorum)隸屬亞麻科亞麻屬，作為父本材料紅花亞麻與栽培亞麻進(jìn)行種間雜交，自然條件下幼胚敗育，不能得到成熟的種子。幼胚挽救技術(shù)能夠克服這種現(xiàn)象。對(duì)雜交后形成的幼胚實(shí)施胚挽救措施后，能夠獲得再生植株。

本文以栽培亞麻雜交F1代和紅花亞麻為材料，進(jìn)行種間雜交試驗(yàn)。通過對(duì)幼胚剝離時(shí)期的確定，以及愈傷組織培養(yǎng)基的篩選等研究，對(duì)雜交后形成的幼胚進(jìn)行離體培養(yǎng)，初步建立幼胚挽救體系。為建立一套完整高效的紅花亞麻誘導(dǎo)技術(shù)體系以及將此方法應(yīng)用到亞麻育種實(shí)踐提供相應(yīng)的理論基礎(chǔ)與技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

供試栽培亞麻雜交F1代材料(見表1)以及紅花亞麻由黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟(jì)作物研究所提供。將材料進(jìn)行盆栽種植，為使花期相遇，紅花亞麻早于栽培亞麻5天播種。

表1 栽培亞麻F1代材料編號(hào)及親本組合信息Tab.1 Serial number of F1and parental combinations

1.2 方法

1.2.1 人工雜交授粉

當(dāng)栽培亞麻和紅花亞麻生長(zhǎng)發(fā)育處于花期時(shí)，選取第二天能開花的栽培亞麻花蕾，打開萼片，去掉花瓣及花藥，第二天早晨將紅花亞麻花粉涂抹于栽培亞麻柱頭及整個(gè)花柱。合攏萼片，用薄棉花包裹雜交后的花蕾，編號(hào)掛牌并記錄雜交日期。觀察雜交后蒴果膨大情況，統(tǒng)計(jì)材料雜交后蒴果膨大率(蒴果膨大率=膨大蒴果數(shù)/雜交花蕾數(shù)*100%)。

1.2.2 培養(yǎng)基配制

使用MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基。設(shè)置添加激素濃度，配制不同的愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基(見表2)。

表2 愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基成分表Tab.2 Medium compositions for callus inducement

1.2.3 蒴果的消毒

在亞麻授粉后10-24d內(nèi)分別取明顯膨大的蒴果進(jìn)行試驗(yàn)研究。用70%的酒精將蒴果滅菌30s，無菌水沖洗后，將蒴果放入有效氯含量1%的次氯酸鈉溶液中消毒2次，每次10min，最后用無菌水沖洗3次，每次5min。將已滅菌的蒴果放入含有液體MS培養(yǎng)基(MS+15g/L蔗糖+ 15g/L葡萄糖，pH5.6)的培養(yǎng)皿中備用。

1.2.4 幼胚的剝離與培養(yǎng)

選取一枚蒴果，用手術(shù)刀將蒴果底部橫切掉，再將蒴果縱切，取出種子。將種子放于體視顯微鏡視野下，利用鑷子和手術(shù)刀，將幼胚從較大的種子中剝離出來，統(tǒng)計(jì)剝離出的幼胚獲得率(幼胚獲得率=幼胚/剝胚的種子×100%)。將剝離的幼胚放入愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)。較小的種子未進(jìn)行剝胚處理，直接放入愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)。培養(yǎng)條件:22℃條件下倒置暗培養(yǎng)2周后，進(jìn)行16h光照/8h暗培養(yǎng)。觀察培養(yǎng)基培養(yǎng)條件下幼胚形成愈傷組織狀態(tài)，統(tǒng)計(jì)幼胚愈傷組織形成率，篩選最適愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同材料在不同時(shí)期的蒴果膨大率

試驗(yàn)期間根據(jù)不同批次材料的花期進(jìn)行了3個(gè)時(shí)間段的雜交授粉工作，3個(gè)時(shí)間段為:(1)、5月29日-6月16日;(2)、6月30日-7月11日;(3)、8月9日-8月24日。分別統(tǒng)計(jì)不同材料的蒴果膨大率(見表3)。

表3 栽培亞麻雜交后蒴果膨大率Tab.3 Ratio of swelled capsules

在不同階段的蒴果膨大率不同?？傮w趨勢(shì)是階段(2)蒴果膨大率最高，階段(1)蒴果膨大率最低。栽培亞麻材料之間的蒴果膨大率有所不同，材料11065平均蒴果膨大率最高(80.26%)，材料11021蒴果膨大率最低(64.03%)。

2.2 幼胚剝離時(shí)期的確定

選取授粉后10-24d膨大的蒴果作為試驗(yàn)材料進(jìn)行剝胚處理。結(jié)果表明(見表4)，授粉后10-14d剝離出的幼胚獲得率較少。授粉后15-19d和授粉后20-24d剝離出的幼胚獲得率較多。授粉后20-24d的材料(見圖1)，由于授粉后時(shí)間較長(zhǎng)，幼胚的顏色由綠色變?yōu)辄S綠色，表明此階段的幼胚已經(jīng)不是最佳的生長(zhǎng)狀態(tài)。對(duì)種子進(jìn)行幼胚剝離時(shí)，獲得的種子呈干癟狀，使得剝胚過程困難且容易對(duì)幼胚造成傷害，因此授粉后20-24d的材料不適宜進(jìn)行剝胚操作。剝離幼胚的時(shí)期以授粉后15-19d為宜。

表4 幼胚獲得率Tab.4 Ratio of obtained immature embryo

2.3 愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基的篩選

將材料11065雜交后剝離的幼胚放入不同愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，培養(yǎng)1個(gè)月以后觀察愈傷組織狀態(tài)，統(tǒng)計(jì)綠色幼胚的愈傷組織誘導(dǎo)率。1-4號(hào)培養(yǎng)基愈傷組織誘導(dǎo)率分別為:27.78%、16.23%、42.86%和11.11%。結(jié)果表明，3號(hào)培養(yǎng)基中，幼胚長(zhǎng)大形成肉眼能夠觀察到的愈傷組織比其他培養(yǎng)基中的愈傷組織多，并且愈傷組織形態(tài)好，顏色呈綠色(見圖1)，能夠進(jìn)行繼代培養(yǎng)或進(jìn)行芽的分化培養(yǎng)。因此確定3號(hào)培養(yǎng)基為供試培養(yǎng)基中最適的愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基。

圖1 體視顯微鏡下種子觀察及肉眼觀察下的愈傷組織A:授粉后10-14d的種子;B:授粉后15-19d的種子; C:授粉后20-24d的種子;D:誘導(dǎo)出的愈傷組織Fig.1Seeds under stereomicroscope and callus by camera

3 討論

試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)雜交蒴果的膨大受溫度，光照，紅花亞麻花粉質(zhì)量等因素的影響。試驗(yàn)材料在溫室或室外條件下盆栽種植，選擇適宜的人工雜交時(shí)期，保證蒴果膨大率，能夠獲得較多的試驗(yàn)材料。為后續(xù)研究考慮，本研究采用栽培亞麻雜交F1代作為試驗(yàn)材料，這與米君等［6］利用宿根亞麻(Linum perenne)進(jìn)行栽培亞麻種間雜交采用純合材料的方式不同。栽培亞麻F1代材料的親本不同，各材料間蒴果膨大率不同。

在進(jìn)行幼胚剝離的操作時(shí)，有些種子形態(tài)較小，在體視顯微鏡視野下觀察不到里面的幼胚。可以考慮不進(jìn)行幼胚剝離處理，將種子直接放入愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，待誘導(dǎo)出愈傷組織后，再進(jìn)行剝離處理。此操作雖然誘導(dǎo)出愈傷組織較少且培養(yǎng)時(shí)間較長(zhǎng)，但可以避免材料的浪費(fèi)。

幼胚剝離時(shí)期的確定，需要考慮處理材料的難易程度以及剝離的幼胚數(shù)量，還應(yīng)該考慮幼胚的生長(zhǎng)狀態(tài)對(duì)后期愈傷組織形成的影響。自然條件下幼胚敗育，幼胚的活力是否影響后期的愈傷組織形成，可以就此進(jìn)行深入的研究。

在胚挽救技術(shù)中，植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的種類、濃度和配比是研究的核心和關(guān)鍵［7］。配制胚挽救各階段所需培養(yǎng)基時(shí)應(yīng)綜合考慮植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的使用。本研究中玉米素和NAA的配合使用及其濃度配比對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)起著重要作用。后續(xù)的試驗(yàn)需要研究植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的濃度和配比對(duì)芽的誘導(dǎo)、伸長(zhǎng)以及再生植株生根的影響，篩選最適培養(yǎng)基，完善胚挽救技術(shù)體系。

4 結(jié)論

研究對(duì)栽培亞麻與紅花亞麻種間雜交以及形成的幼胚進(jìn)行胚挽救研究。最適的幼胚剝離時(shí)期為授粉后15-19d。最適愈傷組織培養(yǎng)基為MS+0.1mg/L NAA+5 mg/L玉米素+15g/L蔗糖+15 g/L葡萄糖+0.8%瓊脂，pH5.6。

［1］路穎.我國(guó)亞麻品種資源的分類和近緣野生種［J］.黑龍江農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009(4):46-47.

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［4］戴華軍，朱正斌，沈雪林，等.作物遠(yuǎn)緣雜交育種的途徑及其實(shí)質(zhì)［J］.基因組學(xué)與應(yīng)用生物學(xué)，2010，29(1):144 -149.

［5］王麗，馬曉娣，米君，等.栽培亞麻×野生亞麻種間雜交胚胎發(fā)育的研究［J］.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2007，30(5):19 -22.

［6］米君，李愛榮，錢合順，等.亞麻種間雜交技術(shù)研究初報(bào)［J］.中國(guó)麻業(yè)科學(xué)，2008，30(3):136-146.

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Interspecific Hybridization and Immature Embryo Rescure between Linum usitatissimum and Linum grandiflorum

CHENG Li-li，GUAN Feng-zhi*，WU Guang-wen，YU Ying，HUANG Wen-gong，ZHAO Dong-sheng，YUAN Hong-mei，HOU Jia-xin
(Institute of Industrial Crops，Heilongjiang Academy of Agricultural Sciences，Harbin 150086，China)

In order to explore the application of wild flax in breeding，Linum usitatissimumandLinum grandiflorumwere used to study on interspeicific hybridization and embryo rescure.The analysis showed that the optimal embryo rescure stage was 15-19 days after pollination.Callus was obtained when immature embryo was cultured on the medium of MS+0.1mg/L NAA+5 mg/L zeatin+15g/L sucrose+15 g/L glucose+0.8%agar，pH5.6.The embryo rescure technology system was preliminarily established.This method laid a foundation for flax breeding withLinum grandiflorum.

flax;interspecific hybridization;embryo rescure

S563.2

A

1671-3532(2015)01-0001-04

2014-10-27

哈爾濱市科學(xué)技術(shù)局青年科技創(chuàng)新人才基金(2013RFQYJ020);黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新工程青年基金(2012QN010)

程莉莉(1983-)，女，碩士，助理研究員，從事亞麻遺傳育種研究。E-mail:chenglili_i@163.com。

*通訊作者:關(guān)鳳芝(1955-)，女，學(xué)士，研究員，從事亞麻遺傳育種研究。E-mail:kj-gfz@163.com。