牟方祥 吳紅 王恒 鄒德生 王勇方 勇飛

第三軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合科，重慶400038

酶聯(lián)免疫吸附法測(cè)定紅細(xì)胞內(nèi)多聚谷氨酸化甲氨蝶呤濃度的方法建立及其初步應(yīng)用

牟方祥 吳紅 王恒 鄒德生 王勇方 勇飛

第三軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合科，重慶400038

目的建立檢測(cè)紅細(xì)胞內(nèi)多聚谷氨酸化甲氨蝶呤（methotrexate polyglutamates，MTXPG）的酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法（ELISA）方法。方法將含有MTXPG的紅細(xì)胞采用凍融法、化學(xué)裂解法、酶法、超聲破碎法等方法裂解，加入血清與裂解液在抗壞血酸、巰基乙醇保護(hù)液作用下將MTXPG轉(zhuǎn)化為甲氨蝶呤（methotrexate，MTX），轉(zhuǎn)化液采用高氯酸、三氯乙酸及飽和硫酸銨溶液沉淀蛋白，最后將溶液pH值調(diào)整為3.0～9.0，采用ELISA檢測(cè)MTX濃度。經(jīng)方法學(xué)考核后，檢測(cè)臨床標(biāo)本對(duì)方法準(zhǔn)確性進(jìn)行評(píng)價(jià)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)凍融法與凍融法裂解紅細(xì)胞顯著優(yōu)于酶法和化學(xué)裂解法（P＜0.05），抗壞血酸配制的保護(hù)液明顯優(yōu)于巰基乙醇（P＜0.05），轉(zhuǎn)化液37℃孵育3 h時(shí)MTXPG轉(zhuǎn)化完全，高氯酸、三氯乙酸、飽和硫酸銨溶液3種蛋白沉淀劑無明顯差異（P＞0.05），最適pH為6～8，最佳pH值為6.8。濃度在0.2～10.0 ng/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好（r=0.9967），回收率為96.6%～103.3%，RSD為8.0%～14.3%，日內(nèi)差異為1.7%～11.7%，日間差異為7.4%～13.5%，RSD均小于15%。檢測(cè)患者紅細(xì)胞內(nèi)MTXPG濃度為（64.75±28.45）ng/mL。結(jié)論建立的紅細(xì)胞內(nèi)MTXPG的ELISA法有良好的準(zhǔn)確性和特異性，方法操作簡單易行，可用于臨床紅細(xì)胞內(nèi)MTXPG濃度的監(jiān)測(cè)。

多聚谷氨酸化甲氨蝶呤曰甲氨蝶呤曰固相酶聯(lián)免疫吸附法曰裂解

多聚谷氨酸化甲氨蝶呤（methotrexate polyglutamates，MTXPG）是甲氨蝶呤（methotrexate，MTX）在體內(nèi)的代謝產(chǎn)物［1］，1973年Baugh等［2］首次報(bào)道在人紅細(xì)胞內(nèi)發(fā)現(xiàn)MTXPG，后在人肝臟細(xì)胞中也存在MTXPG［3］。MTX作為一種葉酸拮抗劑，廣泛用于抗腫瘤、免疫抑制、抗風(fēng)濕、異位妊娠等治療［4-8］。MTXPG被認(rèn)為是人體內(nèi)MTX發(fā)揮藥理作用的活性成分［3］，低劑量MTX常用于治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎，大約有30%的患者因?qū)TX無顯著療效或不良反應(yīng)而停止治療［9］，MTX治療缺乏一個(gè)有效的療效及不良反應(yīng)預(yù)測(cè)指標(biāo)，大部分MTX在24 h被代謝，不能反映MTX的效應(yīng)，MTXPG長期儲(chǔ)存于患者紅細(xì)胞內(nèi)［9-10］。檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)MTXPG含量可預(yù)測(cè)MTX的治療效果及藥物不良反應(yīng)。目前MTXPG的常用的檢測(cè)方法為高效液相色譜法（HPLC）、色譜質(zhì)譜法（LC-MS）、放射免疫分析法（RIA）［6-11］。上述方法準(zhǔn)確度高，但是操作繁瑣，檢測(cè)成本高，且需要特殊設(shè)備儀器，不適用用臨床及基層醫(yī)院開展。本課題組前期研究已經(jīng)研發(fā)出生物素-親和素偶聯(lián)放大競爭酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）MTX檢測(cè)試劑盒，本研究結(jié)合MTXPG結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，選擇將紅細(xì)胞內(nèi)MTXPG體外轉(zhuǎn)為MTX，探索其轉(zhuǎn)化體系、細(xì)胞裂解液、pH值、轉(zhuǎn)化液、細(xì)胞轉(zhuǎn)化溫度及時(shí)間等條件，建立檢測(cè)紅細(xì)胞內(nèi)MTXPG的ELISA方法。

1 儀器與試藥

1.1 主要試劑與儀器

1.1.1 試劑生物素-親和素偶聯(lián)放大競爭ELISA MTX檢測(cè)試劑盒（自制），紅細(xì)胞裂解液（自制），蛋白酶（美國Sigma公司），MTXPG標(biāo)準(zhǔn)品（瑞士Schircks實(shí)驗(yàn)室），MTX標(biāo)準(zhǔn)品（中國藥品生物制品研究所），硫酸銨、巰基乙醇、高氯酸等均為分析純。

1.1.2 儀器超聲細(xì)胞破碎儀（上海狄非DH96-IIN）、洗板儀（BIOTEK ELX50）、超純水系統(tǒng)（德國賽多利斯arium）、-80℃超低溫冰箱（日本三洋YL300）、酶標(biāo)儀（BIOTEK ELX800）、恒溫孵育箱（上海儀器廠lw600）、高速離心機(jī)（Eppendorf，ELS）、微量可調(diào)移液器、磁力攪拌器、搖床等。

1.2 樣本來源

實(shí)驗(yàn)用口服MTX的類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者紅細(xì)胞為患者檢測(cè)完血常規(guī)后遺留血樣。

2 方法與結(jié)果

2.1 方法原理

本實(shí)驗(yàn)采用ELISA檢測(cè)紅細(xì)胞內(nèi)MTXPG濃度，檢測(cè)方法的原理是先將紅細(xì)胞裂解，利用血清中γ-谷氨酰水解酶（γ-glutamyl hydrolase，GGH）在轉(zhuǎn)化保護(hù)液的作用下將MTXPG轉(zhuǎn)化為MTX，再用蛋白沉淀劑將反應(yīng)液中蛋白沉淀，最后調(diào)解至適合pH，采用ELISA檢測(cè)MTX濃度，最后計(jì)算出MTXPG濃度。本實(shí)驗(yàn)通過考察紅細(xì)胞裂解方式、時(shí)間、溫度、轉(zhuǎn)化保護(hù)液、蛋白沉淀劑、反應(yīng)pH等因素對(duì)檢測(cè)體系的影響，進(jìn)而確定出最適合反應(yīng)體系及條件，并對(duì)方法的靈敏度、精密度、準(zhǔn)確度進(jìn)行驗(yàn)證。

2.2 紅細(xì)胞裂解方法對(duì)實(shí)驗(yàn)的影響

反復(fù)凍融法裂解紅細(xì)胞，取200μL含MTXPG的紅細(xì)胞分別在-80℃和-20℃下凍存，在37℃和56℃下復(fù)融，觀察不同凍融次數(shù)及凍存、復(fù)融時(shí)間對(duì)實(shí)驗(yàn)的影響（見圖1A～C），由圖可見：-80℃下凍存10 min，-20℃下凍存60 min，37℃下復(fù)融7 min，56℃下復(fù)融2 min，各個(gè)溫度下凍融2次可達(dá)到實(shí)驗(yàn)要求。凍融法、化學(xué)裂解法、酶法、超聲破碎法四種方法裂解紅細(xì)胞對(duì)實(shí)驗(yàn)影響見圖1D，提示反復(fù)凍融法優(yōu)于酶法和化學(xué)裂解法（P＜0.05）中。

圖1 紅細(xì)胞裂解方法對(duì)實(shí)驗(yàn)的影響

2.3 MTXPG轉(zhuǎn)化為MTX條件對(duì)實(shí)驗(yàn)影響

取上述紅細(xì)胞裂解液50μL與100μL自體血清1∶2混勻，分別在抗壞血酸和巰基乙醇的保護(hù)液下37℃避光孵育12 h。兩種保護(hù)液對(duì)實(shí)驗(yàn)影響見圖2A，由圖可見：壞血酸配制的保護(hù)液優(yōu)于巰基乙醇（P＜0.05）。在37℃避光孵育30 min及1、2、3、4、5、6、8、10、12 h，觀察不同孵育時(shí)間實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖2B，由圖可見，孵育3 h MTXPG可完全轉(zhuǎn)化為MTX。

2.4 蛋白沉淀實(shí)驗(yàn)及溶液pH值對(duì)實(shí)驗(yàn)影響

將100μL上述轉(zhuǎn)化液在分別加入10μL的0.3%高氯酸、10μL 1%三氯乙酸、100μL飽和硫酸銨溶液，分別觀察三種蛋白沉淀劑對(duì)實(shí)驗(yàn)影響見圖3A。由圖可見：3種蛋白沉淀劑差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。將加完蛋白沉淀劑的轉(zhuǎn)化液混勻，12 000g高速離心5 min，用1 moL/L的氫氧化鈉將上清液pH值調(diào)為3～9，不同pH值下結(jié)果見圖3B，最適pH為6～8，最佳pH值為6.8。

圖2 多聚谷氨酸化甲氨蝶呤轉(zhuǎn)化為甲氨蝶呤條件對(duì)實(shí)驗(yàn)的影響

圖3 蛋白沉淀實(shí)驗(yàn)及溶液pH值對(duì)實(shí)驗(yàn)影響

2.5 方法學(xué)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

靈敏度實(shí)驗(yàn)將標(biāo)準(zhǔn)MTXPG稀釋成不同濃度，測(cè)得其標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖4A，由圖可得靈敏度為0.096 ng/mL，線性方程為Y=-0.7859X+0.9007（r=0.9967），線性范圍為0.2～10.0 ng/mL，其中X為濃度的對(duì)數(shù)值，Y為吸光度。精密度實(shí)驗(yàn)，將標(biāo)準(zhǔn)MTXPG溶液加入空白紅細(xì)胞中，配制為1、2.5、5、7.5 ng/mL 4個(gè)不同濃度水平的待測(cè)樣本，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出MTXPG濃度，再與加入濃度相比得出回收率，同一天平行測(cè)量上述樣本5次，連續(xù)測(cè)5 d，1次/d，分別計(jì)算日間及日內(nèi)差異，結(jié)果見表1，回收率為96.6%～103.3%，平均回收率為100.8%，RSD=8.0%～14.3%，平均RSD=10.2%，日內(nèi)差異為1.7%～11.7%，平均RSD=8.4%，日間差異為7.4%～13.5%，平均RSD=9.6%。監(jiān)測(cè)20例口服MTX類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者紅細(xì)胞內(nèi)MTXPG濃度，結(jié)果見圖4B，平均MTXPG濃度為（64.75±28.45）ng/mL。

表1 多聚谷氨酸化甲氨蝶呤酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定下回收率堯日內(nèi)及日間差異（%，n=5）

圖4 方法標(biāo)準(zhǔn)曲線及口服甲氨蝶呤類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者紅細(xì)胞內(nèi)多聚谷氨酸化甲氨蝶呤濃度分布

3 討論

MTXPG是MTX在葉酰聚谷氨酸合成酶作用下與谷氨酸聚合而成，一個(gè)MTX分子最多可聚合6個(gè)谷氨酸分子，可形成六種不同聚合物，各聚合物分子式相差1～6的谷氨酸［10-13］。MTXPG多存在于細(xì)胞內(nèi)，且含量非常低，同時(shí)分離和檢測(cè)單個(gè)MTXPG聚合物難度非常大［11］。目前常用的檢測(cè)方法為同位素內(nèi)標(biāo)色譜質(zhì)譜法［14］，同位素內(nèi)標(biāo)制備成本高，且其操作繁瑣，需要特殊設(shè)備儀器，不適用于臨床檢測(cè)。有研究者在體外將MTXPG轉(zhuǎn)化為MTX，1分子MTXPG轉(zhuǎn)化為1分子的MTX，采用HPLC測(cè)定總的MTX濃度，可推算出MTXPG濃度［15］。ELISA方法高效、特異、敏感、操作簡單且無需特殊儀器，廣泛用于生命科學(xué)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域［15］。本課題組擬采用ELISA法檢測(cè)紅細(xì)胞內(nèi)MTXPG濃度。常規(guī)ELISA可檢測(cè)到mg/mL數(shù)量級(jí)，但是紅細(xì)胞中MTXPG含量為ng/mL數(shù)量級(jí)［14-17］。本課題組前期研究已經(jīng)研發(fā)出生物素-親和素偶聯(lián)放大競爭ELISA MTX檢測(cè)試劑盒，檢測(cè)靈敏度為0.087 ng/mL，檢測(cè)下限為0.2 ng/mL，檢測(cè)線性范圍為0.1～10.0 ng/mL，該方法滿足本課題組要求。本研究結(jié)合MTXPG結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，選擇將紅細(xì)胞內(nèi)MTXPG體外轉(zhuǎn)為MTX后采用ELISA檢測(cè)的最適條件。

本研究采用凍融法、化學(xué)裂解法、酶法、超聲破碎法四種方法裂解紅細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)凍融法與反復(fù)凍融法顯著優(yōu)于酶法和化學(xué)裂解法（P＜0.05），超聲破碎法需要超聲細(xì)胞破碎儀，考慮到方法可推廣性，筆者采用反復(fù)凍融法裂解紅細(xì)胞。筆者研究凍融時(shí)間、溫度、次數(shù)后發(fā)現(xiàn)，在-80℃下凍存10 min，56℃下復(fù)融2 min凍融2次可完全裂解紅細(xì)胞。考慮到部分基層醫(yī)院可能無-80℃冰箱，筆者研究發(fā)現(xiàn)-20℃下凍存60 min，37℃下復(fù)融7 min凍融2次也可達(dá)到實(shí)驗(yàn)要求。轉(zhuǎn)化保護(hù)液壞血酸配制的保護(hù)液顯著優(yōu)于巰基乙醇（P＜0.05）。在37℃避光孵育3 h MTXPG可完全轉(zhuǎn)化為MTX。高氯酸、三氯乙酸、飽和硫酸銨溶液3種蛋白沉淀劑無明顯差異（P＞0.05），最適pH為6～8，最佳pH值為6.8。標(biāo)準(zhǔn)曲線采用對(duì)數(shù)4參擬合相關(guān)性高達(dá)0.9934，靈敏度為0.096 ng/mL，線性范圍為0.2～10.0 ng/mL。精密度試驗(yàn)：回收率為96.6%～103.3%，RSD=8.0%～14.3%，日內(nèi)差異為1.7%～11.7%，日間差異為7.4%～13.5%，RSD均小于15%，滿足臨床檢測(cè)要求［18］。檢測(cè)患者紅細(xì)胞內(nèi)MTXPG濃度為（64.75±28.45）ng/mL。與國內(nèi)外研究基本一致［14-15，19］。

本研究采用ELISA方法檢測(cè)紅細(xì)胞內(nèi)MTXPG濃度，充分利用了ELISA高效、靈敏、特異、低成本、操作簡便等優(yōu)點(diǎn)，建立了體外MTXPG轉(zhuǎn)化MTX、ELISA檢測(cè)MTX的標(biāo)準(zhǔn)方法。該方法有良好的準(zhǔn)確性和特異性，可用于臨床紅細(xì)胞內(nèi)MTXPG濃度監(jiān)測(cè)。

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A novel method to establish and its preliminary application for determi鄄nation of concentrations of methotrexate polyglutamates in erythrocytes by enzyme-linked immunosorbent assay

MU Fangxiang WU Hong WANG Heng ZOU Desheng WANG Yong FANG Yongfei
Department of Integrated Traditional and Western Medicine,the First Affiliated Hospital of the Third Military Medical University,Chongqing 400038,China

ObjectiveTo establish a novel method that determines concentrations of methotrexate polyglutamates (MTXPG)in erythrocytes by enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA).MethodsMTXPG-containing erythrocytes were lysed with a series of different methods,including freeze-thawing,chemical lysis,enzymatic lysis,ultrasonication. MTXPG was transformed into methotrexate(MTX)in the treatment of ascorbic acid or mercaptoethanol after serum and cell lysis buffer were added.Perchloric acid,trichloroacetic acid and saturated ammonium sulfate solution were adopted to precipitate proteins of the transforming solution.ELISA was adopted to measure concentrations of MTX following adjustment of pH value from 3.0 to 9.0.The accuracy of the method were evaluated by detecting clinical samples after methodology validation.ResultsFreeze-thawing and ultrasonication for lysis of erythrocytes were significantly better than enzymatic lysis and chemical lysis(P＜0.05).In the process of MTXPG transforming,scorbic acid was significantly better than mercaptoethanol.MTXPG was completely transformed in the condition of incubation of transforming solutions incubation at 37℃for 3 h.Protein precipitation was showed no statistical difference in the Perchloric acid, trichloroacetic acid and saturated ammonium sulfate solution(P＞0.05).The scope of pH was 6-8 and the optimal pH value was 6.8.The results showed a good linear relation of concentration in the range of 0.2 to 10.0 ng/mL(r=0.9967, recovery rate was 96.6%-103.3%,RSD=8.0%-14.3%,within-day and between-day accuracy were 1.7%-11.7%,7.4% -13.5%.Concentrations of MTXPG in erythrocytes of patients was(64.75±28.45)ng/mL.ConclusionBesides simple and easy operation,the established method shows excellent accuracy and specificity,which can provide a novel pathway for clinical detection for concentrations of MTXPG in erythrocytes.

Polyglutamate Methotrexate;Methotrexate; Enzyme-linked immunosorbent assay;Lysis

R593.22

A

1673-7210淵2015冤01淵c冤-0091-04

2014-10-25本文編輯：衛(wèi)軻）

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（編號(hào)81373180）；衛(wèi)生公益性行業(yè)科研專項(xiàng)（編號(hào)201202004）。

牟方祥（1984.10-），男，第三軍醫(yī)大學(xué)2012級(jí)內(nèi)科學(xué)風(fēng)濕病專業(yè)在讀碩士生；研究方向：風(fēng)濕病治療藥物研究。

方勇飛（1964.3-），男，博士，主任醫(yī)師，教授；研究方向：風(fēng)濕病診斷與治療。