李洪武

(鄭州航空工業(yè)管理學(xué)院體育部，河南鄭州 450015)

骨關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis，OA)是一種慢性、漸進(jìn)性和退行性關(guān)節(jié)病變，以關(guān)節(jié)軟骨退變、滑膜炎癥為特征，引起關(guān)節(jié)疼痛和功能障礙，嚴(yán)重時(shí)需要進(jìn)行全關(guān)節(jié)置換。OA是老年人最常見(jiàn)的關(guān)節(jié)疾病，在年齡超過(guò)50歲的人群中，OA在導(dǎo)致長(zhǎng)期殘疾的疾病中僅次于心血管疾病，因此嚴(yán)重危害老年人的健康和生活質(zhì)量［1］。臨床實(shí)踐證實(shí)，運(yùn)動(dòng)療法對(duì) OA具有顯著療效［2］，針對(duì)活動(dòng)能力受限的OA患者，持續(xù)被動(dòng)運(yùn)動(dòng)(continuous passive motion，CPM)方式可促進(jìn)組織修復(fù)、恢復(fù)關(guān)節(jié)活動(dòng)度、減輕疼痛、預(yù)防深靜脈血栓、縮短住院時(shí)間并減少開(kāi)支［3，4］。目前的觀點(diǎn)認(rèn)為:CPM最早可在OA患者術(shù)后麻醉尚未消退時(shí)進(jìn)行［5］。但運(yùn)動(dòng)治療OA的具體機(jī)制仍不清楚。研究表明，基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMPs)和一氧化氮(nitric oxide，NO)在 OA 發(fā)病機(jī)制中起重要作用［6］，MMPs對(duì)軟骨細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)有極強(qiáng)的降解作用［7］，NO 由一氧化氮合酶(nitric oxide synthase，NOS)催化產(chǎn)生并介導(dǎo)軟骨ECM降解和軟骨細(xì)胞凋亡［8］。針對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的研究指出，NO可提高M(jìn)MPs的表達(dá)和/或活性［9］，但OA發(fā)生時(shí)，軟骨組織內(nèi)NO對(duì)MMPs調(diào)控的機(jī)制尚不確定。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)與臨床研究均表明，CPM對(duì)OA的療效與MMPs表達(dá)下調(diào)有關(guān)［10］，但CPM是否通過(guò)抑制NO信號(hào)途徑調(diào)控MMPs水平，尚不得而知。硝酸甘油(nitroglycerin，NG)在體內(nèi)代謝產(chǎn)生1，2－二硝基甘油和亞硝酸鹽，亞硝酸鹽在線粒體內(nèi)進(jìn)一步代謝生成NO，因此NG是NO的供體。本研究以雄性新西蘭大白兔為研究對(duì)象建立膝關(guān)節(jié)OA模型，觀察CPM和補(bǔ)充NG對(duì)軟骨細(xì)胞MMP－1和MMP－13表達(dá)以及NO含量的影響，探討CPM下調(diào)MMPs的可能機(jī)制。在眾多MMPs中，我們選取MMP－1和MMP－13是由于二者均屬于膠原酶亞型(降解軟骨ECM中含量最多的Ⅱ型膠原)且在OA中起關(guān)鍵作用［6，11］，而且其他 MMPs也是通過(guò)二者起作用的［7］。

1 材料與方法

1.1 材料

(1)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:純種雄性新西蘭大白兔30只，3～4月齡，體重2.8kg～4.2kg，由河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供(實(shí)驗(yàn)動(dòng)物批號(hào):20110302;許可證號(hào):SCXK(豫)－2011－0001)。(2)藥物:2%NG軟膏，購(gòu)自協(xié)和藥業(yè)有限公司，生產(chǎn)批號(hào):H20100195。(3)試劑:NO含量測(cè)定試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所;RNA提取試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、PCR引物、MMP－1和MMP－13抗體、免疫組化試劑盒購(gòu)自北京寶泰克生物科技有限公司;DAB顯色盒購(gòu)自武漢博士德生物工程公司。其余試劑均為市售分析純。(4)儀器:CPM儀由中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院提供;美國(guó)Beckman公司DU800型可見(jiàn)－紫外分光光度計(jì);美國(guó)ABI公司7900 hT型實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀。

1.2 模型制備

30只大白兔，取24只行單側(cè)膝關(guān)節(jié)前交叉韌帶切斷術(shù)建立膝關(guān)節(jié)OA模型［12］。3%戊巴比妥鈉經(jīng)由耳緣靜脈麻醉動(dòng)物后使其仰臥固定于兔臺(tái)上，于膝內(nèi)側(cè)切開(kāi)關(guān)節(jié)囊，打開(kāi)關(guān)節(jié)腔，將膝關(guān)節(jié)內(nèi)側(cè)副韌帶、前交叉韌帶切斷并切除內(nèi)側(cè)半月板。造模成功后，沖洗關(guān)節(jié)腔，逐層縫合。另取6只進(jìn)行假手術(shù)，暴露內(nèi)側(cè)副韌帶、前交叉韌帶和內(nèi)側(cè)半月板，不做切斷而直接閉合關(guān)節(jié)腔。術(shù)后連續(xù)3d肌注青霉素20萬(wàn)單位/次/d預(yù)防感染。在麻醉清醒后籠內(nèi)休息l天，術(shù)后第2天開(kāi)始正式實(shí)驗(yàn)。

1.3 干預(yù)分組

將6只假手術(shù)動(dòng)物作為正常對(duì)照組(normal control group，NC組)。另外24只OA模型動(dòng)物，術(shù)后隨機(jī)分為4組，每組各6只:(1)OA對(duì)照組(osteoarthritis control group，OA組):與NC組均不實(shí)施任何干預(yù)，籠中自由飼養(yǎng);(2)OA硝酸甘油給藥組(nitroglycerin group，NG組):于膝內(nèi)側(cè)切口無(wú)毛處，局部涂抹2%NG軟膏0.1mg，每天2次，共4周;(3)OA持續(xù)被動(dòng)運(yùn)動(dòng)組(continuous passive motion group，CPM組):在CPM儀上進(jìn)行膝關(guān)節(jié)持續(xù)被動(dòng)運(yùn)動(dòng)(勻速運(yùn)動(dòng)，范圍為40°～110°)，每天早晚各一次，每次4h，共4周［13］;(4)OA持續(xù)被動(dòng)運(yùn)動(dòng)+硝酸甘油給藥組(continuous passive motion+nitroglycerin group，CPM+NG組):運(yùn)動(dòng)方案同CPM組，給藥方案同NG組，共4周。

1.4 取材與組織切片制作

實(shí)驗(yàn)結(jié)束后24h，空氣栓塞處死動(dòng)物。按前次手術(shù)入路暴露股骨髁關(guān)節(jié)面，用高速電鉆鉆取軟骨標(biāo)本，分為三份。一份直接投入液氮，轉(zhuǎn)入﹣80℃低溫冰箱凍存待測(cè)NO含量以及MMP－1和MMP－13 mRNA表達(dá);另外一份于4%多聚甲醛固定48 h后石蠟包埋，切片，HE染色，光鏡觀察軟骨形態(tài)學(xué)變化(軟骨表面是否規(guī)則、有無(wú)裂隙，細(xì)胞數(shù)量、分布、排列是否規(guī)則，潮線是否完整)并參考Mankin’s評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)［14］對(duì)HE染色標(biāo)本進(jìn)行評(píng)分比較;最后一份軟骨組織用多聚甲醛固定后，再用10%EDTA(乙二胺四乙酸)脫鈣10天，常規(guī)脫水、透明、石蠟包埋，5μm連續(xù)切片，進(jìn)行MMP－1和MMP－13免疫組化檢測(cè)。

1.5 NO含量測(cè)定

軟骨組織勻漿后，采用硝酸還原酶法測(cè)定NO含量，550nm波長(zhǎng)處，0.5cm光徑測(cè)定吸光度值。計(jì)算公式為:NO含量(μmol/L)=(測(cè)定管吸光度值－空白管吸光度值)÷(標(biāo)準(zhǔn)管吸光度值－空白管吸光度值)×標(biāo)準(zhǔn)品濃度值×樣品測(cè)試前的稀釋倍數(shù)。

1.6 RQ－PCR檢測(cè)MMP－1和MMP－13 mRNA水平

取10mg軟骨組織勻漿后利用Trizol法(RNA提取試劑盒)抽提細(xì)胞總RNA，分光光度計(jì)檢測(cè)RNA質(zhì)量和濃度。取總RNA 3μg進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)(逆轉(zhuǎn)錄試劑盒)得 cDNA。利用Primer 5.0設(shè)計(jì)上下游引物:MMP－1:上游:5’－AAGCCAGATGCTGAAACCCTG －3’，下 游:5’ － GACCCTTGGAGACTTTGGTGAAT－3’，擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為328bp。MMP－13:上游:5’－TTGACCACTCCAAGGACCCAG －3’，下游:5’－GAGGATGCAGACGCCAGAAGA－3’，擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度252bp。內(nèi)參為GAPDH:上游:5’－GAGCTGAACGGGAAACTCAC －3’，下游:5’－GGTCTGGGATGGAAACTGTG －3’，擴(kuò)增長(zhǎng)度 476bp。將cDNA樣品配置于Real－time PCR 50μL反應(yīng)體系中:10×Buffer 5μL，dNTP 混合液 1μL，MgCl2 溶液 3μL，Taq 聚合酶2μL，上下游引物各 2μL，cDNA 為 2μL，三蒸水 33μL?；旌想x心后置于實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀中進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，反應(yīng)條件:94℃預(yù)變性5min，40 個(gè) PCR 循環(huán)(94℃，30s;55℃，40s;72℃，30 s)，最后72℃延伸5min。依據(jù)循環(huán)閾值(CT值)計(jì)算各基因的相對(duì)表達(dá)量(NC組的倍數(shù))。

1.7 免疫組化檢測(cè)MMP－1和MMP－13蛋白水平

石蠟切片常規(guī)脫蠟水化，0.1%胰酶37℃水浴20min進(jìn)行抗原修復(fù)，3%H2O2室溫浸泡10min滅活內(nèi)源性酶。滴加5%BSA封閉液，室溫封閉20min。加入稀釋的羊抗兔MMP－1和MMP－13抗體(一抗)，4℃孵育過(guò)夜，PBS緩沖液振洗3次，加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗，室溫孵育1h，PBS緩沖液振洗3次，DAB顯色，鏡下控制顯色時(shí)間。脫水、透明，中性樹(shù)脂封片。

用Image Pro Plus圖像分析系統(tǒng)對(duì)軟骨組織中出現(xiàn)的棕褐色陽(yáng)性產(chǎn)物的灰度進(jìn)行分析，步驟為:在切片中隨機(jī)選取6個(gè)高倍鏡(10×40光鏡)不重疊視野作圖像分析，鏡下有棕褐色顆粒者為陽(yáng)性細(xì)胞，測(cè)定陽(yáng)性顆粒平均灰度值，取每張切片的均值作為MMP－1和MMP－13蛋白表達(dá)量。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。組間比較使用單因素方差分析，LSD法進(jìn)行兩兩比較。P＜0.05為顯著性水平，P＜0.01為非常顯著性水平。統(tǒng)計(jì)分析軟件為SPSS 14.0 for Windows。

2 結(jié)果

2.1 體重的變化

NC組體重在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中逐漸增加(P＜0.01);OA組和NG組體重在第15天開(kāi)始下降并持續(xù)到實(shí)驗(yàn)結(jié)束(P＜0.01)，可能與OA時(shí)關(guān)節(jié)疼痛導(dǎo)致的活動(dòng)減少和飲食不足有關(guān);CPM組和CPM+NG組體重?zé)o顯著性變化(P＞0.05)。見(jiàn)圖1。

圖1 各組動(dòng)物體重的變化

2.2 HE染色觀察

NC組為正常軟骨組織，表面平整光滑無(wú)破損，軟骨細(xì)胞核呈藍(lán)色、排列整齊，潮線清晰可見(jiàn)，基質(zhì)呈淡粉色，著色均勻;OA組關(guān)節(jié)軟骨表面呈網(wǎng)格狀硬化，軟骨細(xì)胞丟失，潮線紊亂甚至消失，纖維結(jié)締組織增生，基質(zhì)破壞明顯;NG組病理學(xué)變化較OA組更為明顯，軟骨細(xì)胞胞核、胞質(zhì)結(jié)構(gòu)無(wú)法辨認(rèn)，細(xì)胞廣泛丟失伴細(xì)胞壞死，基質(zhì)染色明顯不均并出現(xiàn)玻璃樣變性，;CPM組可見(jiàn)軟骨表面粗糙，細(xì)胞出現(xiàn)輕度變形或排列紊亂，細(xì)胞核固縮，潮線紊亂，基質(zhì)染色尚均勻，基質(zhì)變性較OA和NG組明顯減輕;CPM+NG組軟骨表面粗糙，有小的裂隙形成，細(xì)胞與基質(zhì)破壞較OA和NG組有所減輕，但仍較CPM組嚴(yán)重。見(jiàn)圖2。Mankin’s評(píng)分比較見(jiàn)表1。

圖2 HE染色(10×20)

表1 各組軟骨組織Mankin’s評(píng)分比較

2.3 NO含量

NC組NO含量低于其他各組(P＜0.01);NG組高于OA組(P＜0.01);CPM組低于OA組和NG組(P＜0.01);CPM+NG組低于NG組(P＜0.01)，但高于CPM組(P＜0.01)，與OA組無(wú)顯著性差異(P＞0.05)。見(jiàn)圖3。

圖3 各組NO含量的變化

2.4 MMP－1和MMP－13 mRNA變化

4周實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，與NC組比較，其他各組MMP－1和MMP－13 mRNA均顯著性升高(P＜0.01);NG組高于OA組(P＜0.01);CPM組高于低于OA組和NG組(P＜0.01);CPM+NG組低于NG組(P＜0.01)，高于CPM組(P＜0.01)，與OA組無(wú)顯著性差異(P＞0.05)。見(jiàn)圖4。

圖4 各組MMP－1和MMP－13 mRNA的變化

2.5 MMP－1和MMP－13蛋白的變化

NC組MMP－1和MMP－13均呈弱陽(yáng)性表達(dá)，僅在表層軟骨細(xì)胞內(nèi)偶見(jiàn)少許棕褐色顆粒;OA組MMP－1和MMP－13呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)，全層可見(jiàn)，軟骨基質(zhì)、胞漿中均有深棕褐色顆粒。NG組陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)率較OA組明顯增多且染色深;CPM組可見(jiàn)陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)，但其分布明顯較OA組和NG組分布稀疏，且染色較淺;CPM+NG組MMP－1、MMP－13均較OA組合NG組表達(dá)降低(P＜0.01)，但仍高于CPM組。見(jiàn)圖5和圖6?；叶戎捣秶?～255，灰度值越小，免疫染色程度越高，即蛋白表達(dá)量越多。結(jié)果顯示，MMP－1和MMP－13蛋白表達(dá)量與mRNA的變化趨勢(shì)基本一致，見(jiàn)表2。

圖5 MMP－1免疫組化(10×40)

圖6 MMP－13免疫組化(10×40)

表2 各組關(guān)節(jié)軟骨中MMP－1和MMP－13染色平均灰度值

3 討論

3.1 MMPs和NO在OA發(fā)病機(jī)制中的作用

關(guān)節(jié)軟骨退變是OA最重要的標(biāo)志。關(guān)節(jié)軟骨屬透明軟骨，由軟骨細(xì)胞和軟骨ECM共同組成。軟骨ECM起著緩沖機(jī)械負(fù)荷和減小關(guān)節(jié)摩擦的作用，主要成分是水、膠原和蛋白聚糖，其中膠原以II型膠原為主(占膠原總量的90%左右)［7］。MMPs是降解ECM的主要酶系，是維持正常組織可塑性和完整性以及在病理狀態(tài)下(如OA)誘導(dǎo)軟骨退變的主要因子［7］，其中MMP－1和MMP－13可直接降解軟骨ECM中最具特征、含量最多的Ⅱ型膠原，其表達(dá)增高程度與軟骨組織破壞程度一致［6，11］，而且其他 MMPs亞型對(duì)Ⅱ型膠原的降解也需要通過(guò)MMP－1或MMP－13起作用［7］，因此兩者的變化最能反映軟骨基質(zhì)的代謝變化。在本研究中，NC組(即正常軟骨組織)MMP－1和MMP－13微量表達(dá)，以維持軟骨ECM的代謝穩(wěn)態(tài)與更新;而OA組MMP－1和MMP－13表達(dá)顯著上調(diào)，打破了ECM合成分解的動(dòng)態(tài)平衡，降解作用增強(qiáng)，軟骨出現(xiàn)破壞，這與前人的研究一致［11］，進(jìn)一步證實(shí)了MMPs在OA中的作用。

NO由NOS催化左旋精氨酸產(chǎn)生，可作為信號(hào)分子、神經(jīng)遞質(zhì)和免疫效應(yīng)分子在體內(nèi)多種生理病理過(guò)程中扮演關(guān)鍵角色。研究發(fā)現(xiàn)，正常軟骨組織中無(wú)NOS表達(dá)，而OA時(shí)軟骨細(xì)胞中NOS表達(dá)上調(diào)，NO合成增加［15］，同時(shí)OA患者關(guān)節(jié)滑液中NO含量升高，提示NO在OA中起關(guān)鍵作用。本研究證實(shí)了這一結(jié)論，即OA組NO含量顯著高于NC組。將NOS基因轉(zhuǎn)入軟骨細(xì)胞后發(fā)現(xiàn)，軟骨細(xì)胞產(chǎn)生的大量NO可抑制軟骨基質(zhì)合成，促進(jìn)膠原蛋白降解并誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞凋亡［8］。應(yīng)用iNOS抑制劑則能夠抑制NO的過(guò)量釋放，改善軟骨代謝環(huán)境，對(duì)軟骨有一定的保護(hù)作用［16］。本研究建立兔OA模型后，給予NG處理后，發(fā)現(xiàn)NG組關(guān)節(jié)軟骨退變明顯較OA組加重，與Cake等［17］對(duì)綿羊的研究結(jié)果相似，說(shuō)明OA時(shí)NOS過(guò)表達(dá)催化NO大量合成，促進(jìn)軟骨基質(zhì)降解。OA時(shí)發(fā)生炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激并產(chǎn)生眾多信號(hào)分子如白細(xì)胞介素 －1β(IL－1β)、腫瘤壞死因子 －α(TNF－α)和氧自由基(ROS)，上述因子通過(guò)作用于NOS基因啟動(dòng)子序列進(jìn)而激活NOS轉(zhuǎn)錄和翻譯［7］。

3.2 NO對(duì)MMP－1和MMP－13的調(diào)節(jié)作用

盡管對(duì)OA時(shí)內(nèi)源性NO抑制軟骨基質(zhì)合成作用較為肯定，但具體機(jī)制尚不明確。研究表明，多種組織中NO可上調(diào)MMPs，如在內(nèi)皮細(xì)胞中，外源性補(bǔ)充NO可誘導(dǎo)MMP－13表達(dá)升高，NOS失活后 MMP －13表達(dá)下調(diào)［18，19］，NO 可通過(guò) cGMP－PKG信號(hào)途徑(轉(zhuǎn)錄水平)［18］以及對(duì)蛋白(酪氨酸殘基 －Tyr338)硝基化作用(翻譯后修飾)［20］調(diào)控 MMP－13基因表達(dá);骨發(fā)育過(guò)程中，NO通過(guò)cGMP－PKG途徑磷酸化Cbfa－1，上調(diào)成骨細(xì)胞MMP－13表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)骨發(fā)生［21］;軟骨細(xì)胞培養(yǎng)證實(shí)，NO可上調(diào)MMP－2活性和表達(dá)量［22］，而NOS抑制劑則可下調(diào)MMP－1表達(dá)［23］。結(jié)合上述研究，我們推測(cè)，在OA中，NO對(duì)軟骨基質(zhì)的降解作用可能是通過(guò)上調(diào)MMPs表達(dá)實(shí)現(xiàn)的。本研究建立OA模型，于在體條件下直接證實(shí)了這一假設(shè)，即OA組MMP－1和MMP－13的mRNA和蛋白表達(dá)量顯著高于NC組，給予硝酸甘油處理后，其表達(dá)上調(diào)作用得到了加強(qiáng)，即NG組MMP－1和MMP－13的表達(dá)量顯著高于OA組，提示NO可通過(guò)上調(diào)MMPs表達(dá)發(fā)揮對(duì)OA的負(fù)性效應(yīng)。因此，NOS－NO－MMP－1/MMP－13是造成OA時(shí)ECM降解和病情進(jìn)展的關(guān)鍵信號(hào)通路。

3.3 CPM通過(guò)抑制軟骨細(xì)胞NO合成下調(diào)MMP－1和MMP－13表達(dá)

傳統(tǒng)觀點(diǎn)認(rèn)為:OA(特別是創(chuàng)傷性O(shè)A)患者需要較長(zhǎng)時(shí)間制動(dòng)，往往因肌肉萎縮、關(guān)節(jié)內(nèi)粘連等因素妨礙關(guān)節(jié)功能恢復(fù)，導(dǎo)致關(guān)節(jié)僵硬、運(yùn)動(dòng)能力受限。如何促進(jìn)受損關(guān)節(jié)軟骨的愈合與修復(fù)，是OA治療研究中的重點(diǎn)內(nèi)容。在目前常用的處理方法中，不管是制動(dòng)、藥物治療、手術(shù)治療還是組織工程學(xué)等方法，均有其不足之處。20世紀(jì)70年代，Salter等［24］提出CPM理論，并將其應(yīng)用于關(guān)節(jié)軟骨缺損后的修復(fù)過(guò)程，取得了令人滿意的效果，為臨床上防治OA的發(fā)生提供了新思路［3，4］。由于MMPs在OA發(fā)病機(jī)制中起關(guān)鍵作用，因此推測(cè)CPM對(duì)OA的療效可能與MMPs下調(diào)有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，關(guān)節(jié)過(guò)度使用(如長(zhǎng)期超負(fù)荷運(yùn)動(dòng))和廢用(如關(guān)節(jié)固定)均可上調(diào)關(guān)節(jié)軟骨MMPs表達(dá)并造成軟骨組織降解，進(jìn)而發(fā)生OA，而生理負(fù)荷強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)(如日?；顒?dòng))則具有維持關(guān)節(jié)軟骨內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)、預(yù)防軟骨降解和改善關(guān)節(jié)功能的作用［10］。Leong等［10］的研究發(fā)現(xiàn)，中等強(qiáng)度被動(dòng)運(yùn)動(dòng)可下調(diào)OA時(shí)軟骨細(xì)胞MMP－1表達(dá)。利用血流切應(yīng)力模擬運(yùn)動(dòng)負(fù)荷對(duì)體外培養(yǎng)的軟骨細(xì)胞實(shí)施干預(yù)后發(fā)現(xiàn)，低切應(yīng)力(5dyn/cm2)使MMP－1和MMP－13表達(dá)稍有下調(diào)，而高切應(yīng)力(20 dyn/cm2)則使兩者表達(dá)顯著升高［25］。上述研究提示，運(yùn)動(dòng)對(duì)軟骨細(xì)胞MMPs表達(dá)的效應(yīng)具有運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度依賴性。本研究采用的CPM方式，屬于典型的中低強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)負(fù)荷［24］，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CPM 組 NO 含量、MMP－1和 MMP－13表達(dá)量雖然高于NC組，但均低于OA組，提示CPM通過(guò)抑制MMPs表達(dá)對(duì)OA起保護(hù)作用。

CPM是否通過(guò)抑制NO信號(hào)途徑調(diào)控MMPs水平是本研究的主要目的，以期為臨床OA患者治療方案的制定(運(yùn)動(dòng)聯(lián)合藥物)提供理論依據(jù)，這一機(jī)制目前尚無(wú)報(bào)道。本研究在證實(shí)了NO和MMPs介導(dǎo)OA時(shí)軟骨退變以及軟骨細(xì)胞過(guò)量產(chǎn)生的NO誘導(dǎo)MMP－1和MMP－13表達(dá)上調(diào)的基礎(chǔ)上，給予OA兔模型補(bǔ)充NG并實(shí)施運(yùn)動(dòng)干預(yù)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與CPM組比較，CPM+NG組NO含量、MMP－1和MMP－13表達(dá)量均顯著升高，雖然低于NG組，但與OA組無(wú)顯著性差異，說(shuō)明CPM對(duì)MMPs表達(dá)的抑制作用可被NO逆轉(zhuǎn)，提示CPM對(duì)OA時(shí)軟骨細(xì)胞的保護(hù)作用至少部分是通過(guò)減少NO合成實(shí)現(xiàn)的。當(dāng)然，運(yùn)動(dòng)對(duì)OA時(shí)MMPs的調(diào)控除了NO信號(hào)途徑外，還可能存在其他不依賴于NO的信號(hào)通路，如OA時(shí)TGF－β(轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子－β)－ALK(活化素樣激酶)－Smad信號(hào)途徑可上調(diào)MMP－13表達(dá)［26］，但運(yùn)動(dòng)對(duì)此信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的作用尚待進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論與展望

OA時(shí)軟骨細(xì)胞NO大量產(chǎn)生并上調(diào)MMP－1和MMP－13表達(dá)，介導(dǎo)軟骨基質(zhì)降解和軟骨損傷;CPM則通過(guò)抑制軟骨細(xì)胞NO合成下調(diào)MMP－1和MMP－13表達(dá)，進(jìn)而對(duì)軟骨細(xì)胞起保護(hù)作用。這一分子機(jī)制的揭示對(duì)于臨床OA患者運(yùn)動(dòng)康復(fù)以及CPM與相關(guān)藥物(NO和MMPs抑制劑)的聯(lián)合應(yīng)用具有一定的理論與現(xiàn)實(shí)意義。

OA時(shí)不依賴于NO的MMPs調(diào)控機(jī)制以及運(yùn)動(dòng)干預(yù)的作用鮮有研究，此外，運(yùn)動(dòng)對(duì)軟骨組織 NOS亞型(iNOS、eNOS、nNOS)的影響以及不同運(yùn)動(dòng)方式、不同運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度對(duì)OA時(shí)NO、MMPs的影響尚無(wú)報(bào)道，今后的研究應(yīng)進(jìn)一步探討運(yùn)動(dòng)以及運(yùn)動(dòng)聯(lián)合藥物對(duì)OA的作用機(jī)制并最終確定OA患者運(yùn)動(dòng)康復(fù)療法的最佳運(yùn)動(dòng)方式和運(yùn)動(dòng)負(fù)荷以及臨床治療的最佳方案。

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