木合他拜爾, 嚴(yán) 華, 徐 姍, 馮 楠, 郝 杰, 朱塵琪, 郭 爽, 張朝暉, 韓南銀*

(1. 北京大學(xué)藥學(xué)院, 北京 100191; 2. 北京出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術(shù)中心, 北京 100026; 3. 北京市食品安全監(jiān)控和風(fēng)險評估中心, 北京 100041)

技術(shù)與應(yīng)用

QuEChERS-超高效液相色譜-高分辨串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)檢測雞肉中6種抗球蟲藥物

木合他拜爾1, 嚴(yán) 華2, 徐 姍2, 馮 楠3, 郝 杰3, 朱塵琪1, 郭 爽1, 張朝暉2, 韓南銀1*

(1. 北京大學(xué)藥學(xué)院, 北京 100191; 2. 北京出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術(shù)中心, 北京 100026; 3. 北京市食品安全監(jiān)控和風(fēng)險評估中心, 北京 100041)

建立了雞肉中二硝托胺、尼卡巴嗪、地克珠利、妥曲珠利、莫能菌素及鹽霉素6種抗球蟲藥物的超高效液相色譜-高分辨串聯(lián)質(zhì)譜多殘留檢測方法。經(jīng)QuEChERS樣品凈化,首先使用含有1%(v/v)三氯乙酸的乙腈-水(3∶7, v/v)溶液提取樣品中的被測物,再加入氯化鈉,使用50 mg/mLN-丙基乙二胺(PSA)+50 mg/mL中性氧化鋁(Alumina-N)的混合分散固相萃取(dispersive solid phase extraction, DSPE)粉末凈化提取,過0.22 μm濾膜后以超高效液相色譜-高分辨串聯(lián)質(zhì)譜檢測。選擇Waters Acquity UPLC?BEH C8色譜柱(100 mm×2.1 mm, 1.7 μm),以甲醇-5 mmol/L醋酸銨水溶液為流動相進(jìn)行梯度洗脫。使用正、負(fù)離子同時掃描模式,基質(zhì)外標(biāo)法定量。研究表明,6種目標(biāo)化合物的線性范圍為:二硝托胺,1.0～30.0 μg/L;尼卡巴嗪,0.2～6.0 μg/L;地克珠利、妥曲珠利,2.0～60.0 μg/L;莫能菌素、鹽霉素,4.0～120.0 μg/L?？瞻讟悠分刑砑拥汀⒅?、高3個水平的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,回收率在67.7%～126.8%之間,相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)≤10.4%。6種抗球蟲藥物的定量限分別為:二硝托胺,2.50 μg/kg;尼卡巴嗪,0.50 μg/kg;地克珠利、妥曲珠利,5.00 μg/kg;莫能菌素、鹽霉素,20.00 μg/kg。該方法操作簡便,靈敏度高,且能夠滿足日常檢測要求。

QuEChERS;超高效液相色譜-高分辨串聯(lián)質(zhì)譜;抗球蟲藥;雞肉

球蟲病是一種由艾美球蟲屬原球蟲所致[1],可對禽類腸道造成損害的寄生蟲疾病。感染球蟲后將會嚴(yán)重影響禽類的肉蛋產(chǎn)出,嚴(yán)重者可導(dǎo)致大量禽類死亡,給農(nóng)民帶來嚴(yán)重?fù)p失。據(jù)估算,感染臨床和亞臨床球蟲病的禽類分別占到全球禽類總數(shù)的5%和20%[2]。每年禽類養(yǎng)殖業(yè)因艾美球蟲屬感染而造成的損失高達(dá)24億美元,其中24%為相關(guān)藥物花費[3]。在我國,每年由于球蟲感染而給養(yǎng)殖者帶來的損失接近7億人民幣[4]。自20世紀(jì)40年代發(fā)現(xiàn)磺胺類藥物具有抗球蟲作用以來,先后應(yīng)用于雞球蟲病防治的藥物約有50種。然而,抗球蟲藥物的使用極易產(chǎn)生耐藥性[5,6],加之藥物的功效與藥物毒性[7]等多方面影響,多數(shù)藥物已經(jīng)退出市場。合理的使用抗球蟲藥物,在對抗球蟲感染方面發(fā)揮著重要的作用?，F(xiàn)在養(yǎng)禽業(yè)仍在使用的抗球蟲藥可以分為以下兩類:(1)通過作用于寄主的代謝過程而發(fā)揮作用的具有固定化學(xué)結(jié)構(gòu)的化學(xué)藥物,如二硝托胺、地克珠利、妥曲珠利和尼卡巴嗪等;(2)以干擾離子傳輸和滲透平衡為基本作用機(jī)制的聚醚類離子載體藥物,如莫能菌素和鹽霉素等[6]。

現(xiàn)有的抗球蟲藥物檢測標(biāo)準(zhǔn)方法多為單一化合物的檢測,涉及比色法、薄層法、免疫分析法、液相色譜法[8,9]、液相色譜-質(zhì)譜法[10,11]等多種檢測手段,而其中所使用的樣品前處理方法復(fù)雜,操作步驟繁瑣,致使其總體檢測效率低下。與此同時,聚醚類離子載體抗生素類抗球蟲藥物缺乏紫外、熒光特性,在檢測前需要對其進(jìn)行衍生操作,使得檢測方法更加繁瑣。另一方面,由于抗球蟲藥物易產(chǎn)生耐藥性,在實際禽類養(yǎng)殖過程中為達(dá)到理想的使用效果往往使用聯(lián)合用藥的給藥方式[12],造成禽類產(chǎn)品中多種藥物同時殘留。因此,建立一種快速、簡便的前處理方法實現(xiàn)多種抗球蟲藥物的同時檢測,具有十分重要的意義。

QuEChERS方法是一種快速便捷的前處理方法,由Anastassiades等[13]在2003年首次提出。該方法由提取和凈化兩個主要步驟組成,主要用于果蔬中農(nóng)藥的檢測。在Anastassiades等的基礎(chǔ)上,QuEChERS方法不斷發(fā)展,建立了應(yīng)用于農(nóng)藥殘留檢測的官方方法AOAC 2007.01[14]和歐盟CEN 2002/657/EC[15],在獸藥檢測、生化檢測以及環(huán)境檢測等多個領(lǐng)域也得到應(yīng)用[16-19]。嚴(yán)華等[20]在對雞肉組織中5種糖皮質(zhì)激素進(jìn)行殘留檢測時,使用了優(yōu)化后的QuEChERS方法作為前處理手段,取得了較好的實驗結(jié)果。

本研究中,采用QuEChERS方法進(jìn)行前處理,超高效液相色譜-四極桿-靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜聯(lián)用(UPLC-Q Exactive)技術(shù),同時對禽類基質(zhì)中二硝托胺、尼卡巴嗪(殘留標(biāo)志物為4,4-二硝基均二苯脲(4,4′-dinitrocarbanilide))、地克珠利、妥曲珠利、莫能菌素以及鹽霉素這6種抗球蟲藥物(化學(xué)結(jié)構(gòu)式見圖1)進(jìn)行殘留檢測。該方法不僅快速、簡便、靈敏,且滿足雞肉中抗球蟲藥物檢測的限量要求[21]。

圖1 6種抗球蟲藥物的化學(xué)結(jié)構(gòu)式Fig.1 Chemical structures of the six anticoccidials

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

Ultimate 3000液相色譜儀,美國Thermo Fisher公司;Q-Exactive高分辨質(zhì)譜儀,配電噴霧離子(ESI)源,美國Thermo Fisher公司;GM200刀式研磨儀,德國Retsch公司;IKA MS3 basic圓周振蕩器,德國IKA公司;Sigma 3-18KS冷凍離心機(jī)器,德國Sigma公司;Elix/RiOs純水系統(tǒng),美國Millipore公司。

二硝托胺(dinitolmide, CAS No. 148-01-6)、尼卡巴嗪(nicarbazin,為4,4-二硝基均二苯脲與2-羥基-4,6-二甲基嘧啶的復(fù)合物,CAS No. 330-95-0)、地克珠利(diclazuril, CAS No. 101831-37-2)、妥曲珠利(toltrazuil, CAS No. 69004-03-1)、莫能菌素(monensin, CAS No. 22373-78-0)和鹽霉菌素(salinomycin, CAS No. 55721-31-8),德國Dr. Ehrenstorfer公司;乙腈、甲醇、乙酸乙酯(分析純),冰醋酸、醋酸銨(色譜級),美國Thermo Fisher公司;冰醋酸;三氯乙酸;甲酸;Cleanert PSA/C18/NH2/Alumina-N/GBC/Florisil填料,天津博納艾杰爾科技有限公司;無水硫酸鈉、無水硫酸鎂、氯化鈉,北京化學(xué)試劑公司。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

標(biāo)準(zhǔn)儲備液:準(zhǔn)確稱取6種標(biāo)準(zhǔn)品,分別用甲醇溶解,配制質(zhì)量濃度為10 g/L的標(biāo)準(zhǔn)儲備液,在4 ℃冰箱內(nèi)保存,需要時配制成不同濃度標(biāo)準(zhǔn)工作液。

混合儲備液:取上述標(biāo)準(zhǔn)儲備液用甲醇配制成質(zhì)量濃度為1 g/L的混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液,在4 ℃冰箱內(nèi)保存。

1.3 提取液的制備

準(zhǔn)確稱量70 mL乙腈,加入30 mL水制得乙腈-水(7∶3, v/v)溶液,加入1.00 g三氯乙酸,超聲10 min,得到含1%三氯乙酸的乙腈-水(7∶3, v/v)溶液。

1.4 樣品的制備

稱取樣品5.00 g置于50 mL具塞離心管中,加入提取液10 mL,渦旋振蕩20 s后超聲20 min,加入4 g NaCl,渦旋振蕩30 s, -10 ℃條件下以8 000 r/min離心10 min,取上清液1 mL于含有50 mg PSA+50 mg Alumina-N的Eppendorf管中凈化,渦旋振蕩30 s,以12 000 r/min離心5 min,取上清液過0.22 μm濾膜后進(jìn)行UPLC-Q Exactive分析。

1.5 UPLC-Q Exactive質(zhì)譜條件

1.5.1UPLC條件

色譜柱:Waters Acquity UPLC?BEH C8色譜柱(100 mm×2.1 mm, 1.7 μm)。流動相:A為5 mmol/L醋酸銨,B為甲醇。梯度程序:0.0～1.0 min, 95%A; 1.0～6.0 min, 95%A～2%A; 6.0～10.0 min, 2%A; 10.0～10.1 min, 2%A～95%A; 10.1～11.0 min, 95%A。流速:0.25 mL/min;柱溫:40 ℃;進(jìn)樣量:10 μL。

1.5.2Q-Exactive高分辨質(zhì)譜條件

離子源:ESI;掃描方式:正、負(fù)離子同時掃描;采集方式:目標(biāo)選擇性離子掃描(target-SIM);離子源溫度:350 ℃;毛細(xì)管溫度:320 ℃;毛細(xì)管電壓:正離子模式下為3.5 kV,負(fù)離子模式下為2.8 kV;鞘氣氣流:4.6 L/min;各化合物信息見表1。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件的選擇

本研究最初使用Waters Acquity UPLC?BEH C18柱(100 mm×2.1 mm, 1.7 μm)作為分離柱,但尼卡巴嗪殘留較為嚴(yán)重。改用Waters Acquity UPLC?BEH C8柱(100 mm×2.1 mm, 1.7 μm)分離后,殘留現(xiàn)象得到有效的改善。優(yōu)化色譜流動相時,首先比較了甲醇-水體系與乙腈-水體系的分離效果。結(jié)果表明,當(dāng)使用乙腈-水體系時,化合物峰雜亂,出現(xiàn)拖尾峰,故選擇甲醇-水體系作為流動相。

表1 6種抗球蟲藥物的質(zhì)譜信息及保留時間

圖2 6種抗球蟲藥物的質(zhì)譜圖Fig.2 Mass spectra of the six anticoccidials

由于采用正、負(fù)離子同時掃描的質(zhì)譜方法,為避免影響負(fù)離子掃描模式下的離子化效果,流動相為不含酸體系。為進(jìn)一步改善峰形,使用5 mmol/L醋酸銨替代純水。

2.2 質(zhì)譜條件的選擇

在6種化合物中,二硝托胺、尼卡巴嗪、地克珠利和妥曲珠利在負(fù)離子掃描模式下有響應(yīng),莫能菌素和鹽霉素在正、負(fù)離子掃描模式下均有響應(yīng),其中莫能菌素在負(fù)離子掃描模式下的響應(yīng)更高,鹽霉素在正離子掃描模式下的響應(yīng)值更高,故采用實時正、負(fù)切換檢測模式進(jìn)行質(zhì)譜掃描。通過精確質(zhì)量數(shù)篩查出各目標(biāo)化合物的母離子后,使用自動觸發(fā)二級質(zhì)譜對化合物進(jìn)行定性確證,采用Step NCE方法,分別設(shè)置20、40、60 eV的碰撞能量,得到對應(yīng)目標(biāo)化合物的碎片信息,并選取了豐度較高的碎片離子作為第二定性離子(見表1)。如圖2所示，使用40 eV的碰撞能量對6種化合物進(jìn)行裂解,得到化合物子離子信息。其中,妥曲珠利未找到特征子離子,采用三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜檢測時,由母離子→母離子定量,背景較高,且靈敏度降低。本文中使用高分辨率質(zhì)譜,提高了對妥曲珠利這類無特征子離子的化合物的選擇性,避免了靈敏度的大幅降低,同樣采用外標(biāo)法母離子定量。

2.3 前處理方法優(yōu)化

2.3.1提取溶劑的選擇

分別考察了乙腈-水(3∶7, v/v)、含1%醋酸的乙腈-水(3∶7, v/v)、甲醇-水(3∶7, v/v)、含1%醋酸的甲醇-水(3∶7, v/v)溶液的提取效果。在提取步驟中,甲醇與水相在加入鹽后仍難以分層,成混濁狀,故放棄使用甲醇。對比乙腈與含1%醋酸的乙腈-水(3∶7, v/v)的提取效果,發(fā)現(xiàn)使用含1%醋酸的乙腈-水(3∶7, v/v)時化合物整體表現(xiàn)出更高的回收率。為了增加蛋白結(jié)合率高的莫能菌素和鹽霉素的回收率,對比了含1%醋酸的乙腈-水(3∶7, v/v)、含1%甲酸的乙腈-水(3∶7, v/v)和含1%三氯乙酸的乙腈-水(3∶7, v/v)溶液的提取效果,發(fā)現(xiàn)在使用含1%三氯乙酸的乙腈-水(3∶7, v/v)溶液時,目標(biāo)化合物的回收率均有較大程度的提升,因此選擇含1%三氯乙酸的乙腈-水(3∶7, v/v)溶液作為提取溶劑。

2.3.2凈化劑的選擇

PSA、C18以及Alumina-N(中性氧化鋁)是QuEChERS方法中常用的分散固相凈化劑(DSPE)。本文考察了這3類凈化劑經(jīng)不同組合后的凈化效果,回收率如圖3所示,RSD≤13.80%(n=6)。在分別考察了10組不同的DSPE方案后發(fā)現(xiàn),C18吸附性過強(qiáng),在吸附雜質(zhì)的同時也吸附了目標(biāo)化合物,從而造成目標(biāo)化合物的回收率大大降低;而采用50 m/L PSA+50 g/L Alumina-N(見圖3中第5組)時,基質(zhì)干擾降低,保證了6個目標(biāo)化合物均有較高的回收率。

圖3 不同DSPE組合下6種球蟲藥物的回收率Fig.3 Recoveries of the six anticoccidials with different DSPE combination groups Group 1: no DSPE; Group 2: 50 mg C18; Group 3: 50 mg PSA; Group 4: 50 mg Alumina-N; Group 5: 50 mg PSA+50 mg Alumina-N; Group 6: 25 mg C18+25 mg Alumina-N; Group 7: 25 mg C18+25 mg Alumina-N+50 mg Alumina-N; Group 8: 25 mg C18+50 mg PSA; Group 9: 50 mg C18+25 mg Alumina-N; Group 10: 50 mg C18+25 mg PSA; Group 11: 50 mg C18+50 mg PSA+25 mg Alumina-N.

表2 6種球蟲藥物的線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)及定量限

y: peak area;x: mass concentration, μg/L.

2.4 線性關(guān)系與定量限

配制不同濃度的混合基質(zhì)加標(biāo)工作液,在優(yōu)化后的實驗條件下進(jìn)行測定,通過對相應(yīng)化合物在質(zhì)譜中的響應(yīng)面積(y)與目標(biāo)化合物的標(biāo)記濃度值(x/(μg/L))進(jìn)行線性擬合,得到6種目標(biāo)化合物的線性范圍及其相應(yīng)的線性相關(guān)系數(shù)(R)。本研究中,各化合物的R值均不小于0.998。由于高分辨率質(zhì)譜儀基線極低,信噪比值不再適用于確定定量限,故本方法中定量限為化合物線性范圍中滿足回收率值在60%～120%區(qū)間內(nèi)的最低濃度(見表2)。

2.5 方法的精密度與回收率

在空白樣品中分別添加低、中、高3個水平的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,在優(yōu)化的實驗條件下目標(biāo)化合物的回收率在67.7%～126.8%之間,RSD≤10.4%(n=6)(見表3),可滿足實際分析的要求。

表3 空白基質(zhì)中3個添加水平下6種抗球蟲藥物的回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=6)

2.6 實際樣品

采用本方法對市場上隨機(jī)抽取的7份雞肉樣品中的6種抗球蟲藥物進(jìn)行檢測,未發(fā)現(xiàn)陽性樣品。

3 結(jié)論

為順應(yīng)獸藥殘留檢測快速、簡便、準(zhǔn)確以及高通量的發(fā)展趨勢[22],本研究將高分辨質(zhì)譜儀與快速前處理方法相結(jié)合,建立了一種用于雞肉基質(zhì)中6種抗球蟲藥物的檢測方法。使用UPLC-Q Exactive高分辨質(zhì)譜儀,通過實時正、負(fù)離子切換的模式實現(xiàn)了6種目標(biāo)化合物的同時檢測。同時,通過改進(jìn)QuEChERS方法建立了雞肉中6種分析物的快速凈化方法。該方法操作簡便,靈敏度高,可滿足日常檢測要求。

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Determination of six anticoccidials in chicken using QuEChERS combined with ultra high liquid chromatography-high resolution mass spectrometry

MUHAREM Muhteber1, YAN Hua2, XU Shan2, FENG Nan3, HAO Jie3, ZHU Chenqi1, GUO Shuang1, ZHANG Zhaohui2, HAN Nanyin1*

(1.SchoolofPharmaceuticalScience,PekingUniversity,Beijing100191,China; 2.InspectionandQuarantineTestingCenter,BeijingEntry-ExitInspectionandQuarantineBureau,Beijing100026,China; 3.BeijingMunicipalCenterforFoodSafetyMonitoringandRiskAssessment,Beijing100041,China)

An ultra high liquid chromatography-Q Exactive orbitrap mass spectrometry multi-residue method has been developed for the determination of six anticoccidials residues (dinitlmide, nicarbazin, diclazuril, toltrazuril, monensin and salinomycin) in chicken tissue. Sample preparation was based on QuEChERS method, using 1% (v/v) trichloroacetic acid/acetonitrile aqueous solution (3∶7, v/v) as the extraction solvent and salting-out with sodium chloride followed by clean-up with 50 mg/mL primary secondary amine (PSA)+50 mg/mL neutral alumina (Alumina-N) dispersive solid phase extraction (DSPE). The separation of the compounds in liquid chromatography was carried out using a Waters Acquity UPLC?BEH C8 column (100 mm×2.1 mm, 1.7 μm) with mobile phases consisting of methanol-5 mmol/L ammonium acetate aqueous solution in gradient elution. The Q Exactive orbitrap mass spectrometric detection was carried out with positive and negative electrospray ionization simultaneously. The results showed the linear ranges of the six target compounds were as follows: dinitolmide, 1.0-30.0 μg/L; nicarbazin, 0.2-6.0 μg/L; diclazuril and toltrazuril, 2.0-60.0 μg/L; monensin and salinomycin, 4.0-120.0 μg/L. The external standard method was used for quantification. The spiked recoveries at three levels for the six anticoccidials ranged from 67.7% to 126.8%. The relative standard deviations (RSDs) were ≤10.4%. The limits of quantification (LOQs) were as follows: dinitolmide, 2.50 μg/kg; nicarbazin, 0.50 μg/kg; diclazuril and toltrazuril, 5.00 μg/kg; monensin and salinomycin, 20.00 μg/kg. The developed method is easy of operation and of high sensitivity. It can meet the requirements of daily inspection.

QuEChERS; ultra high liquid chromatography-high resolution mass spectrometry; anticoccidials; chicken

10.3724/SP.J.1123.2015.06016

北京市科委重大項目(D151100003815002).

2015-06-10

O658

:A

:1000-8713(2015)11-1199-06

*通訊聯(lián)系人.Tel:(010)82805957,E-mail:nanyin.han@pku.edu.cn.