呂雅瑤, 郝斐然, 王歡歡, 付 斌, 錢小紅, 張養(yǎng)軍

(蛋白質(zhì)組學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 北京蛋白質(zhì)組研究中心, 軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射與輻射醫(yī)學(xué)研究所, 北京 102206)

研究論文

一種多通道勻漿裝填毛細(xì)管色譜柱的新裝置及應(yīng)用

呂雅瑤, 郝斐然, 王歡歡, 付 斌, 錢小紅, 張養(yǎng)軍*

(蛋白質(zhì)組學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 北京蛋白質(zhì)組研究中心, 軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射與輻射醫(yī)學(xué)研究所, 北京 102206)

針對(duì)目前毛細(xì)管色譜柱裝柱效率低、不同批次裝填的毛細(xì)管色譜柱之間性能差異大的問題,我們發(fā)展了一種多通道勻漿裝填毛細(xì)管色譜柱的新裝置。該裝置以液相色譜泵提供壓力、采用磁力攪拌保持勻漿液均勻分散,一次可裝填多達(dá)6根毛細(xì)管色譜柱。以牛血清白蛋白(BSA)的胰蛋白酶酶切肽段混合物為樣本,選擇峰容量、蛋白覆蓋率、3個(gè)特定離子的保留時(shí)間以及毛細(xì)管色譜柱柱壓為指標(biāo),在毛細(xì)管液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng)上對(duì)裝填的反相毛細(xì)管色譜柱的性能進(jìn)行了評(píng)價(jià)。分別考察了一次裝填的6根毛細(xì)管色譜柱、兩次裝填的12根毛細(xì)管色譜柱以及一次裝填1根與一次裝填6根毛細(xì)管色譜柱的性能及穩(wěn)定性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:同一批次裝填的6根毛細(xì)管色譜柱的性能相近;不同批次裝填的12根毛細(xì)管色譜柱的峰容量和覆蓋率沒有明顯的區(qū)別,但保留時(shí)間和毛細(xì)管色譜柱柱壓的穩(wěn)定性較差;一次裝填1根和一次裝填6根毛細(xì)管色譜柱柱性能的穩(wěn)定性與兩次分別裝填6根毛細(xì)管色譜柱的穩(wěn)定性相近,即采用本裝置可顯著提高毛細(xì)管色譜柱的裝填效率且每次裝填毛細(xì)管色譜柱的數(shù)量不會(huì)對(duì)柱性能產(chǎn)生影響。

毛細(xì)管液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用;毛細(xì)管色譜柱;裝柱裝置;多通道

目前,液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)已經(jīng)成為復(fù)雜生物樣本中多肽、蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)組定性鑒定和定量分析的常用方法。由于生物樣品中生物大分子組成的極端復(fù)雜性,如組成種類繁多、動(dòng)態(tài)范圍寬,毛細(xì)管液相色譜的高效分離已經(jīng)成為液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析中的關(guān)鍵步驟[1,2]。大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室都是自己裝填毛細(xì)管色譜柱以滿足他們的不同需求,因此毛細(xì)管色譜柱的裝柱技術(shù)已經(jīng)成為一般實(shí)驗(yàn)室的必備技術(shù)。毛細(xì)管色譜柱的填充方法主要有電動(dòng)填充方法[3-5]、氣壓勻漿裝填方法[5]和液壓勻漿裝填方法[5-7]。電動(dòng)填充方法是基于填料與溶劑表面接觸時(shí),填料顆粒表面常常會(huì)帶一定量的電荷,在高壓電場的作用下,填料顆粒定向遷移進(jìn)入毛細(xì)管,實(shí)現(xiàn)裝填毛細(xì)管色譜柱的目的[3]。該方法的優(yōu)點(diǎn)是填充的毛細(xì)管色譜柱的柱床比較致密,但設(shè)備復(fù)雜,成本高。氣壓勻漿裝填方法采用高壓氮?dú)馄刻峁毫⑻盍系膭驖{液壓入毛細(xì)管柱中,這種方法可以滿足長度為20 cm左右,裝填3 μm或5 μm粒徑顆粒填料的毛細(xì)管色譜柱,可滿足一般生物樣本中蛋白質(zhì)組定性和定量分析的需求。但要滿足目前提出的蛋白質(zhì)組深度覆蓋和準(zhǔn)確定量分析的需求,則需要裝填更長的毛細(xì)管色譜柱(3 μm或5 μm粒徑顆粒填料)[8]或裝填長度約為20 cm的毛細(xì)管色譜柱(亞2 μm填料)[9-11]。對(duì)于裝填這類毛細(xì)管色譜柱,氣壓勻漿裝填方法(一般采用的氮?dú)怃撈康膲毫Σ怀^25 MPa)不能滿足要求,為此,研究人員發(fā)展了一種液壓勻漿裝填毛細(xì)管色譜柱的方法,即由高壓色譜泵提供壓力,與勻漿罐連接實(shí)現(xiàn)毛細(xì)管色譜柱高效快速的裝填[12]。但目前采用這種裝填方法一次僅能裝填1根毛細(xì)管色譜柱,裝柱效率低,不能滿足毛細(xì)管高效液相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)快速發(fā)展和使用的需求。另外,不同批次裝填的毛細(xì)管色譜柱的性能穩(wěn)定性不易保證。針對(duì)以上問題,根據(jù)帕斯卡原理(即液相色譜泵輸入勻漿罐的壓強(qiáng)可大小不變地傳輸?shù)絼驖{罐內(nèi)部的各點(diǎn)),我們發(fā)展了一種以液相色譜泵提供壓力,連接帶有磁力攪拌的六通道勻漿裝填毛細(xì)管色譜柱的新裝置(6個(gè)裝柱通道分別位于勻漿罐的6個(gè)側(cè)面的同一水平高度)。使用本裝置具有如下優(yōu)點(diǎn):(1)可同時(shí)裝填最多6根毛細(xì)管色譜柱,具有高的裝填效率;(2)可有效減小不同批次裝填色譜柱帶來的穩(wěn)定性差的問題;(3)兼具了每次僅裝填1根毛細(xì)管色譜柱裝置的功能,且沒有增加額外的成本;(4)與每次僅裝填1根毛細(xì)管色譜柱裝置的裝填方法相同,易于掌握和推廣。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器、試劑與材料

納升級(jí)液相色譜(NanoLC-2D, Eksigent Technologies公司,美國)-電噴霧-線性離子阱質(zhì)譜儀(ESI-LTQ MS, ThermoFisher Scientific公司,美國);液相色譜泵(ThermoFisher Scientific公司,美國);磁力攪拌器(海辰科瑞機(jī)電設(shè)備有限公司,北京);真空冰凍干燥機(jī)(SC100A Speedvac Plus, Thermo Savant公司,美國);高速離心機(jī)(ThermoFisher Scientific公司,美國); Milli-Q A10型純水儀(Millipore公司,美國); 15 cm×75 μm直噴頭空管柱(New Objective公司,美國);直徑3 μm、孔徑10 nm的十八烷基硅膠(ODS)填料(金歐亞公司,北京)。

牛血清白蛋白(BSA)購自北京迪拜爾生物技術(shù)有限公司;測序級(jí)胰蛋白酶購于美國Promega公司;二硫蘇糖醇(DTT)、碘乙酰胺(IAA)、碳酸氫銨、甲醇、乙腈購自美國Sigma公司;乙醇、異丙醇、氯仿購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 色譜柱裝填條件

1.2.1勻漿溶劑的選擇

平行稱取6份2.5 mg粒徑3 μm的ODS填料分別加入6個(gè)1.5 mL塑料離心管中,依次編號(hào)為1、2、3、4、5和6,分別在1～6號(hào)管中加入750 μL分析純的甲醇、乙醇、異丙醇、乙腈、水、氯仿,渦旋30 s,使其均勻分散,靜置10 min后觀察填料沉降狀態(tài),以沉降速度作為勻漿溶劑選擇的依據(jù)之一。

1.2.2磁攪拌條件的選擇

稱取10 mg粒徑3 μm的ODS填料置于4 mL塑料離心管中,并在其中放入工程塑料包埋鐵棒制作的磁子,剩余體積用甲醇補(bǔ)滿后蓋緊離心管蓋。將離心管豎直放置在磁力攪拌器上,將磁力攪拌器打開并逐漸升到最大功率檔位,在30 min內(nèi)持續(xù)觀察填料沉降狀態(tài),依據(jù)勻漿液的分散程度確定最佳攪拌速度。

1.3 多通道勻漿裝填毛細(xì)管色譜柱裝置的設(shè)計(jì)和制造

如圖1a所示,多通道勻漿裝填毛細(xì)管色譜柱的裝柱罐包括勻漿罐(1)、勻漿罐蓋(2)、連接管(3)、固定螺母(4)和固定螺母(5)以及毛細(xì)管色譜柱空管(6)。其中勻漿罐是由不銹鋼加工而成的一個(gè)正六方體,其高為39 mm,平行平面間距為54 mm。其內(nèi)部為盛放色譜填料勻漿液的腔體(7)(高為18 mm,直徑為12 mm,體積為2 mL)(如圖1b所示);六面體的每一面都有一個(gè)陰性孔與腔體連通,其位置在距腔體底部以上10 mm;在腔體(7)中放一個(gè)磁子(8);勻漿罐蓋(2)由不銹鋼加工而成,其上有與固定螺母(4)連接的陰性孔,與勻漿罐(1)之間通過圓形聚四氟乙烯密封墊實(shí)現(xiàn)密封;連接管(3)為能夠耐受40 MPa以上壓力的不銹鋼管或工程塑料管,其中一端與勻漿罐蓋(2)連接,另一端與高壓色譜泵連接,且高壓色譜泵能夠提供大于40 MPa的壓力;固定螺母(4)和(5)配套有錐形不銹鋼墊圈或錐形工程塑料墊圈以及固定毛細(xì)管和毛細(xì)管色譜柱的工程塑料套管;毛細(xì)管色譜柱空管(6)為內(nèi)徑小于0.3 mm,外徑略小于毛細(xì)管工程塑料管內(nèi)徑且能耐受40 MPa壓力的玻璃毛細(xì)管。按此設(shè)計(jì)加工和組裝,圖1c為由勻漿罐、液相色譜泵、儲(chǔ)液罐和磁力攪拌器組裝的多通道勻漿裝填毛細(xì)管色譜柱裝置的實(shí)物照片。

圖1 多通道勻漿裝填毛細(xì)管色譜柱新裝置的(a)整體結(jié)構(gòu)示意圖、(b)剖面結(jié)構(gòu)示意圖和(c)裝置的實(shí)物照片F(xiàn)ig.1 (a) A schematic diagram, (b) a cross-sectional diagram and (c) a photo of a multiple-channel can for packing capillary chromatographic column 1. multiple-channel can； 2. lid of multiple-channel can； 3. tube； 4. nut； 5. nut； 6. capillary chromatographic column； 7. cavity of multiple-channel can； 8. magnetic stick.

1.4 毛細(xì)管色譜柱的裝填及性能評(píng)價(jià)

首先選取需要裝填的毛細(xì)管色譜柱空管和個(gè)數(shù),將其分別固定于勻漿罐的任意一個(gè)陰性孔上。如果裝填的毛細(xì)管色譜柱少于6根,剩余的陰性孔用堵頭封閉。然后選擇需要裝填的色譜填料,用勻漿試劑將其配制成勻漿液并轉(zhuǎn)移到勻漿罐的圓柱形腔體中,放入磁子,裝上勻漿罐蓋后,將勻漿罐放在磁攪拌器上,調(diào)節(jié)磁子轉(zhuǎn)速到適當(dāng)大小對(duì)勻漿液進(jìn)行攪拌。通過連接管將勻漿罐與高壓色譜泵連接后,打開色譜泵電源開關(guān),調(diào)節(jié)流動(dòng)相的流速,流動(dòng)相攜帶色譜填料進(jìn)入毛細(xì)管色譜柱,等待色譜柱裝填到需要的長度后,關(guān)閉高壓色譜泵,使裝填系統(tǒng)壓力與大氣壓平衡后,卸下毛細(xì)管色譜柱,對(duì)其性能進(jìn)行測試和評(píng)價(jià)。

采用上述方法分別裝填了3批毛細(xì)管色譜柱,其中2批分別裝填6根毛細(xì)管色譜柱(其中1批柱編號(hào)分別為0403-1、0403-2、0403-3、0403-4、0403-5、0403-6,另1批柱編號(hào)分別為0407-1、0407-2、0407-3、0407-4、0407-5、0407-6。另外一次裝填1根毛細(xì)管色譜柱的編號(hào)為0410。在液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng)上對(duì)這些毛細(xì)管色譜柱的性能進(jìn)行評(píng)價(jià),主要考察同批次裝填的6根毛細(xì)管色譜柱性能的穩(wěn)定性、不同批次裝填的色譜柱性能的穩(wěn)定性以及一次裝填1根毛細(xì)管色譜柱與一批裝填6根毛細(xì)管色譜柱性能的穩(wěn)定性。在比較之前,選擇1批裝填的任1根毛細(xì)管色譜柱重復(fù)分離1個(gè)樣品6次,以其在液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng)上的性能結(jié)果作為參考來評(píng)價(jià)不同毛細(xì)管色譜柱的性能。

1.5 樣品前處理

取100 mg BSA,以50 mmol/L碳酸氫銨溶液溶解至終濃度為1 mg/mL,加入DTT(終濃度為10 mmol/L),在37 ℃恒溫箱中放置4 h。再加入碘乙酰胺(終濃度為50 mmol/L),暗處放置1 h。按照胰蛋白酶與BSA的質(zhì)量比為1∶50加入胰蛋白酶,在37 ℃下酶切18 h,用C18柱脫鹽,冷凍干燥后用流動(dòng)相A液復(fù)溶,并使肽段終濃度為1 μg/μL。

1.6 儀器條件

1.6.1色譜條件

所用帶噴頭的毛細(xì)管色譜柱的規(guī)格為15 cm×75 μm,裝填的全多孔型反相色譜填料的粒徑為3 μm,孔徑為10 nm。在NanoLC-2D毛細(xì)管液相色譜儀上對(duì)毛細(xì)管反相色譜柱的性能進(jìn)行評(píng)價(jià)。流動(dòng)相A為2%(v/v)乙腈和0.1%(v/v)甲酸的水溶液,流動(dòng)相B為98%(v/v)乙腈和0.1%(v/v)甲酸的水溶液;梯度洗脫程序:0～5 min, 5%B～8%B; 5～30 min, 8%B～40%B; 30～35 min, 40%B～95%B; 35～40 min, 95%B; 40～42 min, 95%B～5%B; 42～52 min, 5%B。流動(dòng)相流速為300 nL/min。

1.6.2質(zhì)譜采集條件

液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析時(shí),選用電噴霧離子源、正離子模式采集數(shù)據(jù),毛細(xì)管溫度設(shè)定為180 ℃,質(zhì)譜掃描范圍設(shè)為m/z400.0～1 600.0,采集時(shí)間設(shè)為52 min。采用數(shù)據(jù)依賴模式(DDA)進(jìn)行串聯(lián)質(zhì)譜分析,選取一級(jí)質(zhì)譜中10個(gè)信號(hào)最強(qiáng)的離子進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜分析,其碰撞能量設(shè)為35%,采用動(dòng)態(tài)排除功能(dynamic exclusion),排除時(shí)間為30 s。

1.7 質(zhì)譜數(shù)據(jù)處理

將質(zhì)譜采集后產(chǎn)生的raw文件通過Thermo Proteome Discoverer軟件(版本號(hào)1.3.0.339, ThermoFisher Scientific公司,美國)對(duì)質(zhì)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行檢索,其參數(shù)設(shè)置:母離子質(zhì)量偏差(precursor tolerance)為0.5 Da;碎片離子質(zhì)量偏差(fragment tolerance)為0.8 Da;假陽性率(FDR)為1%;蛋白質(zhì)酶解選用胰蛋白酶,選擇2個(gè)漏切位點(diǎn);固定修飾:半胱氨酸的烷基化修飾;可變修飾:甲硫氨酸氧化修飾;蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫為牛血清白蛋白數(shù)據(jù)庫(2015年2月30日從http://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/?term=bsa下載)。

2 結(jié)果與討論

2.1 勻漿溶劑的選擇

填料在溶劑中沉降的速率公式為[5]:

式中:V代表填料顆粒沉降速度(cm/s),g為重力加速度(cm/s2),d為填料顆粒直徑(cm),ρ為填料顆粒密度(g/cm3),ρo為液體密度(g/cm3),η為液體的黏度(mPa5s)。

為了保證毛細(xì)管柱填充均勻致密,首先應(yīng)使懸浮液盡量穩(wěn)定,防止在色譜柱填充過程中填料顆粒分級(jí)沉淀。從以上公式可以看出,對(duì)某一種粒徑的填料可以通過兩種方法來減小其沉降速度:一是選擇溶劑密度與填料顆粒密度相近的溶劑;二是選擇溶劑黏度系數(shù)較大的溶劑。另外,選取極性和填料相近的溶劑也能使填料較好地潤濕和分散在勻漿液中。同時(shí),還需要從實(shí)驗(yàn)者安全角度及溶劑成本考慮,選取毒性小、價(jià)格便宜的溶劑配制勻漿?；诖?我們選擇了6種溶劑(見表1)進(jìn)行試驗(yàn)，考察6種溶劑對(duì)3 μm ODS填料的懸浮液渦旋混勻后放置10 min后的分散狀態(tài)，由圖2可見填料在氯仿中分散均勻,但是考慮到其毒性以及對(duì)裝置中使用的塑料部件所具有的溶解作用,不能選擇氯仿作為勻漿溶劑;水由于極性大,無法分散填料;乙醇、異丙醇對(duì)填料的分散狀態(tài)稍好于甲醇、乙腈,但由于它們的黏度大,裝柱時(shí)產(chǎn)生的壓力大;而乙腈的價(jià)格較甲醇高,故選擇甲醇作為勻漿溶劑裝填毛細(xì)管色譜柱。

表1 6種勻漿溶劑的黏度和密度

圖2 3 μm ODS填料分散在不同溶劑中的分散狀態(tài)Fig.2 Suspended states of 3 μm ODS in different solvents Solvents: 1. methanol; 2. ethanol; 3. isopropanol; 4. acetonitrile; 5. water; 6. chloroform.

2.2 磁力攪拌條件的選擇

逐漸增加磁力攪拌器的功率檔,在最大功率檔攪拌勻漿液,持續(xù)觀察30 min,勻漿液一直維持均勻分散狀態(tài),說明在磁力攪拌條件下,甲醇能夠均勻分散ODS填料,可以滿足毛細(xì)管色譜柱裝柱時(shí)對(duì)勻漿液的要求。

2.3 毛細(xì)管色譜柱的性能評(píng)價(jià)

2.3.1同批次裝填的毛細(xì)管色譜柱的穩(wěn)定性

以本裝置1次裝填了6根毛細(xì)管色譜柱,從中隨機(jī)選取1根毛細(xì)管色譜柱,在液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng)上分別對(duì)BSA酶切肽段混合物進(jìn)行6次色譜分離分析,對(duì)柱效、保留時(shí)間及柱壓的穩(wěn)定性進(jìn)行考察,并以此作為比較同一批次裝填的6根色譜柱的柱效和保留時(shí)間穩(wěn)定性的參考。

圖3為采用同一根色譜柱重復(fù)6次色譜分離BSA酶切肽段混合物的基峰總離子流色譜圖,表2為圖3中的峰容量以及軟件搜庫后的覆蓋率。另外,在總離子流色譜圖中出峰時(shí)間前、中和后3個(gè)位置提取m/z722.95、m/z653.90、m/z582.71 3個(gè)信號(hào)強(qiáng)度較強(qiáng)的離子色譜峰,分別比較6次色譜分離的保留時(shí)間,結(jié)果如表3所示。以相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)表示其離散程度:峰容量的RSD=7.3%;覆蓋率的RSD=5.3%;m/z722.95峰保留時(shí)間的RSD=0.9%,m/z653.90峰保留時(shí)間的RSD=0.3%,m/z582.71峰保留時(shí)間的RSD=0.5%。從表2和表3的結(jié)果可知,由于液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析過程中受隨機(jī)因素的影響,即使采用一根毛細(xì)管色譜柱重復(fù)分離同一樣品,其峰容量、蛋白覆蓋率及保留時(shí)間也會(huì)有一定的波動(dòng)。我們將此結(jié)果作為評(píng)價(jià)同一批次裝填的6根毛細(xì)管柱穩(wěn)定性的參考。

圖3 同一根色譜柱重復(fù)6次分離BSA酶切肽段混合物的基峰總離子流色譜圖Fig.3 Base peak chromatograms of the separation for six times on the capillary chromatographic column of a peptide mixture digested from BSA

表2 同一根色譜柱重復(fù)6次分離鑒定BSA酶切肽段混合物的峰容量及覆蓋率比較

2.3.2同批次裝填的6根毛細(xì)管色譜柱的性能

圖4為0407-1、0407-2、0407-3、0407-4、0407-5和0407-6毛細(xì)管色譜柱分離BSA酶切肽段混合物的基峰總離子流色譜圖;表4和表5分別列出了其峰容量、覆蓋率和從總離子流色譜圖中提取的m/z722.95、m/z653.90、m/z582.71 3個(gè)離子的保留時(shí)間;圖5為各毛細(xì)管色譜柱分離樣品時(shí)的壓力曲線。從表4和表5可知,峰容量的RSD=7.1%;覆蓋率的RSD=3.8%;m/z722.95峰保留時(shí)間的RSD=6.0%,m/z653.90峰保留時(shí)間的RSD=2.7%,m/z582.71峰保留時(shí)間的RSD=4.2%;從圖5可知,在液相色譜分離的有效梯度時(shí)間內(nèi)(即5～30min)0407系列毛細(xì)管色譜柱的柱壓范圍為(11.5±1.5) MPa。

表3 1根色譜柱重復(fù)6次分離中3個(gè)離子的保留時(shí)間的重復(fù)性

圖4 0407系列毛細(xì)管色譜柱(0407-1～0407-6)分離BSA酶切肽段混合物的基峰總離子流色譜圖Fig.4 Base peak chromatograms of the separation of a peptide mixture digested from BSA on the capillary chromatographic columns denoted as 0407-1-0407-6

表4 0407系列毛細(xì)管色譜柱(0407-1～0407-6)分離鑒定BSA酶切物的峰容量及覆蓋率比較

相對(duì)于以1根毛細(xì)管色譜柱重復(fù)6次分離同一樣品的分離結(jié)果,0407系列6根毛細(xì)管色譜柱分離樣品保留時(shí)間的RSD值與前者最大差異為8倍,柱壓波動(dòng)范圍為±12.9%,峰容量的RSD值比前者小2.7%,覆蓋率的RSD值比前者小28.3%。由此得出結(jié)論,同一批次裝填的6根毛細(xì)管色譜柱雖然保留時(shí)間和柱壓有所差異,但柱效基本一致。

2.3.3不同批次裝填的12根毛細(xì)管色譜柱的性能

以0403系列毛細(xì)管色譜柱分離BSA酶切肽段混合物,類似于2.3.2節(jié)中0407系列毛細(xì)管色譜柱的柱效分析。通過對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析,0403-1～0403-6系列色譜柱的覆蓋率依次為53.34%、54.55%、51.80%、44.94%、55.57%、56.26%,以Grubbs法判斷,44.94%這個(gè)數(shù)值應(yīng)舍去(置信度95%),其他數(shù)據(jù)平均值54.30%;峰容量依次為33、33、34、29(舍去)、35、34,平均值為33.8;m/z722.95的保留時(shí)間依次為16.91、16.58、15.91、14.63、13.11、12.84 min,平均值15.00 min;m/z653.90的保留時(shí)間依次為21.51、22.57、23.63、19.67、18.79、20.24 min,平均值21.07 min;m/z582.71的保留時(shí)間依次為25.72、26.67、28.22、23.60、23.10、25.55 min,平均值25.48 min;在液相色譜分離的有效梯度時(shí)間內(nèi)(即5～30 min),0403系列毛細(xì)管色譜柱的柱壓范圍為(19.2±1.9) MPa。表6和表7分別列出了0403系列毛細(xì)管色譜柱和0407系列毛細(xì)管色譜柱峰容量、蛋白覆蓋率和保留時(shí)間的對(duì)比結(jié)果。

表5 0407系列毛細(xì)管色譜柱(0407-1～0407-6)分離BSA酶切物的3個(gè)離子保留時(shí)間的比較

圖5 0407系列毛細(xì)管色譜柱(0407-1～0407-6)分離 BSA酶切肽段混合物的柱壓曲線圖Fig.5 Column pressure diagrams of the separation of a peptide mixture digested from BSA on the capillary chromatographic columns denoted as 0407-1-0407-6

表6 0407和0403兩批次裝填的色譜柱分離鑒定BSA酶切物的峰容量及覆蓋率比較

表7 0407和0403兩批次裝填的色譜柱分離BSA酶切物的3個(gè)離子的保留時(shí)間比較

從以上結(jié)果看出,0403系列毛細(xì)管色譜柱和0407系列毛細(xì)管色譜柱之間的穩(wěn)定性與0407系列6根毛細(xì)管色譜柱之間的穩(wěn)定性比較,前者保留時(shí)間的RSD值比后者最大相差3.6倍,峰容量的RSD值比后者大87.3%,覆蓋率的RSD值比后者大39.5%,兩批次裝填的毛細(xì)管色譜柱的柱壓相差49.8%,其波動(dòng)范圍是同一批次毛細(xì)管色譜柱之間的柱壓波動(dòng)的3.9倍。即兩批毛細(xì)管色譜柱的保留時(shí)間和柱壓存在較大差異,且二者的峰容量和覆蓋率差異都明顯大于同一批次裝填的毛細(xì)管色譜柱之間的差異。由此得出結(jié)論,不同批次裝填的毛細(xì)管色譜柱的性能的一致性要差于同一批次色譜柱柱效的一致性。產(chǎn)生這種現(xiàn)象的主要原因是:在開始裝填毛細(xì)管色譜柱時(shí),隨著溶劑攜帶填料進(jìn)入毛細(xì)管柱并在噴頭處形成篩板,由于各個(gè)商品化的空毛細(xì)管柱噴頭內(nèi)徑不完全一致,篩板的形成方式各不相同,造成毛細(xì)管色譜柱柱壓不同,進(jìn)一步造成填料在毛細(xì)管柱中的堆積方式不同;另外,在毛細(xì)管色譜柱裝填過程中,隨著毛細(xì)管色譜柱裝填長度的增加,為使壓力不至于超過液相色譜泵能提供的最大壓力,需要通過調(diào)節(jié)溶劑流速來控制壓力,但由于不同批次裝填的毛細(xì)管柱的篩板形成情況、壓力變化不會(huì)完全一樣,流速調(diào)節(jié)過程也不同,這樣就導(dǎo)致了不同批次裝填的毛細(xì)管色譜柱的填料逐漸堆積方式有所不同,導(dǎo)致其色譜性能的一致性要差于同一批次色譜柱柱效的一致性。

2.3.4比較一次裝填1根毛細(xì)管色譜柱和一次裝填6根毛細(xì)管色譜柱的性能

0410毛細(xì)管色譜柱分離BSA酶切肽段混合物的峰容量為30，覆蓋率為53.08%,3個(gè)特定離子(m/z722.95、653.90、582.71)的保留時(shí)間分別為12.88、18.08、21.72 min,柱壓為16.1 MPa。

將0410毛細(xì)管色譜柱與0407系列毛細(xì)管色譜柱的性能進(jìn)行比較,二者之間峰容量的RSD=4.9%,覆蓋率的RSD=3.8%, 3個(gè)離子保留時(shí)間的RSD分別為5.8%、1.6%和0.5%,其值小于兩批次裝填的毛細(xì)管色譜柱峰容量、覆蓋率及保留時(shí)間的RSD。再將0410毛細(xì)管色譜柱與0403系列毛細(xì)管色譜柱的性能進(jìn)行比較,二者之間峰容量的RSD=8.5%,覆蓋率的RSD=1.7%, 3個(gè)離子保留時(shí)間的RSD分別為10.8%、10.9%和11.3%,其值不大于兩批次裝填的毛細(xì)管色譜柱峰容量、覆蓋率及保留時(shí)間的RSD。0410毛細(xì)管色譜柱與0407系列毛細(xì)管色譜柱的柱壓相差33.2%,二者柱壓之間的差別小于兩批次裝填毛細(xì)管色譜柱之間柱壓的差別。即以我們?cè)O(shè)計(jì)的多通道勻漿裝填毛細(xì)管色譜柱的新裝置一次裝填1根與一次裝填6根毛細(xì)管色譜柱的性能沒有明顯的區(qū)別。以上結(jié)果表明,批量裝填毛細(xì)管色譜柱比一次僅裝填1根毛細(xì)管色譜柱具有優(yōu)勢。

3 結(jié)論

本文發(fā)展了一種多通道勻漿裝填毛細(xì)管色譜柱的新裝置,采用該裝置可顯著提高毛細(xì)管色譜柱的裝填效率。通過對(duì)該裝置使用條件的優(yōu)化,采用牛血清白蛋白的胰蛋白酶酶切肽段混合物為樣本,以峰容量、蛋白覆蓋率、保留時(shí)間和柱壓為指標(biāo),對(duì)本裝置同時(shí)以及不同批次裝填的毛細(xì)管色譜柱的性能進(jìn)行評(píng)價(jià)和比較,實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明同一批次裝填的毛細(xì)管色譜柱的性能相近;不同批次裝填的毛細(xì)管色譜柱以及一次裝填1根和一次裝填6根毛細(xì)管色譜柱的峰容量和覆蓋率沒有明顯的區(qū)別,但保留時(shí)間和柱壓相差較大。這些結(jié)果將為實(shí)際應(yīng)用中毛細(xì)管色譜柱的選擇和使用提供參考。

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A novel multiple-channel apparatus for packing capillary chromatographic column and its application

(1.DivisionofChemicalMetrologyandAnalyticalScience,NationalInstituteofMetrology,Beijing100029,China; 2.PolytechInstrument,Beijing100095,China)

Lü Yayao, HAO Feiran, WANG Huanhuan, FU Bin, QIAN Xiaohong, ZHANG Yangjun*(StateKeyLaboratoryofProteomics,BeijingProteomeResearchCenter,BeijingInstituteofRadiationMedicine,Beijing102206,China)

A novel multiple-channel apparatus for packing capillary chromatographic column was designed and manufactured for packing six capillary chromatographic columns with close column efficiency at the same time. Briefly, it consists of a magnetic stirrer, a liquid chromatographic pump and a multiple-channel can. The reagents used for preparing ODS (C18) slurry and stirring condition of the magnetic stirrer were optimized in the study. Two batches of capillary chromatographic columns were packed under the optimum condition, and these packed capillary chromatographic columns were evaluated in the terms of peak capacity, sequence coverage, retention times of three peptide ions and column pressure using the tryptic digest of a bovine serum albumin (BSA) and detected by LC-MS in electrospray ionization (ESI) mode. The experimental results showed that the six capillary chromatographic columns packed at the same time had close column efficiencies, however, the column efficiencies of twelve capillary chromatographic columns packed at two times were significantly different. In addition, there was no significant column efficiency difference when packing one or six capillary chromatographic columns at the same time. The multiple-channel apparatus designed by us is simple, time-saving, and can be applied to pack capillary chromatographic columns with similar column efficiencies, thus it is of evident advantage over traditional one-channel apparatus.

capillary liquid chromatography-mass spectrometry (CLC-MS); capillary chromatographic column; packing column apparatus; multiple-channel

10.3724/SP.J.1123.2015.06021

國家重大科學(xué)計(jì)劃項(xiàng)目(2012CB910603);國家高技術(shù)研究發(fā)展規(guī)劃項(xiàng)目(2012AA020202);國家重大科學(xué)儀器設(shè)備開發(fā)專項(xiàng)項(xiàng)目(2012YQ12004407,2011YQ030139,2011YQ06008408,2013YQ14040506);國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(21275519,20735005,31100591).

2015-06-16

O658

:A

:1000-8713(2015)11-1155-08

*通訊聯(lián)系人.Tel:(010)80727777-1142,E-mail:13683167093@163.com.