于 芳，郭棟才，于海洋，劉莎莎，何宇鵬

（遼寧石油化工大學(xué) 化學(xué)與材料科學(xué)學(xué)院， 遼寧 撫順 113001）

科研與開(kāi)發(fā)

生物酰化酶Ι(acylaseΙ)對(duì)溴代苯丙氨酸手性拆分的研究

于 芳，郭棟才，于海洋，劉莎莎，何宇鵬

（遼寧石油化工大學(xué) 化學(xué)與材料科學(xué)學(xué)院， 遼寧 撫順 113001）

利用生物?；?Ι (acylase Ι)可以選擇性的切除S-型苯丙氨酸上酰胺鍵的特點(diǎn)，高效快捷的對(duì)外消旋溴代苯丙氨酸進(jìn)行手性拆分，成功的分離得到了互為異構(gòu)體的溴代苯丙氨酸鹽酸鹽，并使用了核磁共振、高分辨質(zhì)譜和旋光值對(duì)結(jié)果進(jìn)行了表征，為含有苯丙氨酸衍生物結(jié)構(gòu)的天然產(chǎn)物分子和藥物分子的合成提供了一個(gè)高效便捷的路線。

?；?Ι；溴代苯丙氨酸；手性拆分

目前，非天然氨基酸的合成及手性拆分已經(jīng)成為了有機(jī)化學(xué)合成界的熱點(diǎn)[1]，目前比較普遍的方法主要是有通過(guò)有機(jī)小分子催化劑[2,3]和手性配體[4]的調(diào)控來(lái)實(shí)現(xiàn)非天然氨基酸的不對(duì)稱合成和手性拆分。在上述方法中，特定的小分子催化劑和手性配體對(duì)于氨基酸特定的手性構(gòu)型有著較強(qiáng)的專一性，比較適合用于合成單一構(gòu)型的非天然氨基酸化合物。但是如果在合成過(guò)程中，需要同時(shí)得到兩種互為對(duì)映異構(gòu)體的非天然氨基酸分子，小分子催化劑和手性配體的的實(shí)用性則略顯不足。2002年，德國(guó)的Waldmann教授總結(jié)歸納了大量的利用天然生物酶對(duì)外消旋氨基酸進(jìn)行手性拆分的實(shí)例[5]。其中提到了?；甫?acylase Ι)[6-8]可以用于苯丙氨酸的手性拆分，即可以同時(shí)得到兩種互為對(duì)映異構(gòu)體的手性氨基酸。苯丙氨酸是生命體不可缺少的氨基酸，苯丙氨酸的衍生物也是在諸多天然產(chǎn)物分子和藥物分子中經(jīng)常出現(xiàn)的重要結(jié)構(gòu)片段，而溴代苯丙氨酸因?yàn)槠浞间褰Y(jié)構(gòu)可以做出進(jìn)一步更為多樣的衍生化而顯得更為重要[9-11]。本文則是利用了acylase Ι作為催化劑對(duì)溴代苯丙氨酸進(jìn)行手性拆分的學(xué)術(shù)研究。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑及儀器

二苯亞甲基氨基乙腈，3-溴芐溴，芐基三乙基氯化銨，二氯化鈷，乙酸酐，acylase Ι等分析純?cè)噭绹?guó)Aldrich公司。核磁共振儀：Varian Mercury 400。(FAB)-質(zhì)譜儀：Typs Jeol SX 102 A。旋光儀：Schmidt + Haensch HH8，Na-D-Linie。

1.2 外消旋3-溴苯丙氨酸(5)的合成

實(shí)驗(yàn)使用了二苯亞甲基氨基乙腈(1)和3-溴芐溴(2)作為初始反應(yīng)物，以甲苯作為溶劑，并在相轉(zhuǎn)移催化劑-芐基三乙基氯化銨(TEBA)(3)和30%的NaOH水溶液的作用下制備了氨基酸前體分子4，之后再用鹽酸將二苯基脫去得到外消旋的3-溴苯丙氨酸(5)。反應(yīng)路線如圖1所示。

圖1 外消旋的3-溴苯丙氨酸(5)的合成Fig.1 Synthesis of racemic 3-bromophenylalanine (5)

操作步驟：

將80 g (0.36 mol) 二苯亞甲基氨基乙腈(1)和6.9 g (0.03 mol) 芐基三乙基氯化銨(3) 溶于150 mL的甲苯溶劑中，再向溶劑中加入250 mL的30% NaOH水溶液。將反應(yīng)體系冷卻至0 ℃，并向溶劑中滴加3-溴芐溴(2)的甲苯溶液(100 g 3-溴芐溴溶于100 mL甲苯溶液)。反應(yīng)在室溫下攪拌16 h后，向反應(yīng)液中加入200 mL水，并用300 mL的二氯甲烷萃取3次。再將合并的有機(jī)相用飽和食鹽水洗滌一次，并用無(wú)水硫酸鎂進(jìn)行干燥，過(guò)濾。蒸干溶劑后可得到無(wú)色的固體產(chǎn)物4，產(chǎn)率92%。

將140 g (0.36 mol) 分子4溶于300 mL甲苯溶液中，并加入800 mL 6 mol/L的鹽酸水溶液。將反應(yīng)液加熱回流16 h后冷卻至室溫，將反應(yīng)體系中的不溶物過(guò)濾，可得到無(wú)色固體產(chǎn)物5，產(chǎn)率100%。

1.3 (S)/(R)-3-溴苯丙氨酸鹽酸鹽(7, 9)的合成

實(shí)驗(yàn)首先使用了乙酸酐對(duì)外消旋3-溴苯丙氨酸進(jìn)行?；?，得到氨基酸衍生物6，而后在氯化鈷的作用下利用acylase Ι 將S-型氨基酸的酰胺鍵脫去[8]，得到(S)-3-溴苯丙氨酸(7)，而R-型氨基酸8的酰胺鍵則被保留[8]。此時(shí)兩種不同構(gòu)型的氨基酸由于取代基團(tuán)已經(jīng)不同，其分子結(jié)構(gòu)展示出較大的極性差異，可以通過(guò)萃取的方式進(jìn)行分離。脫去了酰胺鍵的S-型氨基酸由于極性非常大，所以可以在水中完全溶解；而保留了酰胺鍵的R-型氨基酸則可以溶于有機(jī)溶劑。之后再將未脫去酰胺鍵的R-型氨基酸用HCl將酰胺鍵脫去，即可得到(R)-3-溴苯丙氨酸(9)。反應(yīng)路線如圖2所示。

圖2 (S)/(R)-3-溴苯丙氨酸鹽酸鹽(7, 9)的合成Fig.2 Synthesis of (S)/(R)-3-bromobenzenealanine hydrochloride (7, 9)

操作步驟：

將100 g (0.35 mol) 外消旋氨基酸5 溶于1 L水中，并用2 mol/L的氫氧化鈉溶液將溶劑的pH值調(diào)至12[12]。之后將水蒸干，并將剩余的部分轉(zhuǎn)移到900 mL醋酸中。之后向此醋酸溶液中緩慢滴加39 mL (0.42 mol)乙酸酐，并在室溫下攪拌16 h。反應(yīng)結(jié)束后將醋酸溶劑蒸干，并將剩余部分轉(zhuǎn)移到1 L的水中，再用飽和的鹽酸水溶液將反應(yīng)體系的pH值調(diào)制1。用100 mL的乙酸乙酯萃取三次，將合并的有機(jī)相用飽和食鹽水洗滌一次，并用無(wú)水硫酸鎂進(jìn)行干燥，過(guò)濾。蒸干溶劑后可得到無(wú)色的固體產(chǎn)物6，產(chǎn)率78%。

將75 g (0.26 mol) 乙酰氨基酸6加入到1.5 L的水中，并用4 mol/L的氫氧化鈉水溶液將反應(yīng)液的pH值調(diào)制7.5～8.0之間。在氬氣的保護(hù)下向反應(yīng)液中加入0.74 g (5.72 mol) 的二氯化鈷和3.17 g acylase Ι，并在室溫下攪拌24 h(盡可能做到每4個(gè)小時(shí)測(cè)一次pH值)。向反應(yīng)液中加入1 g的活性炭，并在60 ℃攪拌30 min。冷卻至室溫后，用飽和鹽酸水溶液將反應(yīng)液的pH值調(diào)制1，然后用500 mL的乙酸乙酯萃取三次。將水相的溶劑蒸干，可得到無(wú)色固體(S)-3-溴苯丙氨酸鹽酸鹽(7)，產(chǎn)率46%。將合并的有機(jī)相用飽和食鹽水洗滌一次，并用無(wú)水硫酸鎂進(jìn)行干燥，過(guò)濾，蒸干溶劑后可得到無(wú)色的固體產(chǎn)物8，產(chǎn)率48%。

將R-型乙酰氨基酸8加入到1 L的3 mol/L的鹽酸溶液中，并加熱回流16個(gè)小時(shí)。之后將反應(yīng)冷卻至室溫，蒸干溶劑，得到無(wú)色的固體(R)-3-溴苯丙氨酸鹽酸鹽(9)，產(chǎn)率100%。

2 結(jié)果與討論

2.1 (S)-3-溴苯丙氨酸鹽酸鹽(7)的數(shù)據(jù)表征

核磁共振數(shù)據(jù)：1H-NMR (400 MHz, CD3OD): δ = 3.20 (dd,3J = 7.4 Hz, 7.2 Hz, 1H), 3.44 (dd,3J = 5.7 Hz, 7.3 Hz, 1H), 4.30 (dd,3J = 7.4Hz, 7.2 Hz, 1H), 7.32 (m, 2H), 7.51 (m, 1H), 7.54 (m, 1H).13C-NMR (100 MHz, CD3OD): δ = 37.6, 55.7, 124.7, 130.3, 132.7, 132.8, 134.4, 139.1, 174.9. 由上述數(shù)據(jù)可知，在氫譜中，化學(xué)位移值在3.20和3.44處為芐基上的兩個(gè)氫，4.30處為手性中心的氫，從7.32至7.54之間的4個(gè)氫為苯環(huán)上的氫；碳譜中，37.6為芐基碳，55.7為手性碳原子，從124.7至139.1處為六個(gè)苯環(huán)碳，174.9為羰基碳。

另外，高分辨質(zhì)譜測(cè)得了該化合物去掉了一個(gè)氯離子的分子量，理論值[M-Cl-]+為243.9958，實(shí)際測(cè)量值為243.9964，誤差為百萬(wàn)分之二。旋光值(c = 1.0, MeOH)。

2.2 (R)-3-溴苯丙氨酸鹽酸鹽(9)的數(shù)據(jù)表征

核磁共振數(shù)據(jù)：1H-NMR (400 MHz, CD3OD): δ = 3.20 (dd,3J = 7.4 Hz, 7.0 Hz, 1H), 3.44 (dd,3J = 5.7 Hz, 7.3 Hz, 1H), 4.31 (dd,3J = 7.4Hz, 7.2 Hz, 1H), 7.33 (m, 2H), 7.51 (m, 1H), 7.54 (m, 1H).13C-NMR (100 MHz, CD3OD): δ = 37.6, 55.7, 124.7, 130.3, 132.7, 132.8, 134.4, 139.1, 174.8. 由上述數(shù)據(jù)可知，在氫譜中，化學(xué)位移值在3.20和3.44處為芐基上的兩個(gè)氫，4.31處為手性中心的氫，從7.33至7.54之間的4個(gè)氫為苯環(huán)上的氫；碳譜中，37.6為芐基碳，55.7為手性碳原子，從124.7至139.1處為六個(gè)苯環(huán)碳，174.8為羰基碳。

另外，高分辨質(zhì)譜測(cè)得了該化合物去掉了一個(gè)氯離子的分子量，理論值[M-Cl-]+為243.9968，實(shí)際測(cè)量值為243.9950，誤差為百萬(wàn)分之四。旋光值(c = 1.0, MeOH)。

2.3 (S/R)-3-溴苯丙氨酸鹽酸鹽(7/9)的數(shù)據(jù)對(duì)比

由此互為對(duì)映異構(gòu)體的3-溴苯丙氨酸鹽酸鹽的數(shù)據(jù)對(duì)比可見(jiàn)，兩個(gè)化合物的核磁譜圖完全重合，且氫譜裂分幾乎完全一致。但兩個(gè)化合物旋光值的絕對(duì)值相近，而且正負(fù)相反，可以得出結(jié)論，本實(shí)驗(yàn)所得到的確實(shí)為互為對(duì)映異構(gòu)體的兩個(gè)3-溴苯丙氨酸鹽酸鹽。

3 結(jié) 論

（1）本實(shí)驗(yàn)成功的使用了?；?acylase Ι)對(duì)乙酰化的外消旋3-溴苯丙氨酸進(jìn)行了選擇性的去酰胺化，并以較高的產(chǎn)率得到了互為對(duì)映異構(gòu)體的溴苯丙氨酸鹽酸鹽分子。

（2）通過(guò)核磁共振、高分辨質(zhì)譜以及旋光值等數(shù)據(jù)進(jìn)一步證明了該實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。

（3）本實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明了?；?acylase Ι)可以成功的拆分含有溴取代的苯丙氨酸衍生物，對(duì)含有苯丙氨酸衍生物結(jié)構(gòu)的天然產(chǎn)物分子和藥物分子的合成提供了一個(gè)高效便捷的路線。

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Study on Chiral Resolution of Bromophenylalanine by Biological Acylase Ι

YU Fang, GUO Dong-cai, YU Hai-yang, LIU Sha-sha, HE Yu-peng
（School of Chemistry and Material Science, Liaoning Shihua University, Liaoning Fushun 113001, China）

Racemic bromophenylalanine was separated into enantiomeric isomers by biological caylase Ι which can remove the amide bond of S-type phenlyalamine selectivity and efficiency. The isolated products were characterized by NMR, HR-MS, and Polarimeter. Finally the results provided an efficient and convenient route to synthesize nature products and drug molecules with optically pure phenylalanine derivative structure.

Acylase Ι; Bromophenylalanine; Chiral separation

TQ 028

： A

： 1671-0460（2015）02-0221-03

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目, 項(xiàng)目號(hào)：21202077。

2014-12-08

于芳（1984-），女，湖北恩施人，講師，博士，2011年畢業(yè)于沈陽(yáng)藥科大學(xué)藥物化學(xué)專業(yè)，研究方向：從事天然產(chǎn)物化學(xué)和不對(duì)稱催化方面的研究。E-mail：yufang1112002@163.com。

何宇鵬（1979-），男，副教授，博士，2010年畢業(yè)于德國(guó)Max-Planck-Institute for Molecular Physiology in Dortmund, 研究方向：從事天然產(chǎn)物化學(xué)和不對(duì)稱催化方面的研究。E-mail：yupenghe2014@163.com。