楊 君 楊 龍 唐 倩 鄭亞西 何炯紅 胥亞楠 夏桂玲 田 水 葉 蕓

替米沙坦在牽張刺激導(dǎo)致的心室肌細(xì)胞延遲整流鉀通道改變中的作用

楊 君 楊 龍 唐 倩 鄭亞西 何炯紅 胥亞楠 夏桂玲 田 水 葉 蕓

目的：探討替米沙坦在牽張刺激導(dǎo)致的心室肌細(xì)胞延遲整流鉀離子通道改變中的作用。 方法：將體外培養(yǎng)的乳鼠心室肌細(xì)胞分為對照組、牽張組、替米沙坦組、牽張+替米沙坦組。定量分析細(xì)胞蛋白/DNA比值及細(xì)胞培養(yǎng)上清中N-末端B型利鈉肽原(NT-proBNP)水平以鑒定牽張有效性。實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測延遲整流鉀離子通道基因KCNH2、KCNQ1、KCNE1和KCNE2的mRNA水平；Western blot檢測KCNH2和KCNQ1蛋白表達(dá)水平。 結(jié)果：牽張刺激導(dǎo)致心室肌細(xì)胞蛋白/DNA比值增大和細(xì)胞培養(yǎng)上清中NT-proBNP水平升高。與對照組相比，牽張組KCNH2、KCNQ1、KCNE1和KCNE2 mRNA水平上調(diào)；替米沙坦可明顯抑制牽張刺激引起的KCNH2、KCNQ1和KCNE1變化，而對KCNE2基因無顯著抑制效應(yīng)。與對照組相比，牽張組KCNH2和KCNQ1蛋白表達(dá)下調(diào)；與牽張組相比，牽張+替米沙坦組KCNH2和KCNQ1蛋白水平明顯上調(diào)。 結(jié)論：阻斷血管緊張素受體可以抑制牽張刺激引起的心室肌細(xì)胞延遲整流鉀通道改變。

充血性心力衰竭；牽張刺激；心室重構(gòu)；延遲整流鉀離子通道

心室肥大是心臟長期負(fù)荷過重狀況下產(chǎn)生的一種有效代償方式，但這種代償可導(dǎo)致心室重構(gòu)，是充血性心力衰竭(心衰)、心律失常等發(fā)生的基礎(chǔ)[1]。臨床上約50%的心衰患者死于惡性心律失常[2]。心衰患者心肌細(xì)胞動(dòng)作電位時(shí)程(APD)的延長是惡性心律失常發(fā)生的基礎(chǔ)[3]。延遲整流鉀離子通道電流(IK)作為心室肌細(xì)胞復(fù)極相的主要外向電流，其性能的變化對APD的改變起重要作用。腎素-血管緊張素系統(tǒng)(RAS)是心室重構(gòu)主要的調(diào)控子之一，其主要通過血管緊張素Ⅱ1型受體(AT1R)發(fā)揮作用。研究發(fā)現(xiàn)，機(jī)械牽張刺激可直接激活心肌細(xì)胞膜的AT1R，將機(jī)械力刺激轉(zhuǎn)變?yōu)殡?化學(xué)信號傳入細(xì)胞，激活細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶(ERK)通路，誘導(dǎo)細(xì)胞基因及蛋白表達(dá)，促使心室重構(gòu)[4]。然而，由牽張刺激誘導(dǎo)的心室肌細(xì)胞離子通道改變及細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制至今尚未闡明[5]。本研究擬通過牽張刺激體外培養(yǎng)的心室肌細(xì)胞，用血管緊張素受體阻斷劑(ARB)替米沙坦干預(yù)，探討替米沙坦在牽張刺激導(dǎo)致的心室肌細(xì)胞延遲整流鉀通道改變中的作用。

1 材料與方法

1.1 主要材料

胎牛血清(FBS)和DMEM高糖培養(yǎng)基由Gbico公司生產(chǎn)，胰酶和Ⅱ型膠原酶購自Sigma公司，免疫組化試劑盒購自碧云天公司，蛋白質(zhì)-DNA-mRNA共提取試劑盒購自O(shè)mega生物技術(shù)公司，N-末端B型利鈉肽原(NT-proBNP) ELISA檢測試劑盒、KCNH2抗體和KCNQ1抗體購自Abcam公司，SYBR Premix Ex Taq購自Takara公司，α-橫紋肌肌動(dòng)蛋白(α-SCA)單克隆抗體購自博士德生物工程有限公司，辣根過氧化物酶及FITC標(biāo)記的山羊抗兔IgG購自中杉金橋公司，其他試劑均為國產(chǎn)分析純以上級別。

1.2 心室肌細(xì)胞培養(yǎng)與鑒定

出生1 d的清潔級SD大鼠用乙醚氣霧麻醉。取近心尖中下2/3的心室組織，洗去血液，剪至約1 mm×1 mm的組織塊。用含0.05%胰酶和80 mol/L Ⅱ型膠原酶的消化液消化，結(jié)合差速貼壁法獲得心室肌細(xì)胞，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中，用含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)。通過細(xì)胞形態(tài)和α-SCA陽性染色情況鑒定心室肌細(xì)胞。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組與處理

細(xì)胞于牽張裝置硅膠膜上貼壁培養(yǎng)24 h，更換含5%FBS的DMEM培養(yǎng)基，分為4組。(1)對照組：不予干預(yù)；(2)牽張組：較基礎(chǔ)培養(yǎng)狀態(tài)增加20%硅膠膜面積；(3)替米沙坦組：在培養(yǎng)液中加入替米沙坦 10 μmol/L；(4)牽張+替米沙坦組：在培養(yǎng)液中加入替米沙坦10 μmol/L干預(yù)1h后，增加20%硅膠膜面積。各組細(xì)胞培養(yǎng)48 h后進(jìn)行下游檢測。

1.4 牽張有效性鑒定

按照試劑盒說明檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清中的NT-proBNP水平；測定細(xì)胞DNA和蛋白含量，計(jì)算蛋白/DNA比值。

1.5 基因mRNA水平的檢測

利用Oligo 6.0軟件設(shè)計(jì)引物(序列見表1)。Trizol法提取細(xì)胞總mRNA，按SYBR Premix Ex Taq試劑盒說明檢測基因mRNA相對表達(dá)量。

表1 延遲整流鉀離子通道基因?qū)崟r(shí)熒光定量PCR引物序列

1.6 Western blot

提取細(xì)胞總蛋白，測定蛋白濃度。取60 μg總蛋白上樣，電泳后轉(zhuǎn)移蛋白至硝酸纖維素膜上，5%脫脂牛奶封閉1 h，加入相應(yīng)一抗4℃孵育過夜。充分漂洗后，加入辣根過氧化酶標(biāo)記的二抗室溫孵育1 h。充分漂洗后顯影、攝片并進(jìn)行條帶灰度定量測定。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用Graphpad Prism 6軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，應(yīng)用單因素方差分析(One Way-ANOVA)進(jìn)行多組間兩兩比較。以P<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 心室肌細(xì)胞培養(yǎng)與鑒定

倒置顯微鏡下可見心室肌細(xì)胞呈長梭形、三角形或不規(guī)則形，核仁清晰可見，單個(gè)細(xì)胞貼壁后可見節(jié)律性舒縮搏動(dòng)，細(xì)胞搏動(dòng)頻率隨著培養(yǎng)時(shí)間延長呈現(xiàn)由慢到快再變慢的規(guī)律。心室肌細(xì)胞α-SCA抗體免疫熒光染色陽性(見圖1)。

注：上為α-SCA抗體染色；下為同視野細(xì)胞核DAPI染色

圖1 心室肌細(xì)胞免疫熒光染色

2.2 牽張有效性

與對照組相比，牽張組心室肌細(xì)胞蛋白/DNA比值明顯增大，細(xì)胞培養(yǎng)上清中NT-proBNP水平明顯升高，顯示牽張刺激導(dǎo)致心室肌細(xì)胞肥大，促使心室肌細(xì)胞合成分泌NT-proBNP；與牽張組相比，牽張+替米沙坦組蛋白/DNA比值及NT-proBNP水平降低(P<0.05，見表2)。

2.3 延遲整流鉀離子通道基因表達(dá)情況

與對照組相比，牽張組KCNH2、KCNQ1、KCNE1和KCNE2 mRNA水平明顯增高；與牽張組相比，牽張+替米沙坦組KCNH2、KCNQ1和KCNE1 mRNA水平明顯降低(P<0.05)，而KCNE2無明顯變化(見圖2)。

表2 牽張刺激有效性

2.4 KCNH2和KCNQ1蛋白表達(dá)情況

與mRNA檢測結(jié)果不同，與對照組相比，牽張組心室肌細(xì)胞KCNH2和KCNQ1蛋白水平顯著下調(diào)；與牽張組相比，牽張+替米沙坦組KCNH2和KCNQ1蛋白水平明顯上調(diào)(P<0.05，見圖3及表3)。

3 討論

3.1 牽張刺激致心室肌細(xì)胞肥大模型的評價(jià)

制備原代心室肌細(xì)胞肥大模型可用藥物刺激，但不除外藥物通過其他途徑激活相關(guān)信號通路。采用牽張裝置可排除神經(jīng)-體液因素的影響。研究證實(shí)，培養(yǎng)心室肌細(xì)胞時(shí)增加20%硅膠膜面積牽張48 h，細(xì)胞蛋白/DNA比值增大，促進(jìn)細(xì)胞肥大改變[7]。心室壁張力升高刺激B型利鈉肽前體合成、分泌，其分解產(chǎn)生的B型利鈉肽和NT-proBNP隨之增多[8]。因此，本研究通過檢測細(xì)胞上清中NT-proBNP的水平及細(xì)胞蛋白/DNA比值變化，證明牽張刺激的有效性。

3.2 延遲整流鉀離子通道

延遲整流鉀離子通道電流包括超快激活電流(IKur)、快速激活電流(IKr)和緩慢激活電流(IKs)3種。大鼠心室肌細(xì)胞僅包括IKr和IKs[9-10]。鉀離子通道由功能亞基(α亞基)和輔助亞基(β亞基)構(gòu)成。β亞基可調(diào)節(jié)α亞基的表達(dá)、分布及通道開放-關(guān)閉的動(dòng)力學(xué)和藥理學(xué)特性[11]，但決定離子通道主要功能的是α亞基。KCNH2和KCNE2分別編碼Kr通道的α亞基和β亞基。Ks通道α亞基和β亞基則由KCNQ1和KCNE1編碼。研究發(fā)現(xiàn)，衰竭心肌細(xì)胞瞬時(shí)外向鉀電流(Ito)通道β亞基的KCNE1基因表達(dá)明顯增加，但KCNE2沒有明顯改變[12]。

注：與對照組相比，(1)P<0.01，(2)P<0.05；與牽張組相比，(3)P<0.05，(4)P<0.01

注：A為對照組，B為牽張組，C為替米沙坦組，D為牽張+替米沙坦組

表3 各組KCNH2和KCNQ1蛋白相對表達(dá)量

本研究發(fā)現(xiàn)，牽張刺激導(dǎo)致心室肌細(xì)胞膜上延遲整流鉀離子通道(Kr和Ks)的α亞基KCNH2和KCNQ1蛋白表達(dá)明顯下調(diào)，與文獻(xiàn)報(bào)道肥大心室肌細(xì)胞這兩種蛋白表達(dá)水平受抑制相一致[13-15]，但KCNH2和KCNQ1 mRNA水平與蛋白水平相反，呈顯著升高趨勢。這可能是因?yàn)楸狙芯坎捎玫母深A(yù)條件下，該通道基因與蛋白表達(dá)水平間存在負(fù)反饋調(diào)節(jié)。此外，牽張刺激后延遲整流鉀離子通道β亞基KCNE1和KCNE2基因表達(dá)顯著上調(diào)，替米沙坦可明顯抑制牽張刺激引起的KCNH2、KCNQ1和KCNE1表達(dá)變化，但對KCNE2無明顯作用。

本研究發(fā)現(xiàn)，替米沙坦可明顯抑制牽張所引起的延遲整流鉀離子通道主要基因的表達(dá)變化。ARB不但能改善心肌結(jié)構(gòu)重構(gòu)，還可能逆轉(zhuǎn)心肌電重構(gòu)中延遲整流鉀離子通道的改變，影響APD，抑制心律失常的發(fā)生[16]。這一方面提示AT1R信號的激活可能參與了心室肌延遲整流鉀離子通道重構(gòu)的調(diào)控；另一方面，這為應(yīng)用ARB治療心衰或心肌肥厚、抑制室性心律失常等提供了理論依據(jù)。

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(收稿：2014-07-29 修回：2014-12-04)

(本文編輯：梁英超)

Effects of telmisartan on delayed rectifier potassium channel induced by stretch in ventricular myocytes

YANGJun1,YANGLong1,TANGQian2,ZHENGYaxi1,HEJionghong1,XUYanan1,XIAGuiling1,TIANShui1,YEYun1.

1.DepartmentofCardiovascularMedicine，theAffiliatedGuizhouPeople′sHospitalofGuiyangMedicalCollege,Guizhou550004,China; 2.DepartementofCardiovascularMedicine,theAffiliatedHospitalofGuiyangMedicalCollege,Guizhou550004,China

Objective:To explore the effects of telmisartan on delayed rectifier potassium ion channel stimulated by stretch in ventricular myocytes from neonatal rats. Methods:Ventricular myocytes isolated from neonatal rats were divided into control group, stretch group, telmisartan group and stretch+telmisartan group. Alterations of protein-to-DNA ratio and N-terminal pro-brain natriuretic peptide(NT-proBNP)levels in the cell culture supernatant were used to determine the effectiveness of in vitro stretch model. The mRNA expression of delayed rectifier potassium channel genes, such as KCNH2, KCNQ1, KCNE1 and KCNE2 were assayed by real-time PCR. The protein levels of KCNH2 and KCNQ1 were analyzed by Western blot. Results:Stretch significantly increased the protein-to-DNA ratio and NT-proBNP . Compared with control group, the transcription of KCNH2, KCNQ1, KCNE1 and KCNE2 mRNA were significantly increased in stretch group. Telmisartan inhibited stretch-induced alterations in KCNH2, KCNQ1 and KCNE1 mRNA expression, but had no inhibiting effect on KCNE2. However, compared with control group, the expressions of KCNH2 and KCNQ1 proteins were significantly decreased in stretch group, which could be attenuated by telmisartan markedly. Conclusion:Blockade of angiotensin receptor can attenuate changes of delayed rectifier potassium channels induced by stretch.

Congestive heart failure; Stretch; Ventricular remodeling; Delayed rectifier potassium channel

550004 貴陽醫(yī)學(xué)院附屬貴州省人民醫(yī)院心血管內(nèi)科(楊 君，楊 龍，鄭亞西，何炯紅，胥亞楠，夏桂玲，田 水，葉 蕓)；

貴陽醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科(唐 倩)

楊 龍， Email: yanglong1001@163.com

10.3969/j.issn.1673-6583.2015.01.016