史芳芳

(新疆兵團第十二師農(nóng)業(yè)科學研究所，新疆烏魯木齊 830088)

利用內(nèi)標為基礎(chǔ)的RT-PCR技術(shù)檢測草莓皺縮病毒(SCV)和草莓鑲脈病毒(SVBV)

史芳芳

(新疆兵團第十二師農(nóng)業(yè)科學研究所，新疆烏魯木齊 830088)

[目的]通過對反應條件和參數(shù)的摸索與優(yōu)化，建立多重RT-PCR檢測方法，實現(xiàn)2種病毒的同時高效快速檢測。[方法] 通過CTAB法與試劑盒提取RNA，以優(yōu)質(zhì)的總RNA為模板，進行梯度PCR，結(jié)合擴增內(nèi)標的檢測體系，建立多重RT-PCR檢測方法。[結(jié)果] 建立了優(yōu)化的SCV和SVBV的多重RT-PCR檢測體系，可以對草莓田間植株進行快速穩(wěn)定的病毒檢測。[結(jié)論]該研究為草莓病毒檢測提供一種方便、高效的分子生物學方法，為草莓無病毒苗的實際生產(chǎn)提供技術(shù)支撐。

草莓病毒; 內(nèi)標; 多重RT-PCR; 病毒檢測

草莓種苗普遍感染病毒是草莓生產(chǎn)中的瓶頸問題，由于可侵染草莓的病毒經(jīng)常復合侵染，因此草莓病毒病的田間癥狀表現(xiàn)極其復雜[1]。不同病毒病在草莓上可表現(xiàn)出相似的癥狀，而同種病毒病在不同條件下的癥狀也會出現(xiàn)很大差異，這給病害的田間診斷帶來了極大的困難[2]。因此，建立快速、準確的草莓病毒檢測技術(shù)具有重要的實際意義。目前新疆關(guān)于草莓病毒病的研究極少，對病毒種類、分布、發(fā)生程度及生物學特性等基礎(chǔ)研究極為薄弱，病毒檢測體系不健全，缺乏先進的種苗及種苗生產(chǎn)環(huán)節(jié)有效的病毒檢測技術(shù)手段，脫毒種苗質(zhì)量難以保證，退化嚴重，使用時間短，效益不高。有的生產(chǎn)單位未經(jīng)檢測就盲目從內(nèi)地調(diào)種，劣質(zhì)種苗不僅破壞了脫毒種苗的聲譽，損害了農(nóng)民的利益，還造成了一些病原菌的廣泛傳播和地區(qū)性的檢疫病害傳入[3]。因此，在已有試驗技術(shù)的基礎(chǔ)上，通過進一步改進試驗方法，優(yōu)化體系，建立起一套靈敏度高、準確性好、操作簡便的病毒檢測技術(shù)[4]。筆者針對草莓皺縮病毒(SCV)和草莓鑲脈病毒(SVBV)2種病毒，以單一RT-PCR為基礎(chǔ)，通過對反應條件和參數(shù)的摸索與優(yōu)化，建立多重RT-PCR檢測方法，實現(xiàn)2種病毒的同時高效快速檢測，為草莓病毒檢測提供一種方便、高效的分子生物學方法，為草莓無病毒苗的實際生產(chǎn)提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗材料草莓試材為新疆兵團十二師三坪農(nóng)場種植的露地草莓品種達賽萊克特，此品種為該單位從外地引進，種苗未經(jīng)檢測種植于大田，采集疑似感染皺縮病毒的6株草莓植株葉片，進行病毒檢測。取約50 mg幼葉為試驗材料。

1.2 試驗試劑RNA試劑提取盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、TaqDNA聚合酶、dNTPs、DNA分子量MarkerD2000均購于上海生物工程有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1特異性擴增與參照引物設計。根據(jù)GenBank中SMoV( Genbank Accession No.AJ311875，AJ311876)、SMYEV( Genbank Accession No.D12517)、SCV( Genbank Accession No.AY005146.1)、SVBV( Genbank Accession No.NC001725)的基因組序列和文獻分別設計和合成針對SMoV、SMYEV、SCV和SVBV 的引物( 表1)[5]。

為了驗證擴增的陰性條帶的真?zhèn)涡裕貌葺拥鞍谆駻ctin( GenBank Accession No.AB116565)作為內(nèi)部體系參照[6]。所用引物均由上海生物工程公司合成。引物序列見表1。

表1 SMoV、SMYEV、SVBV、SCV和Actin檢測所用引物

1.3.2核酸提取。

1.3.2.1利用改進的CTAB法提取草莓葉片總核酸[7]。取少許幼嫩葉片，放入1.5 ml離心管中，加入石英砂用研磨杵研磨均勻，直至全部研磨至粉末，加入500 μl 65 ℃預熱的CTAB溶液(用前加入2%的巰基乙醇)，將裝有CTAB和樣品的EP管放入65 ℃水浴，約20 min。冷卻后，加入500 μl酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1)，混勻，12 000 r/min，離心15 min，吸上清，裝入一新的EP管。加入500 ul氯仿∶異戊醇(24∶1)，12 000 r/min，離心15 min，吸上清，轉(zhuǎn)入一新的離心管中。加入1/10體積的NaAc(3 mol/L)，1 ml -20 ℃預冷的無水乙醇，反復顛倒數(shù)次，混勻后置于-20 ℃(-80 ℃，30 min)3～4 h，12 000 r/min，10 min，棄上清。向離心管中加入75%的乙醇洗滌2～3次，置于吸水紙上倒置晾干。加入DEPC H2O(30 μl)溶解。

1.3.2.2試劑盒提取總RNA?？俁NA的提取參見試劑盒說明書進行。

1.3.3反轉(zhuǎn)錄。按照試劑盒說明書進行反轉(zhuǎn)錄。

1.3.4梯度PCR擴增內(nèi)參。以反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板，進行單一PCR擴增。PCR體系：10×PCR緩沖液4 μl，MgCl21.2 μl，dNTPs 0.4 μl，引物ActinF/ActinR 1 μl，Taq酶0.5 μl，反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物0.5 μl，補足雙蒸水至20 μl。

反應程序：預變性94 ℃ 2 min；94 ℃ 30 s，50～55 ℃ 40 s，68 ℃ 1 min，35個循環(huán)；72 ℃延伸5 min。

1.3.5多重RT-PCR。

1.3.5.1雙重RT-PCR擴增SCV。擴增體系：10×PCR緩沖液4 μl，MgCl21.2 μl，dNTPs 0.4 μl，引物ActinF/ActinR 0.5 μl，SCVF/SCVR 0.5 μl，Taq酶0.5 μl，反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物0.5 μl，補足雙蒸水至20 μl。

反應程序：預變性94 ℃ 2 min；94 ℃ 30 s,55 ℃ 40 s,68 ℃ 1 min，35個循環(huán)；72 ℃延伸5 min。

1.3.5.2三重RT-PCR擴增其他3個病毒。擴增體系：10×PCR緩沖液4 μl，MgCl21.2 μl，dNTPs 0.4 μl，引物SMoVF/SMoVR 0.72 μl，SVBVF/SVBVR 1 μl，SMYEVF/SMYEVF 0.6 μl，Taq酶0.5 μl，反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物0.5 μl，補足雙蒸水至20 μl。

反應程序：預變性94 ℃ 2 min；94 ℃ 30 s,55 ℃ 40 s,68 ℃ 1 min，35個循環(huán)；72 ℃延伸5 min。

2 結(jié)果與分析

2.1 總核酸分離和電泳檢測采用試劑盒提取總核酸，包括總DNA和總RNA。從瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果可以看出(圖1)，DNA條帶及RNA的28S、18S和5S條帶均能看到，這說明總RNA沒有發(fā)生降解，完整性較好。

2.2 內(nèi)標RT-PCR以ActinF/ActinR為引物，采取草莓品種反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板，梯度PCR擴增，篩選出53°為最佳退火溫度，擴增出預期295 bp大小的特異片段(圖2)，說明Actin基因存在于草莓中，該基因適合作為草莓RNA病毒檢測的內(nèi)標。以此基因為內(nèi)標，一方面可以排除假陰性結(jié)果的干擾，另一方面可以進一步檢測RNA質(zhì)量，提高了檢測結(jié)果的準確性。

2.3 多重RT-PCR以ActinF/ActinR、SCVF/SCVR兩對引物首先擴增疑似皺縮病毒，擴增條件同Actin基因，2個植株擴增出大小為345 bp的特異片段(圖3)，說明檢測出SCV病毒，此前預估帶有此病毒的推測是正確的。

同時，以另外3種病毒引物繼續(xù)擴增cDNA，確定植株是否還有其他病毒侵染，結(jié)果檢測出片段大小278 bp的條帶，說明存在鑲脈病毒侵染(圖4)，因此疑似植株可確定為皺縮病毒和鑲脈病毒復合侵染，與皺縮病毒通常與草莓鑲脈病毒(SVBV)復合侵染的說法一致。

圖1 總核酸提取

圖2 6個植株內(nèi)參Actin 擴增

注：M.marker，A1、A2.Actin擴增條帶，S1、S2.SCV擴增條帶。圖3 Actin/SCV引物擴增

注：M. marker， 1、2.SVBV擴增條帶。圖4 其他3引物擴增

3 討論

(1)與改進CTAB法提取RNA 相比，該研究采用試劑盒提取，方法簡單，只需30 min，提取效果也比改進的CTAB法好，而且改進的CTAB法提取配制試劑復雜，準備工作耗時長，對所用耗材及試劑要求均必須去除RNA酶污染，提取時間需要12 h，提取過程也較繁瑣，一批次提取樣品，提取效果均一性不好，有些樣品提取條帶完整，有些則效果較差，這說明提取過程稍不注意，則會有RNA酶污染，影響了提取效果[8]。

(2)植物病毒檢測體系中引入內(nèi)標可增加試驗的可靠性，減少假陰性的出現(xiàn)。該研究設計了NADH脫氫酶基因為內(nèi)參，合成引物后，經(jīng)過多次條件摸索，始終擴增不出內(nèi)參條帶，之后換成Actin內(nèi)參引物，經(jīng)過梯度PCR擴增，一次便成功擴增出條帶，該研究最終選擇此基因作為內(nèi)參，擴增效果較好，健康植株與帶毒試材均可良好地擴增，說明此內(nèi)標相對穩(wěn)定[9]。

(3)多重PCR擴增受諸多因素影響，該研究首先以疑似病毒引物和內(nèi)參引物作雙重PCR擴增，確保了樣本RNA質(zhì)量的可靠性，同時驗證了疑似病毒的檢測結(jié)果，2次試驗再進行三引物PCR擴增，以排除其他病毒的侵染，2次試驗便可確保試驗的準確無誤，避免了單一引物擴增的繁瑣性，因此，經(jīng)過多重RT-PCR擴增可縮短試驗時間，減少試劑的損耗，達到了省時省力的功效。同時，該研究在試驗過程中嘗試了采用一步法RT-PCR進行擴增，此方法可節(jié)省更多的時間和試驗步驟，但此方法中間過程不易控制，且重復性不好，因此沒有得到較好的試驗結(jié)果，最終還是選擇兩步法PCR更能保證試驗的準確性[10]。

[1] 王國平.我國草莓病毒種類鑒定研究初報[J].中國果樹，1988(2)：32-34.

[2] 肖君澤，黃益鴻，姜放軍，等.草莓病毒病及其脫毒與檢測技術(shù)研究進展[J].江西農(nóng)業(yè)學報，2010，22(8)：88-90.

[3] 常琳琳，張志宏.草莓病毒的簡單、快速PCR檢測[M]//中國園藝學會草莓分會，北京市農(nóng)林科學院.草莓研究進展(三).北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2009：83-88.

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[5] 隨春，吳祿平，張志宏.利用PCR技術(shù)檢測草莓鑲脈病毒[J].園藝學報，2003，30(1)：82-84.

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[9] 楊洪一，張志宏女，杜國棟，等.利用內(nèi)標為基礎(chǔ)的RT-PCR技術(shù)檢測草莓斑駁病毒[J].植物病理學報，2005，35(2)：116-122.

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Detection of SCV and SVBV with Multiplex RT-PCR Based on Internal Control

SHI Fang-fang

(The Center of Popularization of Agricultural Technology of the 12th Division of Xinjiang Production and Construction Corps, Urumchi,Xinjiang 830088)

[Objective] Through optimization of reaction conditions and parameters, multiple RT-PCR detection method was established in order to realize efficient and rapid detection of two kinds of virus. [Method] By CTAB method and the kit, RNA was extracted. Using high-quality total RNA as a template, gradient PCR was done, Combining with internal amplification target detection system, a multiplex RT-PCR detection system of SCV and SVBV was established. [Result] A multiplex RT-PCR detection system of SCV and SVBV was established, and could make fast and stable virus detection in field grown strawberries. [Couclusion] The study provided a convenient and efficient molecular biology method for strawberry virus detection, and provided technical support for actual production of strawberry virus-free seedling.

Strawberry virus; Internal control; Multiplex RT-PCR; Virus detection

新疆生產(chǎn)建設兵團科技支疆計劃項目(2013AB006)。

史芳芳(1977-)，女，新疆烏魯木齊人，助理研究員，碩士，從事植物組織培養(yǎng)及農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣工作。

2015-08-07

S 41-33

A

0517-6611(2015)28-020-02