曹健波，付貴峰，張帆，劉剛

(廈門大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院分子影像暨轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究中心，福建廈門 361102)

0 引言

納米醫(yī)學(xué)的飛速發(fā)展為醫(yī)學(xué)的進(jìn)步提供了全新的機(jī)遇，尤其在惡性腫瘤的光熱(photothermal therapy，PTT)和光動(dòng)力(photodynamic therapy，PDT)治療方面，越來越多具有治療功能的納米復(fù)合物受到研究者重視．因其安全有效性，光熱和光動(dòng)力治療逐漸成為繼手術(shù)、放療、化療及生物療法后腫瘤治療的又一有效手段．隨著研究的不斷進(jìn)展，越來越多的功能化納米材料進(jìn)入人們的視野，如金納米粒子［1］，碳納米管［2－4］，石墨烯等［5－7］，且均表現(xiàn)出良好的生物相容性和初步治療效果．與此同時(shí)，建立一種有效的無創(chuàng)性療效長期監(jiān)測及腫瘤預(yù)后評價(jià)體系，就成為了亟待解決的問題，也是醫(yī)學(xué)影像工作者面臨的新挑戰(zhàn)．磁共振成像因其較好的組織分辨率，一直在醫(yī)學(xué)影像中發(fā)揮著重要作用，尤其是功能磁共振的發(fā)展，使其不僅局限于對組織結(jié)構(gòu)的反映，更可反映體內(nèi)一系列的功能代謝變化．DWI是目前唯一可反映或體內(nèi)水分子擴(kuò)散的成像方式，腫瘤細(xì)胞因代謝或功能障礙或凋亡壞死后，水分子擴(kuò)散運(yùn)動(dòng)受到影響，導(dǎo)致其表觀擴(kuò)散系數(shù)發(fā)生變化，故DWI可作為反映腫瘤光熱和光動(dòng)力治療后療效監(jiān)測的有效手段［8－9］．該評價(jià)體系的建立，將為納米材料的設(shè)計(jì)、制備及功能化研究提供有力支撐，并在其臨床推進(jìn)方面發(fā)揮重要指導(dǎo)作用．

1 材料與方法

1．1 納米材料

實(shí)驗(yàn)選取聚乙二醇修飾的氧化石墨烯復(fù)合物裝載二氫卟吩e6(G0－PEG－Ce6)作為光熱和光動(dòng)力治療的納米材料，該材料由蘇州大學(xué)楊凱老師課題組饋贈(zèng)．該復(fù)合材料中聚乙二醇(PEG)修飾的氧化石墨烯(nano－graphene oxide，nGO)和還原石墨烯(RGO)［1－3］具有很強(qiáng)的近紅外吸收，在腫瘤的光熱治療方面展現(xiàn)出了優(yōu)勢，同時(shí)由于石墨烯為單層碳原子結(jié)構(gòu)，具有較大的表面積，故可作為光動(dòng)力治療中光敏劑的優(yōu)良載體［4］．二氫卟吩e6(chlorin e6，Ce6)為葉綠素衍生物，可從植物中大量獲得，化學(xué)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，在630～700nm波長范圍內(nèi)有很強(qiáng)的紅外吸收．實(shí)驗(yàn)中利用石墨烯裝載二氫卟吩e6，表現(xiàn)出良好的光熱和光動(dòng)力效應(yīng)．

1．2 材料細(xì)胞毒性及體外治療效果實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)選取4T1細(xì)胞株，來自中國科學(xué)院細(xì)胞庫．納米材料的細(xì)胞毒性試驗(yàn)采用MTT實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證．取對數(shù)期細(xì)胞，胰酶常規(guī)消化后制成細(xì)胞懸液，均勻加入96孔板，每孔體積為100μL，細(xì)胞數(shù)量為5 000～10 000．培養(yǎng)24 h后，分別加入濃度為6．25、12．5、25、50、100、200μg·mL－1的GO －PEG －Ce6，繼續(xù)培養(yǎng)24 h．24 h后每孔加入5 mg·L－1的MTT溶液20μL，繼續(xù)孵育4 h后棄去上清液，每孔加入100μL二甲基亞砜(DMSO)，震蕩10 min，用酶標(biāo)儀檢測其在490 nm處的吸光度(OD)值．細(xì)胞存活率計(jì)算公式如下:細(xì)胞存活率=實(shí)驗(yàn)組光密度值/空白組光密度值×100% ．試驗(yàn)中每孔設(shè)置五個(gè)復(fù)孔，計(jì)算結(jié)果取平均值．

體外光熱和光動(dòng)力治療效果也由MTT實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，細(xì)胞分入96孔板以后，待其貼壁，加入5μmol(以Ce6計(jì))的GO－PEG－Ce6共培養(yǎng)，培養(yǎng)不同時(shí)間(0．5、1、2、4 h)后，分別接受不同處理:① 光熱治療，808 nm激光照射10 min，激光強(qiáng)度為0．3 W·cm－2;②光動(dòng)力治療，630 nm激光照射5 min，激光強(qiáng)度為0．05 W·cm－2;③ 光熱光動(dòng)力協(xié)同治療，先用0．3 W·cm－2強(qiáng)度的808 nm激光照射10 min后，改用0．05 W·cm－2的630 nm激光照射5 min．再加入MTT溶液，4 h后棄去上清，每孔加入100μL DMSO，震蕩10 min，用酶標(biāo)儀檢測其在490 nm處的OD值，計(jì)算出不同組的細(xì)胞存活率．

1．3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型及光熱和光動(dòng)力治療

30只雌性Balb/C小鼠，16～18 g，購自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司．動(dòng)物清潔飼養(yǎng)一周后，于右臀部種植皮下腫瘤．對數(shù)期4T1細(xì)胞消化后重懸，每只動(dòng)物注射細(xì)胞數(shù)約為5×106，注射細(xì)胞懸液體積為100μL，兩周后，使用磁共振觀察每只動(dòng)物的腫瘤生長情況，選取形狀大小相似的20只，隨機(jī)分為四組，分別為PBS對照組、單純光熱治療組、單純光動(dòng)力治療組和光熱光動(dòng)力協(xié)同治療組．

實(shí)驗(yàn)組動(dòng)物尾靜脈注射GO－PEG－Ce 6 200μL，對照組注射PBS．24 h后分別對四組動(dòng)物進(jìn)行光熱和光動(dòng)力治療．①光熱治療，808 nm激光照射10 min，激光強(qiáng)度為1 W·cm－2;②光動(dòng)力治療，630 nm激光照射5 min，激光強(qiáng)度為0．2 W·cm－2;③光熱光動(dòng)力協(xié)同治療，先用1 W·cm－2強(qiáng)度的808 nm激光照射10 min后，改用0．2 W·cm－2的630 nm激光照射5 min．治療時(shí)使用10%(體積分?jǐn)?shù))水合氯醛麻醉動(dòng)物，注射劑量為4μL·g－1，并適當(dāng)固定，保證整個(gè)腫瘤區(qū)域均暴露在激光照射范圍內(nèi)．

1．4 治療效果MRI監(jiān)測

MRI實(shí)驗(yàn)選取注射材料前，治療后1、3、7、14 d 5個(gè)時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行掃描．掃描時(shí)使用異氟烷和氧氣混合氣體進(jìn)行持續(xù)氣體麻醉，并使用呼吸監(jiān)控裝置實(shí)時(shí)監(jiān)測動(dòng)物呼吸狀態(tài)．所有掃描均使用9．4T磁共振成像儀(Bruker 94/20 USR，Germany)，使用內(nèi)徑為4 cm的小鼠專用體線圈(RF 1H 75/40，Bruker，Germany)．MRI掃描參數(shù)如下:

1)快速自選回波T2加權(quán)像(TurboRARE)，TR/TE=2 500/33 ms，矩陣256×256，層厚1．0 mm，層間距1．0 mm，視野大小(field of view，F(xiàn)OV)=40 mm×40 mm．

2)自選回波擴(kuò)散加權(quán)成像序列(SE－DWI)，B值選取800 s·mm－2，TR/TE=3 000/27 ms，矩陣256×256，層厚1．0 mm，層間距1．0 mm，F(xiàn)OV=40 mm ×40 mm．

1．5 組織學(xué)染色

動(dòng)物持續(xù)觀察結(jié)束后處死．取下主要器官和腫瘤組織使用4%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))多聚甲醛固定，進(jìn)行蘇木精—伊紅染色(hematoxylin－eosin staining)．另取腫瘤組織，使用冰凍切片包埋劑包埋，低溫冷凍后，進(jìn)行冰凍切片，使用血小板內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子(platelet endothelial cell adhesion molecule－1，PECAM－1/CD31)對其血管分布情況進(jìn)行染色．切片與一抗(CD31抗體)室溫孵育1 h后加入二抗，二抗為熒光素Cy3標(biāo)記的羊抗兔IgG(immunoglobulin G)抗體．細(xì)胞膜著紅色者為陽性，無著色者為陰性．使用熒光顯微鏡觀察其血管分布情況．

2 結(jié)果與討論

2．1 納米材細(xì)胞毒性及體外光熱和光動(dòng)力治療效果測定

如圖1(a)所示，納米材料細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示GO－PEG－Ce6無明顯細(xì)胞毒性．實(shí)驗(yàn)分別使用了6．25、12．5、25、50、100、200μg·mL－1等濃度的納米材料處理細(xì)胞24 h后，相對細(xì)胞活性均處在80%以上，其中濃度最大的200μg·mL－1處理細(xì)胞后，細(xì)胞相對活性也達(dá)到84%，表明該納米材料沒有明顯的毒性，具有良好的生物相容性，可將其用于生物體內(nèi)成像．

體外光熱和光動(dòng)力治療效果如圖1(b)所示．隨著孵育時(shí)間延長，治療后細(xì)胞存活率逐漸降低，證明細(xì)胞殺傷效果是由于細(xì)胞吸收GO－PEG－Ce6后經(jīng)過治療所致，并非由于游離的納米材料自身毒性．孵育4 h后，單純光熱治療組相對細(xì)胞活性為40%，單純光動(dòng)力治療為30%，而光熱和光動(dòng)力協(xié)同治療組中，細(xì)胞存活率為20%，證明該材料有良好的體外光熱和光動(dòng)力治療效果．

圖1 細(xì)胞毒性及體外治療效果評價(jià)Fig．1 Cell toxicity tests and photothermal therapeutic effect

2．2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物光熱和光動(dòng)力治療

圖2(a)為T2加權(quán)圖像，反映了不同組腫瘤體積變化．圖2(b)為不同組ADC圖．ADC(apparent diffusion coefficient，ADC)又稱表觀擴(kuò)散系數(shù)，是DWI成像后得到的重要參數(shù)，可反映體內(nèi)水分子的擴(kuò)散運(yùn)動(dòng)．腫瘤細(xì)胞凋亡后，水分子擴(kuò)散受到影響，導(dǎo)致ADC值上升．PBS對照組同時(shí)進(jìn)行了光熱和光動(dòng)力治療．光熱治療時(shí)，動(dòng)物腫瘤處體表溫度由34℃上升至44℃上下，經(jīng)光動(dòng)力治療后不同時(shí)間點(diǎn)使用MRI觀察，分別統(tǒng)計(jì)其腫瘤大小及ADC值．其中腫瘤體積明顯增大，14 d后腫瘤體積已經(jīng)達(dá)到初始時(shí)4～5倍大小(見圖2(a))．ADC值早期無明顯變化，7 d后，由于腫瘤體積增大，自身出現(xiàn)細(xì)胞凋亡及壞死，ADC值有一定上升．實(shí)驗(yàn)組動(dòng)物注射GO－PEG－Ce6后24 h進(jìn)行光熱和光動(dòng)力治療，光熱治療時(shí)，腫瘤處體表溫度可上升至48～49℃，可達(dá)到殺滅腫瘤的目的．光動(dòng)力治療后選取不同時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行MRI觀察，分別統(tǒng)計(jì)腫瘤大小和ADC值變化．其中單純光熱治療后細(xì)胞體積明顯變小，激光直接照射的表皮處表現(xiàn)最為明顯，而腫瘤細(xì)胞的凋亡和壞死也由此部分開始，而由于深部腫瘤細(xì)胞并未完全被殺死，長期觀察后腫瘤體積又有逐漸增大的趨勢．單純光動(dòng)力治療后腫瘤體積無明顯變化，治療后3 d，細(xì)胞有明顯凋亡和壞死，而由于未能完全殺滅腫瘤，故14 d后，殘余腫瘤細(xì)胞開始生長，腫瘤體積變大．光熱和光動(dòng)力系協(xié)同治療后，腫瘤殺傷效果明顯，3 d后腫瘤體積僅有很小殘余，ADC圖像也顯示細(xì)胞凋亡明顯，經(jīng)長期觀察后，腫瘤并未復(fù)發(fā)，完全殺死了腫瘤細(xì)胞．

圖2 活體磁共振成像Fig．2 In vivo MRI representative T2WI ADC － map and MRI evaluating tumor response after PTT

2．3 磁共振數(shù)據(jù)定量分析

圖3(a)為T2加權(quán)成像反映的腫瘤體積變化．其相對腫瘤體積(relative tumor volume)為不同觀察時(shí)間點(diǎn)的腫瘤體積與初始腫瘤體積的比值．其中PBS組中無治療效果，觀察過程中腫瘤體積逐漸增大，至觀察結(jié)束時(shí)，已達(dá)到初始體積的4～5倍．光動(dòng)力治療組中3 d時(shí)腫瘤體積略有減小，隨后又開始增大．光熱治療組中7 d內(nèi)腫瘤體積持續(xù)減小，但并未完全殺死腫瘤，14 d時(shí)腫瘤體積已有增大趨勢．聯(lián)合治療組中腫瘤體積在3 d時(shí)幾乎完全消失，此后亦無復(fù)發(fā)．圖3(b)為ADC值的變化，其中聯(lián)合治療組中ADC值從1 d起，顯著上升，3 d后，由于腫瘤幾乎完全消失，無法準(zhǔn)確測量ADC值．而光動(dòng)力治療組和光熱治療組中，3 d時(shí)ADC值均有明顯上升，表明其治療產(chǎn)生了一定的細(xì)胞殺傷作用，此后隨著腫瘤體積的增大，腫瘤內(nèi)部自發(fā)性地開始出現(xiàn)壞死等，其ADC值逐漸上升．PBS組中，隨著體積增大，ADC值逐漸升高．

圖3 不同治療方法的磁共振數(shù)據(jù)分析Fig．3 Effect of different treatment on the tumor

經(jīng)HE染色和CD31染色后，顯微鏡觀察拍照，如圖4所示，分析結(jié)果．PBS對照組中HE染色顯示細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，極少凋亡和壞死，CD31染色顯示組織血管豐富且完整．實(shí)驗(yàn)組中，HE染色可看到大面積的細(xì)胞凋亡及壞死，而由于激光穿透深度有限，故光熱治療組中，直接接受激光照射的表面壞死較為嚴(yán)重，CD31染色也表明其血管主要集中在激光未直接照射的組織處．單純光動(dòng)力治療中，未出現(xiàn)明顯的正常組織和破壞組織的分界，但也表現(xiàn)出部分損傷．光熱和光動(dòng)力協(xié)同治療組中，殺傷效果最明顯，幾乎無正常組織表現(xiàn)，也看不到完整的血管．

圖4 不同治療后腫瘤的HE染色和CD31染色Fig．4 HE stained images and CD31 stained images of different treatment

光熱和光動(dòng)力治療后，腫瘤細(xì)胞可出現(xiàn)缺血、壞死或其他乏氧病理變化［13］，水分子擴(kuò)散運(yùn)動(dòng)增強(qiáng)，ADC值升高．實(shí)驗(yàn)單純光熱和光動(dòng)力兩組中，ADC值在治療后1 d均有短暫升高，此后又下降，ADC圖上也有部分區(qū)域始信號始終沒有升高，該部分腫瘤并未完全殺死，經(jīng)一段時(shí)間后，腫瘤復(fù)發(fā)．而光熱和光動(dòng)力協(xié)同治療組在治療后，ADC值顯著上升，ADC圖上整個(gè)腫瘤區(qū)域均表現(xiàn)為高信號，表明腫瘤細(xì)胞殺滅較為徹底，同時(shí)解剖圖像上可看到3 d后腫瘤體積急劇減小，14 d后無復(fù)發(fā)．表明ADC是靈敏且有效的腫瘤預(yù)后標(biāo)志，結(jié)合腫瘤體積變化，可較好的反映光熱和光動(dòng)力治療效果．

3 結(jié)語

目前，新型納米材料的研究均停留在臨床前階段，雖然在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中均表現(xiàn)出良好的效果和臨床潛力，但要應(yīng)用到臨床研究中，還有許多問題要解決，如納米材料靶向性研究、基于納米粒子的原位腫瘤原位微創(chuàng)治療研究、影像學(xué)引導(dǎo)的精確治療研究、無創(chuàng)實(shí)時(shí)的療效評價(jià)體系等．實(shí)驗(yàn)使用磁共振成像方法對腫瘤治療效果進(jìn)行了評價(jià)和預(yù)測，希望可以為影像學(xué)評價(jià)體系的建立打開新的思路．同時(shí)，若能解決腫瘤光熱光動(dòng)力治療時(shí)的實(shí)時(shí)溫度監(jiān)測及實(shí)時(shí)組織含氧量等的監(jiān)測問題，將為醫(yī)學(xué)納米材料的發(fā)展提供重要的指導(dǎo)意義，同時(shí)也可為有臨床應(yīng)用潛力的納米粒子的進(jìn)一步研究提供指導(dǎo)．

通過實(shí)驗(yàn)，證實(shí)了擴(kuò)散加權(quán)磁共振成像可較好地反映光熱和光動(dòng)力治療效果，并對長期療效做出預(yù)測，可在指導(dǎo)納米粒子合成和臨床應(yīng)用方面發(fā)揮重要作用．

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