白 陽(yáng)（國(guó)家知識(shí)產(chǎn)權(quán)局專(zhuān)利局專(zhuān)利審查協(xié)作廣東中心，廣東 廣州 510530）

菌落總數(shù)測(cè)試片研究進(jìn)展

白 陽(yáng)
（國(guó)家知識(shí)產(chǎn)權(quán)局專(zhuān)利局專(zhuān)利審查協(xié)作廣東中心，廣東 廣州 510530）

菌落總數(shù)作為判定食品被污染程度的標(biāo)志，具有重要的衛(wèi)生學(xué)意義。菌落總數(shù)測(cè)試片具有攜帶方便、不用配制培養(yǎng)基的優(yōu)點(diǎn)，是一種新型的檢測(cè)工具。近年來(lái)專(zhuān)家學(xué)者圍繞菌落總數(shù)測(cè)試片進(jìn)行了相關(guān)研究。對(duì)這些研究進(jìn)行分析和綜合，具有一定的理論價(jià)值和現(xiàn)實(shí)指導(dǎo)意義。

菌落總數(shù)；測(cè)試片；研究進(jìn)展

食品是人類(lèi)賴(lài)以生存和發(fā)展的物質(zhì)基礎(chǔ)，而食品安全關(guān)系到人們的健康和國(guó)計(jì)民生，已經(jīng)越來(lái)越受重視。隨著社會(huì)的進(jìn)步，人們的生活水平不斷提高，有關(guān)部門(mén)加大了食品安全方面的執(zhí)法力度，其中菌落總數(shù)是食品衛(wèi)生檢驗(yàn)中最基本、最常見(jiàn)的微生物指標(biāo)檢測(cè)項(xiàng)目。國(guó)際微生物規(guī)格委員會(huì)將菌落總數(shù)定義為在被檢樣品的單位重量（g）、容積（mL）或表面積（cm2）內(nèi)，所含能于某種固體培養(yǎng)基上，在一定條件下培養(yǎng)后所生成的菌落的總數(shù)。菌落總數(shù)是判定食品被細(xì)菌污染程度的重要標(biāo)志，能反映食品加工及儲(chǔ)藏過(guò)程是否符合食品衛(wèi)生要求。通常認(rèn)為，食品中細(xì)菌數(shù)量越多，致病菌污染的可能性越大。菌落總數(shù)還可用于觀察食品中微生物的性質(zhì)以及微生物在食品中繁殖的動(dòng)態(tài)，以便在對(duì)被檢樣品進(jìn)行衛(wèi)生學(xué)評(píng)價(jià)時(shí)提供科學(xué)依據(jù)。近年來(lái)，隨著環(huán)境污染的加劇和生態(tài)平衡的破壞，人類(lèi)感染的致病菌的種類(lèi)越來(lái)越多，病原微生物對(duì)人類(lèi)的威脅越來(lái)越大，因此，采用適當(dāng)?shù)臋z驗(yàn)方法對(duì)食品菌落總數(shù)進(jìn)行檢測(cè)，是預(yù)防食源性中毒的重要手段。

1 食品中常見(jiàn)的微生物

引起食品污染的微生物種類(lèi)繁多。有的是在食品加工過(guò)程中被外界污染的細(xì)菌，如大腸桿菌、金黃色葡萄球菌等；有的是新鮮食品上正常的菌群在加工過(guò)程中殘留下來(lái)的微生物，如乳酸菌等；有的是食品工業(yè)上重要的發(fā)酵菌，如酵母菌等。某些殘留的細(xì)菌不僅可能引起食品腐敗變質(zhì)，還可能引起疾病。目前食品中常見(jiàn)的微生物有19個(gè)種屬，具體見(jiàn)表1。

表1 食品中常見(jiàn)的微生物菌屬

續(xù)表1

2 菌落總數(shù)傳統(tǒng)檢驗(yàn)方法

目前國(guó)內(nèi)食品中的菌落測(cè)定主要是按GB／T 4789.2—2010《食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn)菌落總數(shù)測(cè)定》標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行，采用平板計(jì)數(shù)法。根據(jù)樣品的實(shí)際污染情況，對(duì)樣品進(jìn)行 10倍遞增稀釋?zhuān)x擇 2～3個(gè)適宜稀釋度的樣品勻液，吸取 1 mL樣品勻液于無(wú)菌平皿內(nèi)，每個(gè)稀釋度做兩個(gè)平皿；將融化并冷至 45～50℃的平板計(jì)數(shù)瓊脂培養(yǎng)基傾注到各平皿內(nèi)，每皿15～20 mL，隨即轉(zhuǎn)動(dòng)平皿，使樣品與培養(yǎng)基充分混勻，待瓊脂凝固后，翻轉(zhuǎn)平皿，置于36±1℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng) 48±2 h；另取一個(gè)不加樣品的滅菌空平皿，加入 15～20 mL平板計(jì)數(shù)瓊脂培養(yǎng)基，待瓊脂凝固后，翻轉(zhuǎn)平皿，置于36±1℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng) 48±2 h，作為空白對(duì)照；按照 GB／T 4789.2—2010《食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn)菌落總數(shù)測(cè)定》標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行結(jié)果判定。一般來(lái)說(shuō)，傳統(tǒng)培養(yǎng)基成本較低，但采用傳統(tǒng)方法進(jìn)行菌落總數(shù)測(cè)定存在明顯不足［1］：一是培養(yǎng)基制備、儀器清洗、滅菌都需要較多的時(shí)間和人力，費(fèi)時(shí)費(fèi)力；二是由于傳統(tǒng)方法一般需要較長(zhǎng)時(shí)間，且需要特定的溫度，對(duì)實(shí)驗(yàn)室儀器及無(wú)菌條件要求較高，不適合野外操作；三是傳統(tǒng)培養(yǎng)方法中如果培養(yǎng)基的溫度過(guò)高，容易使待測(cè)樣品中的微生物因不適宜而受損，從而影響測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性。

3 菌落總數(shù)測(cè)試片

隨著檢測(cè)技術(shù)的不斷發(fā)展，先進(jìn)的檢測(cè)方法不斷出現(xiàn)。目前美國(guó) 3M公司的菌落總數(shù)測(cè)試片法在世界各地使用得比較多。菌落總數(shù)測(cè)試片是指以滅菌濾紙、無(wú)紡布或冷水可溶凝膠等吸收培養(yǎng)基作為載體，將特定的培養(yǎng)基和顯色物質(zhì)附著在載體上面，通過(guò)微生物在其上面的生長(zhǎng)、顯色情況來(lái)測(cè)定食品中微生物的一種產(chǎn)品。菌落總數(shù)測(cè)試片的顯著優(yōu)點(diǎn)［2］：第一，可測(cè)定少量檢品，不需要配制試劑和大量的玻璃器皿，操作簡(jiǎn)便，經(jīng)濟(jì)，實(shí)用；易于消毒保存，攜帶方便，價(jià)格低廉，能大大減少或消除對(duì)環(huán)境的污染，能減少試驗(yàn)后的清洗工作，能克服熱瓊脂法不適宜受損細(xì)菌恢復(fù)的缺陷，故適用于實(shí)驗(yàn)室、生產(chǎn)現(xiàn)場(chǎng)和野外工作環(huán)境。第二，可以在取樣的同時(shí)接種，結(jié)果更能真實(shí)地反映當(dāng)時(shí)樣本中的細(xì)菌數(shù)，防止由于細(xì)菌繁殖造成的數(shù)量增多。第三，不用進(jìn)行使用前的準(zhǔn)備工作，能大大節(jié)省時(shí)間、人力和物力。

3.1 菌落總數(shù)測(cè)試片研究進(jìn)展

3.1.1 菌落總數(shù)測(cè)試片載體

目前，濾紙、無(wú)紡布和冷水可溶性凝膠是 3種最常見(jiàn)的載體［3］。

濾紙。由于濾紙具有較大的間隙，用濾紙作載體，濾紙雙面和纖維之間容易有菌落生長(zhǎng)，使肉眼無(wú)法準(zhǔn)確判斷，所以測(cè)定結(jié)果一般比實(shí)際菌數(shù)要少；濾紙保水性差，檢驗(yàn)培養(yǎng)時(shí)又不能保持充分濕度，不利于菌體生長(zhǎng)；濾紙檢驗(yàn)卡存在營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)分布不均勻的問(wèn)題，加樣也不能迅速擴(kuò)散，致使菌體生長(zhǎng)分布不均勻；由于顯色指示劑系統(tǒng)單一，不能有區(qū)別地對(duì)細(xì)菌進(jìn)行計(jì)數(shù)，對(duì)真菌更差，所以很難全面推廣。

無(wú)紡布。無(wú)紡布是以紡織纖維為原料，經(jīng)過(guò)黏合、熔合或其他化學(xué)、機(jī)械方法加工而成的紡織品。無(wú)紡布有薄型和厚型兩大類(lèi)，可用以制成有透氣、防毒和加速擴(kuò)散等特殊用途的材料。德國(guó)拜發(fā)公司的RIDA?COUNT微生物菌落計(jì)數(shù)板和日本 CHISSO公司的SANITA-KUN微生物快速檢測(cè)片，都是以無(wú)紡布為載體的新型檢測(cè)片。無(wú)紡布加樣后能迅速擴(kuò)散，菌體生長(zhǎng)分布均勻；但無(wú)紡布和濾紙型菌落總數(shù)測(cè)試片都不能挑菌作進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)，因而影響其應(yīng)用前景。

冷水可溶性凝膠。冷水可溶性凝膠結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、透明、回收率高，且可進(jìn)行挑菌，方便對(duì)微生物做進(jìn)一步鑒定，使得此類(lèi)測(cè)試片的綜合評(píng)價(jià)較高，具有廣闊的應(yīng)用前景。冷水可溶性凝膠劑一般不是微生物的營(yíng)養(yǎng)成分，只起固化或黏合作用。3M公司的菌落總數(shù)測(cè)試片就是以冷水可溶性凝膠為載體的。理想的凝膠劑應(yīng)具備以下條件：不會(huì)被微生物分解利用，不會(huì)因高溫滅菌而受到破壞，在微生物生長(zhǎng)的溫度范圍內(nèi)保持固體狀態(tài)，對(duì)微生物及操作人員均無(wú)毒害作用，透明度好、凝固力強(qiáng)、價(jià)格低廉、配制方便。常見(jiàn)的凝膠劑有瓊脂、羧甲基纖維素鈉、明膠、丙烯酸鈉等［4］。目前關(guān)于測(cè)試片中凝膠劑的報(bào)道較少：國(guó)外，僅在美國(guó)的專(zhuān)利中報(bào)道過(guò)瓜爾膠、黃原膠、刺槐豆膠、聚丙烯酸系高分子化合物等，但報(bào)道得并不明確，也不系統(tǒng)；國(guó)內(nèi)，廣東環(huán)凱微生物測(cè)試科技有限公司研制的聚丙烯酸鈉可以作為菌落總數(shù)測(cè)試片的凝膠劑。

3.1.2 菌落總數(shù)測(cè)試片顯色培養(yǎng)基

一般的顯色培養(yǎng)基由營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、誘導(dǎo)劑和顯色劑組成。目前有關(guān)菌落總數(shù)顯色劑的報(bào)道比較單一，主要集中在氯化三苯四氮唑（TTC）和噻唑藍(lán)（MTT）上。TTC是目前最常用的顯色劑，并已成功應(yīng)用到菌落總數(shù)測(cè)試片上。TTC是一種氧化劑，細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)具有脫氫酶，在細(xì)菌脫氫酶的作用下，TTC接受氫（H）成為紅色而穩(wěn)定的三苯甲臜，使菌落呈現(xiàn)紅色，在細(xì)菌培養(yǎng)中，細(xì)菌在一定濃度TTC的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)而形成的菌落呈現(xiàn)紅色。在菌落總數(shù)測(cè)試片中形成紅色點(diǎn)狀物，出現(xiàn)在測(cè)試片之上，紅點(diǎn)的總數(shù)就是細(xì)菌的總數(shù)，這樣計(jì)數(shù)更加準(zhǔn)確。據(jù)報(bào)道，TTC濃度過(guò)高會(huì)對(duì)細(xì)菌的生長(zhǎng)產(chǎn)生抑制作用，所以菌落總數(shù)測(cè)試片中 TTC的濃度要以能靈敏顯示細(xì)菌生長(zhǎng)情況且對(duì)細(xì)菌無(wú)副作用為宜。當(dāng)培養(yǎng)基中的TTC濃度為0.005% ～0.01%時(shí)，基本無(wú)抑菌現(xiàn)象。誘導(dǎo)劑的添加情況對(duì)菌落總數(shù)測(cè)試片的快速檢測(cè)結(jié)果有重要影響。菌落總數(shù)測(cè)試片講究快速，由于一部分細(xì)菌在24 h后才逐漸顯現(xiàn)，所以在顯色培養(yǎng)基中加入一些誘導(dǎo)物質(zhì)以促進(jìn)細(xì)菌快速生長(zhǎng)顯得尤為重要。常見(jiàn)的誘導(dǎo)劑有血消化液、胱氨酸、肝心浸液等。1999年有報(bào)道顯示，在培養(yǎng)基中加入生長(zhǎng)促進(jìn)因子血消化液，可使這部分細(xì)菌在16 h后就能生長(zhǎng)出來(lái)，而不加促進(jìn)因子的培養(yǎng)基在 24 h后才開(kāi)始生長(zhǎng)。2004年有報(bào)道顯示，胱氨酸等物質(zhì)不僅具有增菌作用，還能增強(qiáng)顯色劑的色度。營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)方面除了要保證各類(lèi)細(xì)菌生長(zhǎng)所需的營(yíng)養(yǎng)外，還應(yīng)充分考慮顯色培養(yǎng)基緩沖體系，可以添加氯化鈉和磷酸二氫鉀等緩沖劑，以保證細(xì)菌平衡，不受損傷。

3.2 菌落總數(shù)測(cè)試片產(chǎn)品

目前比較成熟的菌落總數(shù)測(cè)試片產(chǎn)品主要有美國(guó)3M公司的PetrifilmTM細(xì)菌總數(shù)測(cè)試片和德國(guó)拜發(fā)公司的 RIDA?COUNT微生物菌落計(jì)數(shù)板。廣東環(huán)凱微生物科技有限公司也致力于菌落總數(shù)測(cè)試片的研究，并取得實(shí)質(zhì)性進(jìn)展。

3.2.1 美國(guó)3M公司的PetrifilmTM細(xì)菌總數(shù)測(cè)試片

美國(guó)3M公司發(fā)明的用于菌落計(jì)數(shù)的可再生水合物干膜（PetrifilmTMAerobie Count Plates）目前處于世界領(lǐng)先地位。它由上下兩層薄膜組成，下層的聚乙烯薄膜上印有網(wǎng)格且覆蓋有培養(yǎng)基，上層是聚丙烯薄膜。培養(yǎng)基中含有微生物生長(zhǎng)及生化實(shí)驗(yàn)所需的營(yíng)養(yǎng)及試劑，并通過(guò)一種冷水可溶性凝膠劑附著在上下兩層膜上。常用的凝膠劑為果阿膠，另外還有黃原膠、洋豆膠等。生化試劑有特異性顯色物質(zhì)和抗生素。待測(cè)樣品處理后不需要增菌，直接接種測(cè)試片，適宜溫度培養(yǎng)后計(jì)數(shù)。測(cè)試片的外觀呈長(zhǎng)方形，未開(kāi)封的鋁箔袋冷藏于8℃的冰箱中，已開(kāi)封的鋁箔袋應(yīng)用膠帶將封口封緊，置于常溫干燥處。

3M公司的PetrifilmTM測(cè)試片已通過(guò)國(guó)際組織AFNOR、FDA和AOAC的認(rèn)可。使用方法：揭起覆蓋的膠片，將 1 mL樣品懸液滴于測(cè)試片中央后蓋回，用壓板輕輕壓下，將樣品均勻地覆蓋于培養(yǎng)基上，靜置約1 min，使培養(yǎng)基中的凝膠固化；將測(cè)試片水平放于37℃恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)，細(xì)菌總數(shù)測(cè)試片培養(yǎng)48±3 h后所計(jì)的紅色菌落數(shù)即為細(xì)菌總數(shù)。

近年來(lái)，美國(guó)3M公司對(duì)測(cè)試片做了很大的改進(jìn)，在樣品接種后48 h可準(zhǔn)確報(bào)告結(jié)果。盧行安等對(duì)所選定的8類(lèi)未加工和已加工食品進(jìn)行菌落總數(shù)測(cè)定，利用3M公司的 PetrifilmTM菌落總數(shù)測(cè)試片測(cè)試，結(jié)果與采用 GB／T 4789.2—2010標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定所得無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異［5］。Heddeghen等用美國(guó) 3M公司測(cè)試片對(duì)鮮奶進(jìn)行檢測(cè)，其重復(fù)性較好。唐漪炎報(bào)道，采用3M公司的 PertifilmTM細(xì)菌總數(shù)測(cè)定紙片對(duì)消毒奶、酸奶、乳酸飲品、黃油、冰激凌、脫脂奶粉、奶酪、布丁、生奶等十余種產(chǎn)品進(jìn)行檢測(cè)，48±3 h報(bào)告結(jié)果，經(jīng)統(tǒng)計(jì)對(duì)比，兩種方法無(wú)顯著差別，細(xì)菌總數(shù)測(cè)定紙片法檢出率比國(guó)標(biāo)法高。

雖然3M公司的PetrifilmTM測(cè)試片具有快速、方便、靈敏度高、特異性強(qiáng)等特點(diǎn)，但仍存在一些不足：價(jià)格昂貴，目前尚不適合在食品生產(chǎn)企業(yè)及基層單位全面推廣；PetrifilmTM測(cè)試片上覆蓋一層薄膜，當(dāng)細(xì)菌產(chǎn)氣、產(chǎn)黏液過(guò)多時(shí)會(huì)出現(xiàn)菌落的擴(kuò)散，影響計(jì)數(shù)；計(jì)數(shù)方面，PetrifilmTM測(cè)試片面積較小，當(dāng)菌量大于 250 cfu時(shí)，準(zhǔn)確計(jì)數(shù)較困難；待測(cè)樣品中含有的某些有機(jī)物可能會(huì)使顯色減緩，從而降低目測(cè)效果，導(dǎo)致計(jì)數(shù)偏低；培養(yǎng)基吸水較慢，如果在未均勻分布前用力擠壓，會(huì)使稀釋液體從邊緣流出，影響結(jié)果；PetrifilmTM載體底板不透明，光源不能透射，不能用自動(dòng)計(jì)數(shù)儀計(jì)數(shù)，需更多人力物力。

3.2.2 德國(guó)拜發(fā)公司的 RIDA?COUNT微生物菌落計(jì)數(shù)板

德國(guó)拜發(fā)公司的 RIDA?COUNT微生物菌落計(jì)數(shù)板選用的載體為硝酸纖維素型無(wú)紡布，它是一種將脫水培養(yǎng)基附著于無(wú)紡布棉墊上的即用型檢測(cè)產(chǎn)品，由上下兩部分組成，上層為透明覆蓋膜，下層自上而下為無(wú)紡布層、底層涂有黏性物料的薄片和包含了培養(yǎng)基的水溶性復(fù)合膜。當(dāng)樣品液滴加在無(wú)紡布上時(shí)，會(huì)立刻擴(kuò)散并溶解于復(fù)合膜內(nèi)，形成高黏性的溶液，經(jīng)培養(yǎng)后形成菌落。

德國(guó)拜發(fā)公司的 RIDA?COUNT微生物菌落計(jì)數(shù)板已經(jīng)獲得國(guó)際組織 AOAC的認(rèn)可。使用方法：揭開(kāi)覆蓋膜，將1 mL樣品懸液緩緩且均勻地滴于無(wú)紡布上，靜置5 s，待樣液完全吸收后，緩緩地將覆蓋膜蓋回，注意不要壓蓋無(wú)紡布部分，可沿薄膜邊緣壓緊；將接種后的測(cè)試片水平放于37℃恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)，細(xì)菌總數(shù)測(cè)試片培養(yǎng) 48±2 h后所計(jì)紅色菌落數(shù)即為細(xì)菌總數(shù)。這種微生物菌落計(jì)數(shù)板的不足是：不能兩面數(shù)菌，易遺漏，影響計(jì)數(shù)；加樣液后容易出現(xiàn)褶皺；不能挑菌作進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)。

4 結(jié)語(yǔ)

目前，食品安全問(wèn)題已受到全社會(huì)的關(guān)注。食品安全檢測(cè)產(chǎn)業(yè)迅猛發(fā)展，菌落總數(shù)的傳統(tǒng)檢測(cè)方法能較好地對(duì)菌落總數(shù)進(jìn)行檢測(cè)。在GB／T 4789.2—2008和 SN／T 1987—2007標(biāo)準(zhǔn)中，菌落總數(shù)測(cè)試片法是菌落總數(shù)測(cè)定的方法之一。可以預(yù)見(jiàn)，菌落總數(shù)測(cè)試片法將逐步成為傳統(tǒng)檢測(cè)手段的重要補(bǔ)充，甚至可能逐步成為主流的檢測(cè)方法。菌落總數(shù)測(cè)試片具有良好的市場(chǎng)發(fā)展前景，但到目前為止，還未見(jiàn)過(guò)由我國(guó)自主研發(fā)的具有高靈敏度和高準(zhǔn)確性的菌落總數(shù)測(cè)試片產(chǎn)品的相關(guān)報(bào)道，對(duì)菌落總數(shù)的檢測(cè)仍主要采用傳統(tǒng)的方法或購(gòu)買(mǎi)較昂貴的國(guó)外產(chǎn)品，這對(duì)我國(guó)食品檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展造成了一定的阻障。因此，研發(fā)具有我國(guó)自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)、具有高靈敏度和高特異性的菌落總數(shù)測(cè)定產(chǎn)品成為一項(xiàng)重要且緊迫的任務(wù)。

［1］吳毓薇，吳許文，吳清平，等.食品衛(wèi)生微生物測(cè)試片檢測(cè)技術(shù)進(jìn)展［J］.中國(guó)衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志，2008，（12）：2832－2834.

［2］李鐵牛.紙片法檢測(cè)飲料中菌落總數(shù)的研究［D］.重慶：西南農(nóng)業(yè)大學(xué)，2004.

［3］孫永.食品衛(wèi)生微生物快速測(cè)試卡的研制［D］.北京：中國(guó)科學(xué)院研究生院，2007.

［4］呂嘉櫪，韓迪.MTT和 TTC在嗜酸乳桿菌菌落計(jì)數(shù)中的應(yīng)用［J］.中國(guó)乳品工業(yè)，2007，（4）：23－25.

［5］盧行安，顧其芳，袁寶君，等.AOAC PetrifilmTM菌落總數(shù)測(cè)試片法與食品中菌落總數(shù)測(cè)定國(guó)標(biāo)方法的比較研究［J］.中國(guó)食品學(xué)報(bào)，2011，（3）：164－167.

［責(zé)任編輯：羅 香］

Research Progress in Test Piece of Aerobic Bacterial Count

BAI Yang
（Patent Examination Cooperation Center of the Patent Office，SIPO，Guangzhou 510530，Guangdong，China）

As a target for the extent of contamination in food，aerobic bacterial count is very important in sanitization，and it is a new kind of detection tool which is convenient to carry and free of media preparation.In recent years，experts and scholars have carried out some investigations on aerobic count.The comprehensive analysis for these studies has certain theoretical value and practical guiding significance.

aerobic bacterial count；test piece；research progress

TS201.6

：A

：1006－8481（2015）02－0001－04

2014－11－02

白陽(yáng)（1987—），男，國(guó)家知識(shí)產(chǎn)權(quán)局專(zhuān)利局專(zhuān)利審查協(xié)作廣東中心，碩士。