楊 楊，張文強(qiáng)，李曉斌，郁 彭

(天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津 300457)

糖–量子點(diǎn)作為熒光探針研究糖–蛋白相互作用

楊 楊，張文強(qiáng)，李曉斌，郁 彭

(天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津 300457)

糖–蛋白的相互作用在多種病理和生理過程中扮演著重要角色．借助量子點(diǎn)(quantum dots，QDs)優(yōu)良的光學(xué)性質(zhì)、巨大的比表面積和良好的生物相容性，對(duì)其表面進(jìn)行寡糖修飾后得到的糖–量子點(diǎn)熒光探針，可以很好地模擬細(xì)胞表面的糖鏈結(jié)構(gòu)，為糖–蛋白、糖–糖的相互作用研究提供有力工具．本文主要介紹近年來興起的糖–量子點(diǎn)制備、表征及其在化學(xué)糖生物學(xué)中的應(yīng)用．

糖–量子點(diǎn)；糖簇效應(yīng)；糖–蛋白相互作用；熒光標(biāo)記

糖類化合物與核酸、蛋白質(zhì)一起并稱為3大類生命物質(zhì)，但是長(zhǎng)期以來，由于其結(jié)構(gòu)的多樣性和復(fù)雜性，加之評(píng)價(jià)手段的局限性，對(duì)其生物學(xué)作用的了解比較膚淺[1]．近年來，隨著現(xiàn)代分離、分析技術(shù)的進(jìn)步以及生物學(xué)研究的不斷深入，人們對(duì)糖類化合物的重要性有了越來越多的認(rèn)識(shí)．最近的研究結(jié)果表明，哺乳動(dòng)物細(xì)胞表面70%,的蛋白被糖基化修飾，糖鏈與其受體蛋白之間的相互識(shí)別在包括病毒入侵、免疫系統(tǒng)應(yīng)答和衰減、細(xì)胞增殖、受精和著床等多種生理和病理過程中起著重要作用[2]．研究糖鏈與其受體蛋白之間的相互識(shí)別和隨后引發(fā)的一系列調(diào)控作用[3]，是闡明細(xì)胞生物高級(jí)生命活動(dòng)的關(guān)鍵．由此應(yīng)運(yùn)而生的化學(xué)糖生物學(xué)[4]成為研究上述問題的重要手段和工具．

化學(xué)糖生物學(xué)主要運(yùn)用有機(jī)糖化學(xué)或酶促糖合成化學(xué)[5]制備各種廣義的寡糖探針(包括糖芯片、糖類衍生物、糖蛋白模擬物等)，并以此為工具研究生物體系中復(fù)雜糖蛋白及糖鏈的功能及其變化規(guī)律，為深入研究生命現(xiàn)象、調(diào)控糖蛋白的生物功能、尋找新的藥物靶點(diǎn)、發(fā)現(xiàn)新的生物活性物質(zhì)提供新的策略和手段[6]．

在化學(xué)糖生物學(xué)眾多的探針中，熒光探針由于具有靈敏度高、選擇性好、響應(yīng)時(shí)間短、可直接觀察等優(yōu)點(diǎn)[7]，一直被廣泛使用．隨著對(duì)糖鏈功能的進(jìn)一步研究，傳統(tǒng)的通過將有機(jī)熒光染料(FITC，Rhodamine，AlexaFluor 488等)連接于寡糖分子上制備的熒光探針已經(jīng)越來越不能滿足研究的需要．近年來，以量子點(diǎn)(Quantum dots，QDs)為主的熒光納米材料做骨架，經(jīng)寡糖修飾的寡糖納米材料(glyconanoparticles)的研究越來越引起化學(xué)糖生物學(xué)家的關(guān)注[8]．本文主要就近年來寡糖–量子點(diǎn)(glyco-QDs)探針的制備、表征及其在糖生物學(xué)研究中的應(yīng)用作以綜述．

1 糖簇效應(yīng)

在介紹寡糖探針之前，有必要首先介紹糖簇效應(yīng)(cluster glycoside effect)[9]．細(xì)胞表面的糖參與或介導(dǎo)的生物學(xué)過程的最初階段，被認(rèn)為是糖與位于細(xì)胞表面相應(yīng)的糖受體蛋白之間的結(jié)合．這些結(jié)合過程與特定的細(xì)胞生命活動(dòng)相關(guān)，因此自然而然地會(huì)讓人想到這種糖與蛋白的相互作用是專一性的，而且是高結(jié)合力的．但是體外研究表明單糖–蛋白的結(jié)合力很低(解離常數(shù)KD為mmol/L級(jí)別)，而且特異性也很差(不同的糖與同樣的蛋白之間幾乎具有相同的結(jié)合力).這樣就使得糖的低結(jié)合力、低特異性的特點(diǎn)與其能參與特異性細(xì)胞活動(dòng)的能力之間產(chǎn)生了矛盾[10]．

圖1 糖簇效應(yīng)機(jī)理Fig.1 Mechenism of cluster glycoside effect

“糖簇效應(yīng)”亦可以稱為“多價(jià)效應(yīng)(multivalent effect)”的提出部分地解決了這個(gè)問題．這一理論認(rèn)為細(xì)胞表面的糖基受體是成簇存在的，而且糖受體蛋白與糖的結(jié)合也是多位點(diǎn)的．大量的模型研究表明“糖簇效應(yīng)”的存在可以顯著地提高糖–蛋白的結(jié)合力．人們嘗試著從以下4個(gè)方面來解釋糖簇效應(yīng)的產(chǎn)生[11]：螯合效應(yīng)(chelating effect，圖1A)、受體簇集效應(yīng)(receptor clustering effect，圖1B)、亞位點(diǎn)結(jié)合效應(yīng)(subsite binding effect，圖1C)和統(tǒng)計(jì)效應(yīng)(statistical effect，圖1D)．以這一理論為指導(dǎo)，在各種分子骨架表面修飾多個(gè)功能性寡糖分子制備的多價(jià)寡糖探針用于化學(xué)糖生物學(xué)研究在21世紀(jì)初蓬勃興起．一大批寡糖受體蛋白的結(jié)構(gòu)和功能被逐步揭示，而這一結(jié)果又反過來對(duì)寡糖探針提出了更高的要求，因此尋找性質(zhì)更加優(yōu)良的糖探針成為了亟待解決的問題．

2 糖–量子點(diǎn)

大多數(shù)蛋白分子在尺度上和納米材料相近，這就使得使用納米材料作為骨架進(jìn)行糖簇探針的組裝成為可能[12]．更加重要的是納米材料具有巨大的比表面積，在其表面組裝上糖基配體，由此引發(fā)的糖簇效應(yīng)使得利用此類綴合物進(jìn)行糖生物學(xué)的研究變得更加便利．結(jié)合熒光納米材料量子點(diǎn)獨(dú)特的光學(xué)性質(zhì)，寡糖修飾的熒光納米探針應(yīng)運(yùn)而生．

2.1 量子點(diǎn)

量子點(diǎn)(QDs)又稱半導(dǎo)體納米微晶體，是一種由Ⅱ-Ⅵ族或Ⅲ-Ⅴ族元素組成的約2～20,nm 的納米晶粒．其中研究較多的主要是CdX(X＝S，Se，Te)．由于量子尺寸效應(yīng)，量子點(diǎn)具有發(fā)射熒光的特性，而且其發(fā)射波長(zhǎng)是可調(diào)的．與傳統(tǒng)的熒光染料相比，量子點(diǎn)具有如下的優(yōu)良特性：激發(fā)譜寬、發(fā)射譜窄、抗漂白能力強(qiáng)、其表面可以修飾多種功能基等[13–14]．

關(guān)于使用蛋白(抗體)進(jìn)行量子點(diǎn)修飾的文章已有大量專門的綜述，本文不做過多探討．下面主要介紹使用小分子寡糖進(jìn)行量子點(diǎn)的表面修飾的方法．

2.2 糖–量子點(diǎn)的制備

2.2.1 水相法

借鑒膠體金顆粒的合成方法[15]，早期量子點(diǎn)的制備是在水溶液中進(jìn)行的．這種策略直接在水相中加入金屬鹽(Cd(NO3)2、Zn(NO3)2等)，然后加入含巰基的寡糖分子，在調(diào)節(jié)pH呈堿性后，自動(dòng)組裝成具有納米結(jié)構(gòu)的糖功能化量子點(diǎn)[16–17]．

這種一釜化的方法雖然簡(jiǎn)便，但其缺點(diǎn)也是顯而易見的．最主要的就是使用這種方法制備的量子點(diǎn)顆粒較大(15,nm)，最大吸收半峰寬(150,nm)也比較寬，而且二硫鍵與金屬的結(jié)合對(duì)于熒光的核結(jié)構(gòu)有極大地破壞，使得熒光量子產(chǎn)率變低．針對(duì)以上的缺點(diǎn)，現(xiàn)在已經(jīng)比較少采用這種策略．

2.2.2 配體交換法

在糖–量子點(diǎn)綴合物的合成策略上，配體交換法成為現(xiàn)在被廣泛采用的策略(圖2)．該策略首先在有機(jī)相中制備出粒徑均一、光譜學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定、表面包裹有機(jī)分子(一般是三正辛基氧膦(TOPO)和油酸(OA))作為穩(wěn)定劑的量子點(diǎn)[18]，然后再使用含巰基的寡糖替換量子點(diǎn)表面原有配體，得到的糖–量子點(diǎn)最終由有機(jī)相進(jìn)入水相[19–22]，經(jīng)分離純化可以得到糖–量子點(diǎn)綴合物．

圖2 配體交換法合成糖–量子點(diǎn)(許可證號(hào)：357742069 5597)Fig.2 Preparation of glyco-QDs through ligand exchange (License No.3577420695597)

相比于一釜法，此種方法具有反應(yīng)終點(diǎn)易于辨認(rèn)，后處理簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)，但是由于巰基與量子點(diǎn)表面的共價(jià)結(jié)合仍然會(huì)破壞量子點(diǎn)的核殼結(jié)構(gòu)，在合成過程中會(huì)產(chǎn)生熒光淬滅和團(tuán)聚的現(xiàn)象．

2.3 糖–量子點(diǎn)的表征

綜合分析近年來發(fā)表的文章，對(duì)于糖–量子點(diǎn)的表征主要采取以下手段．粒徑大小主要使用透射電鏡進(jìn)行測(cè)量，水化半徑采用動(dòng)態(tài)光散射進(jìn)行測(cè)定，另有紫外、紅外、熒光發(fā)射譜等對(duì)其光學(xué)性質(zhì)進(jìn)行表征．但是如何對(duì)合成的納米材料進(jìn)行相對(duì)分子質(zhì)量的測(cè)定一直沒有很好地解決，大多數(shù)文章對(duì)這一問題均采取估算的辦法[23–24]，這就使得進(jìn)一步的定量糖–蛋白相互作用，進(jìn)而進(jìn)行動(dòng)力學(xué)常數(shù)的測(cè)定變得十分困難．

但是，科學(xué)家發(fā)現(xiàn)當(dāng)金顆粒的半徑達(dá)到一定的尺度時(shí)，一般是18～24個(gè)金原子集結(jié)成簇的情況下，此類納米材料(嚴(yán)格意義上應(yīng)該叫金簇(gold cluster))具有熒光特性，而且這種材料可以使用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(matrix-assisted laser desorption/ionization-time of flight，MALDI-TOF)進(jìn)行相對(duì)分子質(zhì)量的測(cè)量．最近的文獻(xiàn)報(bào)道，以蛋白為模板，在原位還原納米金簇(gold nanoclusters，AuNCs)已經(jīng)制備成功[25]，我們認(rèn)為這將成為未來糖–納米材料研究的一個(gè)值得關(guān)注的領(lǐng)域，有興趣的讀者可以閱讀相關(guān)文獻(xiàn)[26–27]．

2.4 糖–蛋白相互作用

以小分子寡糖對(duì)熒光納米材料進(jìn)行修飾，用以替代蛋白抗體對(duì)寡糖受體進(jìn)行研究一直以來受到化學(xué)糖生物學(xué)家的青睞，同時(shí)這也是近年來興起的涉及多學(xué)科交叉的熱點(diǎn)研究領(lǐng)域，許多課題組在這一方面進(jìn)行了開創(chuàng)性的工作．

Mukhopadhyay等[17]使用水相合成法用于甘露糖量子點(diǎn)合成，然后將這種糖–量子點(diǎn)綴合物用于大腸桿菌的黏附研究．由于大腸桿菌(E.,coli)ORN178表面存在可特異性結(jié)合甘露糖type 1型菌毛，在甘露糖–量子點(diǎn)的介導(dǎo)下，大腸桿菌在量子點(diǎn)周圍進(jìn)行聚集，而這種聚集又進(jìn)一步引發(fā)了量子點(diǎn)的聚集，產(chǎn)生出了大量的熒光；而作為對(duì)照組(E.,coli)ORN208則沒有這種現(xiàn)象產(chǎn)生．

Kikkeri等[20]和Yang等[21]使用含有半乳糖的末端結(jié)構(gòu)的糖–量子點(diǎn)，對(duì)人肝癌細(xì)胞(HepG2)進(jìn)行了標(biāo)記．進(jìn)一步地通過激光共聚焦和流式細(xì)胞技術(shù)，證實(shí)了HepG2細(xì)胞表面存在可以與末端半乳糖結(jié)構(gòu)的寡糖鏈結(jié)合，進(jìn)而介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)吞作用的去唾液酸受體(asialoglycoprotein receptor，ASGPR)，這種結(jié)合可以被siRNA所干擾．隨后的體內(nèi)研究表明含半乳糖末端的糖–量子點(diǎn)可以靶向性地進(jìn)入肝細(xì)胞．

Robinson等[19]使用配體交換策略制備了N–乙酰氨基葡萄糖–量子點(diǎn)綴合物(GlcNAc-QDs)和甘露糖–量子點(diǎn)綴合物(Man-QDs)．得到的糖–量子點(diǎn)綴合物平均粒徑 5,nm，表面寡糖數(shù)目大致為210．他們以此為探針進(jìn)行了寡糖受體介導(dǎo)受精過程中的識(shí)別研究(圖3)．在熒光顯微鏡下可以清晰看到GlcNAc-QDs和Man-QDs在海膽和小鼠精子表面的結(jié)合．進(jìn)一步的分析表明，海膽精子的頭部主要存在GlcNAc寡糖受體，而小鼠精子尾部主要存在Man寡糖受體.

圖3 GlcNAc-QDs和Man-QDs對(duì)海膽和小鼠精子的標(biāo)記(許可證號(hào)：3577400445045)Fig.3 Fluorescent labeling of sea-urchin and mouse sperm with N-acetylglucosamine and Mannose quantum dots(License No.3577400445045)

Yang等[23]和Yu等[24]使用1-巰基糖為修飾配體，兩相配體交換法制備了平均粒徑為3～5 nm的乳糖量子點(diǎn)(Lac-QDs)．通過核磁內(nèi)標(biāo)定量法結(jié)合電感耦合等離子體發(fā)射光譜(inductively coupled plasma optical emission spectrum，ICP-OES)，大致計(jì)算了上述綴合物的分子式，并在蛋白和細(xì)胞水平對(duì)上述量子點(diǎn)綴合物進(jìn)行了生物學(xué)效應(yīng)評(píng)價(jià)．結(jié)果表明乳糖-量子點(diǎn)不僅可以作為細(xì)胞表面的糖蛋白的模擬物用于糖-蛋白、糖-糖的相互作用分析，而且作為優(yōu)良的熒光探針可以方便地用于白細(xì)胞的標(biāo)記．

Ohyanagi等[22]采用化學(xué)與酶合成法聯(lián)用，合成了N–乙酰氨基乳糖(LacNAc)、唾液酸化N–乙酰氨基乳糖(sialyl LacNAc)、路易斯X寡糖抗原(Lex)和唾液酸化路易斯X寡糖抗原(sialyl Lex)等多種功能性寡糖，然后使用配體交換策略合成了上述多種寡糖修飾的量子點(diǎn)．隨后他們研究了各種寡糖-量子點(diǎn)綴合物在小鼠體內(nèi)的代謝情況，發(fā)現(xiàn)末端半乳糖結(jié)構(gòu)的glyco-QDs(LacNAc-PC-QDs，Lex-PC-QDs)經(jīng)代謝后主要集中在肝臟，而末端唾液酸結(jié)構(gòu)的glyco-QDs(sialyl LacNAc-PC-QDs，sialyl Lex-PC-QDs)在代謝后主要集中在腎臟(圖4)．

圖4 小鼠體內(nèi)糖–量子點(diǎn)綴合物的活體成像(美國(guó)化學(xué)學(xué)會(huì)許可轉(zhuǎn)載)Fig.4 ,Live animal imaging of glyco-PC-QDs in mice(reprinted with permission from American Chemical Society)

Benito-Alifonso等[28]合成了半乳糖和乳糖修飾量子點(diǎn)，隨后他們研究了HeLa細(xì)胞和Araki Sasaki細(xì)胞與上述寡糖量子點(diǎn)的相互作用(圖5)．結(jié)果表明，含有半乳糖末端的寡糖–量子點(diǎn)被HeLa細(xì)胞攝取后，主要存在于高爾基體，而對(duì)于Araki Sasaki細(xì)胞，半乳糖量子點(diǎn)主要分布于溶酶體，而乳糖量子點(diǎn)還在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)有分布．有趣的是當(dāng)以甘露糖分子取代量子點(diǎn)表面50%,的半乳糖后，與Araki Sasaki細(xì)胞共孵育的結(jié)果是，此寡糖量子點(diǎn)主要分布于早期內(nèi)涵體；而使用麥芽三糖50%,取代半乳糖后，與HeLa細(xì)胞共孵育的結(jié)果是熒光主要分布在高爾基體．盡管這一過程的機(jī)制目前還不清楚，但是可以肯定的是，寡糖分子對(duì)細(xì)胞代謝具有重要調(diào)控作用．

圖5 半乳糖、乳糖–量子點(diǎn)與HeLa和Araki Sasaki細(xì)胞相互作用(許可證號(hào)：3622900215112)Fig.5 Interactions between Galactose-QDs and HeLa and Araki Sasaki cells(License No.3622900215112)

3 展 望

糖–量子點(diǎn)作為新的熒光標(biāo)記物，在化學(xué)糖生物學(xué)中得到了廣泛地應(yīng)用．但是，在糖–量子點(diǎn)的合成中仍然有很多問題沒有解決，例如如何快速便捷地制備寡糖–量子點(diǎn)綴合物，尤其是非天然存在寡糖的量子點(diǎn)綴合物的制備仍是一大難點(diǎn)．現(xiàn)在通用的巰基取代法，由于巰基易氧化的性質(zhì)，最主要的是對(duì)量子點(diǎn)結(jié)構(gòu)的破壞使得熒光量子產(chǎn)率降低也是一個(gè)亟待解決的問題，仍需要進(jìn)一步的研究．另外，由于此類綴合物的特殊性質(zhì)，普通的有機(jī)化學(xué)分析方法不適用，這一類大分子物質(zhì)的結(jié)構(gòu)至今仍然沒有很好地確認(rèn)．最后由于半導(dǎo)體元素的存在，毒性問題將會(huì)制約這類探針進(jìn)一步的生物學(xué)應(yīng)用．但是我們相信，隨著研究的深入和多學(xué)科交叉的融合，上述問題終將得到解決．

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責(zé)任編輯：郎婧

Study of Carbohydrate-protein Interactions using Glyco-quantum Dots as Fluorescent Probes

YANG Yang，ZHANG Wenqiang，LI Xiaobin，YU Peng
(College of Biotechnology，Tianjin University of Science & Technology，Tianjin 300457，China)

Carbohydrate-protein interactions are important in a wide variety of physiological and pathological processes.A new glyconanotechnology，using quantum dots(QDs)with unique optical properties，a high specific surface area and good biocompatibilities as scaffolds to assemble oligosaccharides for multivalent display to mimic mammalian cell，has recently attracted considerable attention in studying carbohydrate-carbohydrate and carbohydrate-protein interactions.This review summarizes the latest reports on the preparation，characterization and application of the QDs in chemical glycobiology.

glyco-quantum dots；cluster glycoside effect；carbohydrate-protein interaction；fluorescent labeling

O62

A

1672-6510(2015)05-0001-06

10.13364/j.issn.1672-6510.20150023

2015-03-02；

2015-05-08

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(21402140)；國(guó)家國(guó)際科技合作專項(xiàng)資助項(xiàng)目(2013DFA31160)

楊 楊（1982—），男，天津人，副教授；通信作者：郁 彭，教授，yupeng@tust.edu.cn.

數(shù)字出版日期：2015-07-31；數(shù)字出版網(wǎng)址：http://www.cnki.net/kcms/detail/12.1355.N.20150731.1005.002.html.