徐文進，倪士峰

(西北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，陜西西安 710069)

復(fù)方圣愈湯，首載見于金·李杲所撰《醫(yī)宗 金鑒》之卷下［1］，是在以白芍、川芎、當歸，熟地為主要成分的四物湯基礎(chǔ)上輔以黃芪、黨參兩味藥材演變而來［2］。以上諸藥功效側(cè)重各有差異。因該方對心神不寧、心慌氣促、倦怠無力等癥療效顯著，故歷來被少林傷科醫(yī)家用來醫(yī)治血虛氣虛諸癥之良方，也為治療跌打骨傷等癥常用復(fù)方。

目前關(guān)于復(fù)方圣愈湯的相關(guān)研究已經(jīng)展開，且取得良好進展。其中大多集中于對其藥理活性方面的研究［2-15］。關(guān)于圣愈湯抗氧化作用，僅有方玉珍等報道了圣愈湯免疫與體內(nèi)抗氧化關(guān)系［16］。

本實驗通過運用GC-MS方法首次對少林傷科復(fù)方圣愈湯揮發(fā)油化學(xué)成分進行分析并對其體外抗氧化活性進行初步探討，旨在為更好地開發(fā)利用少林傷科醫(yī)藥資源提供科學(xué)參考依據(jù)。

1 實驗部分

1.1 實驗材料

復(fù)方圣愈湯主要組成藥材為:熟地(Rehmannia glutinosa)，白芍(Paeonia lactiflora Pall)，川芎(Ligusticum chuanxiong hort)，當歸(Angelica sinensis)，黨參(Angelica sinensis)及黃芪(Astragalus membranaceus)。以上中藥飲片均購自西安萬壽路藥材市場，并被西北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院倪士峰副教授所鑒定。

1.2 實驗試劑

(DPPH)1.1-二苯基-2三硝基苯肼;(BHT)2，6-二叔丁基對甲基苯酚;30%過氧化氫;鄰苯三酚;三氯化鐵;硫酸亞鐵;抗壞血酸;水楊酸;甲醇、氫氧化鈉及鹽酸。除鹽酸、30%(質(zhì)量分數(shù))過氧化氫外，其余試劑均為分析純。

1.3 實驗儀器與設(shè)備

FW100高速萬能粉碎機(北京中興);DZTW型調(diào)溫電熱套(北京永光);R系列旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海申生);UV-2550紫外可見分光光度計(日本島津);美國Agilent6890/5975色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀。

1.4 實驗方法

1.4.1 圣愈湯揮發(fā)油的提取 將熟地，白芍，當歸，川芎、黨參及黃芪飲片分別粉碎后，過0.125 mm孔徑篩，分別稱取20g，混裝入2L圓底燒瓶中，用水蒸氣連續(xù)加熱回流法蒸餾得揮發(fā)油0.228g，得率為0.062%。

1.4.2 圣愈湯揮發(fā)油化學(xué)成分分析 GC-MS分析測試條件。

色譜條件:HP-5MS彈性石英毛細管柱(30m×0.25mm，0.25μm)，進樣口溫度24℃。程序升溫為:起始70℃保留3min后，以2℃/min速率升溫到260℃，保溫2min;再以10℃/min速率升溫至280℃ 進樣量0.6μL(正己烷);載氣(流量)為氦氣(流量為0.9mL/min)，其余條件按參考文獻進行。

②質(zhì)譜條件:EI離子源;離子源溫度230℃;電離能量70eV;溶劑延遲3min;傳輸線溫度280℃;接口溫度250℃;掃描時間為0.3s;掃描間隔0.2s;掃描質(zhì)量范圍為35～450amu;電子倍增器電壓1700V;發(fā)射電流是60μA;四極桿溫度150℃。用上述條件分析圣愈湯復(fù)方揮發(fā)油，并用歸一化法計算主要峰相對面積。

1.4.3 圣愈湯揮發(fā)油清除自由基活性能力測定

1)清除DPPH自由基能力的測定

準確稱取DPPH標準品7.886mg，用甲醇定容至100mL，配制濃度為2×10-4mol/L質(zhì)量濃度為0.078 86 g/mL的DPPH儲備液置于冰箱中冷藏備用。分別配制并量取100μL不同質(zhì)量濃度的揮發(fā)油甲醇溶液于96微孔板內(nèi)，依次加入2×104mol/LDPPH甲醇溶液100μL，室溫下避光反應(yīng)30min，用紫外分光光度計于517nm波長處測定其吸光度，記為Ai;空白對照組以等體積甲醇溶液代替DPPH，同法測定，所測得的吸光度記為Aj;空白模型組以等體積甲醇代替樣品溶液，同法測定，所測得的吸光度記為An。以BHT為陽性對照，各實驗組平行測定3次取平均值。

2)清除超氧陰離子自由基能力的測定

用甲醇配制不同濃度的圣愈湯揮發(fā)油各2mL作為樣品溶液，加入3mLTris-Cl緩沖液，25℃恒溫水浴20min后，再加入1mL鄰苯三酚溶液，準確反應(yīng)4min后，再加入4mL抗壞血酸溶液，靜置30min，利用紫外分光光度計于420nm處測定其吸光度Ai;空白對照組以蒸餾水代替鄰苯三酚，同法測定，所得吸光度記為Aj;空白模型組以蒸餾水代替樣品溶液，同法測定，所測得吸光度記為An;以BHT為陽性對照，各實驗組平行測定3次取平均值。

3)清除羥基自由基能力的測定

取不同濃度的圣愈湯揮發(fā)油各2mL為樣品溶液，用甲醇配制。依次加入1mL硫酸亞鐵溶液、2mL水楊酸溶液、2mL 30%(質(zhì)量分數(shù))H2O2，靜置30min，利用紫外分光光度計于510nm處測定其吸光度Ai;空白對照組以甲醇代替硫酸亞鐵，同法測定，所得吸光度記為Aj;空白模型組以甲醇代替樣品溶液，同法測定，所得吸光度記為An;以BHT為陽性對照，各實驗組平行測定3次取平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 圣愈湯揮發(fā)油成分分析及結(jié)果

圣愈湯揮發(fā)油提取初段、中段及末段揮發(fā)油成分及含量差異之比較，如表1，2，3所示。圣愈湯揮發(fā)油提取初段，其成分中9C，11-亞油酸甲酯與鄰苯酸二甲酸質(zhì)量分數(shù)最高，分別為16.280%與10.530%;提取中段，表2.2說明，鐮葉芹醇與1-(2-羥基-4-甲氧苯基)乙酮為該段最高成分，其分別高達38.191%與24.767%;提取末段，表3可見，最高的分別為3-亞丁基-1-(3H)異苯丙呋喃酮(39.753)與 7，9-二叔丁基-1-4，5-氧雜螺(4，5)癸烷基-6，9-二烯-2，8-二酮(16.282%)。

2.2 揮發(fā)油清除自由基活性

自由基清除率(%)=［1-(Ai-Aj)/An］×100%，其中:An空白模型組吸光度;Ai樣品組吸光度;Aj空白對照組吸光度。計算樣品對各自由基清除率，得其對應(yīng)回歸方程并計算出相應(yīng)半數(shù)清除率EC50。EC50與樣品對自由基的清除作用呈反比，即EC50越小，則樣品自由基清除作用越強。

2.2.1 對DPPH自由基的清除作用 圣愈湯揮發(fā)油與BHT均能較好地清除DPPH自由基，在實驗濃度范圍內(nèi)其清除率呈量效關(guān)系，且相同條件下?lián)]發(fā)油清除率大于BHT。如圖1所示，揮發(fā)油回歸方程為y=0.009 4x+0.5(R2=0.946)，BHT為y=0.014 8x+0.31(R2=0.899 2)，EC50值揮發(fā)油為70.686mg/L，BHT為90.36mg/L?？梢娛ビ鷾珦]發(fā)油對DPPH自由基清除能力強于BHT。

表1 圣愈湯初段揮發(fā)油成分Tab．1 Compounds identified in volatile oil of Shengyu decoction(First part)

續(xù)表1

表2 圣愈湯中段揮發(fā)油成分Tab．2 Compounds identified in volatile oil of Huangqi Chifeng oecoction(middle part)

表3 圣愈湯末段揮發(fā)油成分Tab．3 Compounds identified in volatile oil of Huangqi Chifeng decoction(end part)

續(xù)表3

圖1 圣愈湯揮發(fā)油與BHT清除DPPH作用比較Fig.1 The clearance rate of essential oil from Shengyu Decoction to DPPH

2.2.2 對超氧陰離子自由基的清除作用 在實驗濃度測定范圍內(nèi)，圣愈湯揮發(fā)油與BHT對超氧陰離子自由基的清除率均隨濃度增大而增大，呈基本線性關(guān)系，揮發(fā)油對超氧陰離子自由基清除率高于 BHT，見圖2。揮發(fā)油回歸方程為 y=0.009 6x+0.525(R2=0.942 3)，BHT 為 y=0.003 2x+0.635(R2=0.966)，EC50揮發(fā)油為105.22 mg/L，BHT為125.88 mg/L?？梢娛ビ鷾珦]發(fā)油對超氧陰離子自由基清除能力強于BHT。

2.2.3 對羥基自由基的清除作用 在實驗濃度測定范圍內(nèi)，圣愈湯揮發(fā)油與BHT對羥基自由基的清除率均隨濃度增大而增大，呈基本線性關(guān)系，揮發(fā)油效果要高于BHT，見圖3。揮發(fā)油回歸方程為y=0.013 7x+0.28(R2=0.999 7)，BHT為y=0.143x+0.245(R2=0.976 8)，EC50揮發(fā)油為146.976mg/L，BHT 為 166.64 mg/L，表明圣愈湯揮發(fā)油對羥基自由基清除能力強于BHT。

通過對比合成抗氧化劑BHT，圣愈湯揮發(fā)油成分清除以上3種自由基的體外抗氧化能力清除上述3種自由基能力呈明顯量效關(guān)系，且清除結(jié)果數(shù)值均強于BHT。這說明其體外抗氧化效果顯著。但是，目前對該復(fù)方揮發(fā)油中清除自由基的主要作用成分及其作用機制仍不清楚，需深入研究。

圖2 圣愈湯揮發(fā)性物質(zhì)與BHT清除超氧陰離子自由基作用比較Fig.2 The clearance rate of essential oil form Shengyu Decoction to hydroxylradical

圖3 圣愈湯揮發(fā)性物質(zhì)與BHT清除羥基自由基作用比較Fig.3 The clearance rate of essential oil from Shengyu Decoction to hydroxylradical

3 結(jié)語

通過對比表1，2及3所顯示圣愈湯揮發(fā)油提取初段、中段及末段其成分及含量可知，不同時段圣愈湯揮發(fā)油成分與含量存在顯著差異。

本實驗研究的重點在于分析了少林傷科復(fù)方的揮發(fā)油成分，但從實驗結(jié)果無論是峰的個數(shù)，還是鑒定出化合物的個數(shù)與成分，均少于單味藥材中文獻報道的數(shù)量。究其原因，本實驗所討論少林傷科7個復(fù)方中的共計16種中藥材，全部購自于萬壽路藥材市場，而藥材市場中所銷售的藥材，往往都是經(jīng)過硫磺熏蒸加工后的中藥飲片。

中藥材經(jīng)硫磺熏制后雖然有便于貯存等益處，但是根據(jù)文獻報道及本次試驗結(jié)果，藥材經(jīng)硫磺薰制后成分其揮發(fā)性與含量均有所降低［17-22］。分析原因，該影響可能表現(xiàn)在兩個方面，一是不同藥材其揮發(fā)油沸點不同，在熏蒸過程中低沸點揮發(fā)油成分可能更易隨高溫逸出，二是各藥材揮發(fā)油化學(xué)成分之間是否存在相互反應(yīng)，導(dǎo)致其有效成分的損失。綜上所述，復(fù)方藥材揮發(fā)油成分減少的原因，尚有待于進一步實驗驗證。

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