藍(lán)永生，蔣艷杰，張殿宇

神經(jīng)電生理早在兩百年前已被人們所知，但限于記錄手段的制約，其發(fā)展較為緩慢。直到20世紀(jì)40年代，微電極技術(shù)的誕生把人們對神經(jīng)電的認(rèn)識帶入了新的時(shí)代。在此基礎(chǔ)上，隨著計(jì)算機(jī)技術(shù)及高精密電子設(shè)備的研發(fā)，人們對神經(jīng)電生理的研究進(jìn)入了高速發(fā)展時(shí)期。如今，神經(jīng)電生理記錄技術(shù)已經(jīng)成為研究神經(jīng)功能的重要手段。

1 神經(jīng)電信號

神經(jīng)電信號是指在靜息電位基礎(chǔ)上所發(fā)生的膜電位變化。靜息電位是指當(dāng)神經(jīng)元未受刺激時(shí)，細(xì)胞膜內(nèi)外的電位差。靜息電位的變化代表了神經(jīng)元功能的活動(dòng)狀態(tài)。神經(jīng)元膜電位變化分為局部電位和動(dòng)作電位。局部電位包括突觸后電位、感受器電位和效應(yīng)器電位等，目前在神經(jīng)電生理領(lǐng)域?qū)ν挥|后電位的研究較為廣泛。突觸后電位是指化學(xué)突觸傳遞在突觸后膜產(chǎn)生的突觸反應(yīng)，表現(xiàn)為膜電位偏離靜息電位的變化。依據(jù)其變化的方向和對突觸后神經(jīng)元興奮性的影響，可將突觸后電位分為興奮性突觸后電位和抑制性突觸后電位。興奮性突觸后電位是指前膜釋放的興奮性遞質(zhì)與突觸后膜對應(yīng)受體結(jié)合，使后膜Na+內(nèi)流速度大于K+外流速度，導(dǎo)致突觸后膜發(fā)生局部去極化，而產(chǎn)生興奮性突觸后電位。抑制性突觸后電位是指前膜釋放的抑制性遞質(zhì)使后膜Cl－大量內(nèi)流，而產(chǎn)生抑制性突觸后電位。由于突觸后電位屬于局部電位，所以其電位變化會隨著距離的延長迅速衰減，不能進(jìn)行長距離傳導(dǎo)。但作用于同一神經(jīng)元的多個(gè)突觸后電位可進(jìn)行整合，若多個(gè)未達(dá)到閾電位的突觸后電位通過整合達(dá)到閾電位水平，便會引發(fā)動(dòng)作電位。

動(dòng)作電位是指神經(jīng)元在靜息電位基礎(chǔ)上，受到刺激后膜電位所發(fā)生的快速變化過程。動(dòng)作電位由峰電位和后電位組成，通常意義的動(dòng)作電位主要指峰電位。峰電位包括從局部電位基礎(chǔ)上迅速去極化的上升支和膜電位迅速復(fù)極化形成的下降支。上升支系由刺激引發(fā)大量電壓門控Na+通道開放，在電壓差和濃度差的共同驅(qū)動(dòng)下，大量Na+內(nèi)流產(chǎn)生去極化所致。下降支則是由上升支的去極化導(dǎo)致大量電壓門控K+通道開放，大量K+外流產(chǎn)生復(fù)極化所致。動(dòng)作電位是在局部電位基礎(chǔ)上形成的，大小和形狀固定不變，并且可進(jìn)行長距離傳播。動(dòng)作電位是神經(jīng)元興奮和活動(dòng)的標(biāo)志，是神經(jīng)信息編碼的基本單元［1］。

2 神經(jīng)電生理記錄

由于神經(jīng)元的活動(dòng)主要表現(xiàn)在神經(jīng)電信號的產(chǎn)生、變化和傳播上，故對神經(jīng)電記錄和分析是研究神經(jīng)活動(dòng)過程的基本手段。目前對神經(jīng)電信號的記錄方式主要有細(xì)胞外記錄、細(xì)胞內(nèi)記錄、膜片鉗和腦電圖技術(shù)等。

2.1 細(xì)胞內(nèi)記錄

細(xì)胞內(nèi)記錄的方法是將記錄電極插入神經(jīng)元胞體內(nèi)，參考電極通常置于浴液內(nèi)，記錄神經(jīng)元膜內(nèi)的電位變化(圖1)。當(dāng)神經(jīng)元接受興奮性神經(jīng)遞質(zhì)時(shí)，Na+內(nèi)流使細(xì)胞內(nèi)電壓升高，此時(shí)記錄電極處的電壓和參考電極處電壓差發(fā)生變化，經(jīng)放大器放大后便是細(xì)胞內(nèi)記錄的神經(jīng)元電活動(dòng)。細(xì)胞內(nèi)記錄的原理是由于細(xì)胞膜相對溶液來說具有很大的電阻值，不易在膜兩側(cè)產(chǎn)生短路，也不易受到外界干擾，因此細(xì)胞內(nèi)技術(shù)記錄到的神經(jīng)電活動(dòng)較為真實(shí)，所記錄到的信號幅度較大，通常為數(shù)毫伏至百余毫伏;記錄到的神經(jīng)元電活動(dòng)信息比較全面，因此，細(xì)胞內(nèi)記錄是較為理想的神經(jīng)電生理記錄技術(shù)。

但由于此技術(shù)為單細(xì)胞記錄，要求將記錄電極插入胞體內(nèi)，因此對電極的定位和記錄的穩(wěn)定性要求很高。通常動(dòng)物的呼吸和心跳等正常生理活動(dòng)都會對細(xì)胞內(nèi)記錄產(chǎn)生影響，因此在離體記錄中應(yīng)用比較廣泛，而在清醒動(dòng)物中成功率較低［2－4］。雖然近年來一些新技術(shù)的出現(xiàn)，如頭部錨定技術(shù)［5］，使在體細(xì)胞內(nèi)記錄成為可能，但其較低的成功率仍然是阻礙細(xì)胞內(nèi)記錄進(jìn)一步發(fā)展的重要因素。此外由于細(xì)胞內(nèi)記錄使細(xì)胞受到物理損傷，導(dǎo)致細(xì)胞放電衰減，直至死亡，因此此技術(shù)不易進(jìn)行長時(shí)間記錄。

圖1 細(xì)胞內(nèi)記錄

圖2 細(xì)胞外記錄

2.2 細(xì)胞外記錄

細(xì)胞外記錄是把記錄電極插到被測神經(jīng)元附近(圖2)。而參考電極的位置通常會根據(jù)記錄對象而有所不同。如記錄在體腦部神經(jīng)元，通常會把參考電極固定在顱骨上;而當(dāng)記錄離體切片時(shí)，通常會將記錄電極放置在浴液中。此記錄方法的原理是當(dāng)記錄電極附近神經(jīng)元受到刺激時(shí)，細(xì)胞外液中帶電離子進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，使細(xì)胞膜附近的細(xì)胞外液產(chǎn)生電壓變化，并與參考電極處產(chǎn)生電壓差。用這種方法記錄腦部神經(jīng)元時(shí)，可以記錄到突觸后電位和動(dòng)作電位，但記錄不到靜息電位。而當(dāng)記錄周圍神經(jīng)時(shí)，只能記錄到動(dòng)作電位。因?yàn)橛眉?xì)胞外技術(shù)記錄外周神經(jīng)的方法通常是將記錄電極和參考電極都放置在神經(jīng)干上。記錄的原理是根據(jù)動(dòng)作電位具有長距離傳導(dǎo)性。當(dāng)動(dòng)作電位依次傳導(dǎo)至兩個(gè)電極位置時(shí)，導(dǎo)致兩個(gè)位置產(chǎn)生電壓差。突觸后電位由于不具備長距離傳輸型，因此不能被記錄。

由于細(xì)胞外記錄的電極不需穿過細(xì)胞膜，能夠保持細(xì)胞功能的完好，因此能夠保持真實(shí)的神經(jīng)元電活動(dòng)，也能夠進(jìn)行較長時(shí)間記錄?；诖颂攸c(diǎn)，細(xì)胞外記錄目前被廣泛應(yīng)用于檢測清醒動(dòng)物的神經(jīng)元電活動(dòng)。

但由于記錄電極位于各個(gè)神經(jīng)元之間，缺少細(xì)胞膜的隔離，因此記錄到的電位比較容易受到外界的干擾，即使電極尖端非?？拷窠?jīng)元，仍然會受到周圍神經(jīng)元電活動(dòng)的影響，記錄到的電位實(shí)質(zhì)為多個(gè)神經(jīng)元共同放電的總和，常稱作場電位。另外由于受細(xì)胞外液的分流作用，細(xì)胞外記錄到場電位幅度非常小，通常為μ級。因此，細(xì)胞外記錄不能精確地觀察細(xì)胞的正常極化狀態(tài)，所獲得的信息較少。

但近年來發(fā)展起來的微電極陣列技術(shù)，使細(xì)胞外技術(shù)獲得的信息量越來越多。此技術(shù)是在微區(qū)域內(nèi)平均排列多個(gè)電極進(jìn)行多點(diǎn)細(xì)胞外記錄。如在直徑約5mm的微區(qū)域內(nèi)排列8×8個(gè)直徑小于10um、間距最小30um的電極。運(yùn)用此技術(shù)可在微區(qū)域內(nèi)對神經(jīng)組織進(jìn)行較高空間和時(shí)間分辨率記錄［1］，以跟蹤分析神經(jīng)元電信號傳輸和處理過程，并可對學(xué)習(xí)和記憶過程進(jìn)行進(jìn)一步研究［6－10］。微電極陣列技術(shù)的出現(xiàn)促進(jìn)了細(xì)胞外記錄的進(jìn)一步發(fā)展，成為神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)研究的重要技術(shù)。

2.3 膜片鉗記錄

膜片鉗記錄是對電極尖端吸附的細(xì)胞膜片進(jìn)行膜電流記錄的方法，是在電壓鉗基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種新技術(shù)，可將細(xì)胞膜上一個(gè)通道的電位固定在一定水平，觀察流過通道的離子電流。膜片鉗記錄屬于單細(xì)胞記錄，因此通常進(jìn)行離體切片記錄。記錄的方法可分為細(xì)胞貼附式、全細(xì)胞記錄、內(nèi)面向外式和外面向外式［1］。

細(xì)胞貼附式是膜片鉗技術(shù)中其它記錄方法的基礎(chǔ)。記錄的方法是用微電極接觸細(xì)胞膜，對微電極施加負(fù)壓，使細(xì)胞膜吸附在微電極開口處，并形成GΩ以上的抗阻使之封接，在電學(xué)上使被封接的細(xì)胞膜與周圍組織絕緣，并在此基礎(chǔ)上固定電位，對被封接細(xì)胞膜上的離子電流進(jìn)行記錄(圖3)。這種方式能夠保持細(xì)胞的完整性，保證離子的跨膜運(yùn)動(dòng)按照正常方式進(jìn)行。因此若被封接的細(xì)胞膜只有單個(gè)離子通道，便能夠進(jìn)行單通道記錄。

圖3 細(xì)胞貼附式

圖4 全細(xì)胞模式

全細(xì)胞模式是在細(xì)胞吸附模式上給細(xì)胞膜進(jìn)一步施加負(fù)壓，將被封接膜片打穿，記錄膜片以外部位的全細(xì)胞膜的離子電流(圖4)。記錄的原理類似于電壓鉗技術(shù)，當(dāng)胞內(nèi)有離子電流流出時(shí)，通過記錄電極向胞內(nèi)補(bǔ)充反向等量電流，以使膜電位數(shù)值保持不變。通過測量經(jīng)過微電極的電流，間接分析細(xì)胞興奮時(shí)的離子電流。此外，全細(xì)胞模式也可開展電流鉗記錄。電流鉗記錄的原理與細(xì)胞內(nèi)記錄相似，是通過破壞細(xì)胞膜，使記錄電極與細(xì)胞內(nèi)液直接接觸，形成低阻抗連接。細(xì)胞膜相對細(xì)胞內(nèi)液和細(xì)胞外液具有很高的抗阻，所以神經(jīng)元產(chǎn)生的跨膜離子電流全部通過抗阻較小的穿孔處流入記錄電極，從而記錄到整個(gè)神經(jīng)元的電位活動(dòng)。因此，全細(xì)胞模式既能記錄膜電位和動(dòng)作電位，也能記錄整個(gè)細(xì)胞的電流和不同的離子通道電流，此技術(shù)在神經(jīng)生物學(xué)的研究中發(fā)揮著越來越重要的作用。

內(nèi)面向外模式在細(xì)胞吸附模式基礎(chǔ)上，將形成巨阻抗封接的膜片微電極向上提起，使膜片從細(xì)胞體上被切割下來(圖5)。此模式的主要優(yōu)點(diǎn)是可經(jīng)浴液介導(dǎo)調(diào)控細(xì)胞內(nèi)液的條件。外面向外模式是以全細(xì)胞模式為基礎(chǔ)，將膜片微電極向上提起得到切割分離的膜片，膜外面自然封閉而對外(圖6)。這種模式的主要優(yōu)點(diǎn)是可經(jīng)浴液介導(dǎo)自由改變細(xì)胞外液的條件。

圖5 內(nèi)面向外模式

圖6 外面向外模式

膜片鉗技術(shù)的主要優(yōu)點(diǎn)在于巨阻封接使露出的電流極少，能夠正確地進(jìn)行電壓固定。而不足之處在于形成巨阻封接時(shí)形成的“Ω”膜片，對細(xì)胞造成了不可避免的機(jī)械性刺激。但膜片鉗技術(shù)的發(fā)現(xiàn)對生理科學(xué)和神經(jīng)科學(xué)都是一次有重大意義的變革，給生命科學(xué)帶來了巨大的前進(jìn)動(dòng)力。而此技術(shù)的四種記錄方式各有特點(diǎn)，應(yīng)根據(jù)實(shí)驗(yàn)的目的和材料進(jìn)行選?。?1］。

2.4 腦電圖技術(shù)

腦電圖技術(shù)是用現(xiàn)代電子放大技術(shù)，從放置在頭皮上的電極描記出腦神經(jīng)細(xì)胞的自發(fā)生物電活動(dòng)，通過腦電圖儀加以放大后記錄的腦電波形［12］。在實(shí)際應(yīng)用中，除了可將記錄電極放置于頭皮表面外，還可以放置于皮質(zhì)表面和皮質(zhì)內(nèi)部，參考電極需要放置于沒有電位變化的部位，如耳垂、鼻尖和乳突部等。通常所提及的“腦電”是指頭皮腦電［13］。

腦電圖技術(shù)與細(xì)胞內(nèi)記錄、細(xì)胞外記錄和膜片鉗記錄相比具有操作方便、記錄過程無損傷等優(yōu)點(diǎn)，因此被廣泛應(yīng)用于人類腦功能研究。此技術(shù)的記錄原理與細(xì)胞外記錄相似，由于神經(jīng)元群同時(shí)發(fā)生電位變化，在其周圍產(chǎn)生電場，與參考電極處產(chǎn)生電位差而記錄到電位變化。不同之處在于腦電圖技術(shù)的記錄電極與發(fā)生電位變化的神經(jīng)元之間相隔顱骨和頭皮等高阻抗組織，并且距離較遠(yuǎn)，因此信號源需產(chǎn)生足夠強(qiáng)的電場才能使帶電離子到達(dá)頭皮表面。動(dòng)作電位由于不具備疊加性，且持續(xù)時(shí)間較短，致使形成的電場較小而很難被記錄。而突觸后電位由于可發(fā)生時(shí)空積累，具備形成“強(qiáng)大”電場的條件，因此關(guān)于腦電的來源，認(rèn)同比較多的觀點(diǎn)是來自突觸后電位變化的總和。另外產(chǎn)生突觸后電位的腦部神經(jīng)元需具有排列緊密且方向一致的特點(diǎn)，這樣有利于產(chǎn)生的電流在空間中的積累，而大腦皮質(zhì)中錐體細(xì)胞恰好符合這一特點(diǎn)。因此通過腦電圖技術(shù)記錄到的電位變化實(shí)質(zhì)為錐體細(xì)胞產(chǎn)生的突觸后電位變化的總和。另外錐體細(xì)胞群接受相似的輸入，并且以方向和時(shí)程相似的電位變化對輸入作出響應(yīng)，有利于產(chǎn)生的電流在同一時(shí)間積累。這些特點(diǎn)使錐體細(xì)胞群可累積較強(qiáng)的電場，從而穿透顱骨和頭皮等組織而被采集。其它部分的神經(jīng)元由于排列方向不一致，產(chǎn)生的電場相互抵消，而不能被記錄［15］。目前此技術(shù)記錄的自發(fā)腦電主要用于腦功能障礙性疾病的輔助診斷。而大腦除自發(fā)腦電之外，多數(shù)時(shí)間是在接受和處理刺激。大腦接收某種刺激后，在腦的特定區(qū)域出現(xiàn)的電位反應(yīng)叫做誘發(fā)電位。

誘發(fā)電位是在自發(fā)腦電基礎(chǔ)上形成的，其幅度較小，被掩蓋在自發(fā)腦電中而很難分辨。但因?yàn)槟X神經(jīng)元接收特定的刺激后會在固定的時(shí)間內(nèi)出現(xiàn)相同的電位變化，因此誘發(fā)電位具有潛伏期恒定和波形恒定兩個(gè)特征。通過這一特征，可以通過給受試者重復(fù)進(jìn)行特定刺激，將記錄的數(shù)據(jù)進(jìn)行疊加后再平均，就可以將隨機(jī)變化的自發(fā)腦電抵消而提取到誘發(fā)電位。目前誘發(fā)電位被廣泛應(yīng)用于視覺、聽覺和認(rèn)知等領(lǐng)域研究。

記錄電極和信號源距離較遠(yuǎn)，并且相隔顱骨和頭皮等組織，帶電離子到達(dá)頭皮的過程中，會被分流到頭皮其它位置，因此腦電圖技術(shù)記錄的是大腦中很多信號源產(chǎn)生的電位在記錄點(diǎn)疊加起來的結(jié)果，而不能簡單地把頭皮對應(yīng)的激活位置映射到皮層上去。基于此原理，腦電信號源的精確定位一直沒有得到很好的解決。目前解決此問題的方法有間接推算法和直接測量法。簡介推算法主要為腦電溯源分析，此方法是根據(jù)頭表測量的電位信號，反演估計(jì)腦內(nèi)神經(jīng)活動(dòng)源的位置、方向和強(qiáng)度信息。借助現(xiàn)有的高靈敏度電子設(shè)備，此方法可將腦電的時(shí)間分辨率精確到毫秒級。但由于腦部解剖結(jié)構(gòu)較復(fù)雜，現(xiàn)有的溯源分析算法仍然缺乏準(zhǔn)確性。直接測量法通常是將功能性磁共振成像技術(shù)與腦電技術(shù)結(jié)合，此方法可使空間分辨率達(dá)到毫米水平，但時(shí)間分辨率相對較小，通常以秒為單位，而腦部電活動(dòng)通常以毫秒為單位，因此功能性磁共振成像技術(shù)在時(shí)間分辨率上還不能充分滿足研究的需要。

3 展望

神經(jīng)電生理技術(shù)是“窺視”神經(jīng)活動(dòng)的窗口，自誕生以來一直受到廣大神經(jīng)研究者的青睞。近年來其它新技術(shù)的不斷涌現(xiàn)，對神經(jīng)電生理技術(shù)的進(jìn)一步發(fā)展起到了很強(qiáng)的促進(jìn)作用。如無線遙測設(shè)備的小型化和輕量化，使人們觀察自然環(huán)境中動(dòng)物的神經(jīng)電活動(dòng)成為可能［15－17］;光感調(diào)控技術(shù)的興起，為人們研究特定神經(jīng)元功能及神經(jīng)環(huán)路等提供了新的方法［18］。隨著神經(jīng)電信號收集和處理技術(shù)的提高，以及其它輔助技術(shù)的發(fā)展，神經(jīng)電生理技術(shù)將會在神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域發(fā)揮越來越重要的作用。

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