蔣欣欣 張海德 王偉濤 廖 蕓

(海南大學(xué)食品學(xué)院1，?？?570228)(河北經(jīng)貿(mào)大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院2，石家莊 050061)

檳榔油急性毒理試驗(yàn)及其自微乳特性研究

蔣欣欣1張海德1王偉濤1廖 蕓2

(海南大學(xué)食品學(xué)院1，?？?570228)(河北經(jīng)貿(mào)大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院2，石家莊 050061)

研究檳榔油的毒理安全性及微乳化特性，研制出檳榔油自乳化傳遞系統(tǒng)，以便提高檳榔油的生物利用度。通過檳榔籽油對SD大鼠灌胃給藥急性毒性試驗(yàn)，研究其安全性；通過溶解度試驗(yàn)、濁點(diǎn)測試、三相圖的繪制和星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法的優(yōu)化等試驗(yàn)，以自微乳乳化前后表征、微乳液粒徑，Zeta電位為指標(biāo)，優(yōu)化篩選出各組分的最佳組合和最適配比。結(jié)果表明，進(jìn)行毒性試驗(yàn)的動物均未見明顯的毒性癥狀，體重未見明顯影響，各主要生命器官剖檢均未見異常；檳榔油自微乳的最佳配方為：檳榔油(19.56%)、聚氧乙烯氫化蓖麻油(54.31%)、乙二醇單乙基醚(26.13%)，平均粒徑為54.34 nm，zeta電位為-33.82 mV。檳榔油安全范圍大，無毒副作用，制備檳榔油自微乳穩(wěn)定性好。

檳榔油 毒理試驗(yàn) 自乳化 星點(diǎn)設(shè)計(jì)

檳榔果是棕櫚科植物檳榔(ArecaCatechuL )的成熟種子，由檳榔殼和檳榔籽組成。檳榔籽具有多種生理活性物質(zhì)，檳榔籽中含有檳榔油脂10%～18%[1-2]，檳榔果所含脂肪酸組成復(fù)雜，其脂肪酸類成分對人體有重要生理功能，其主要脂肪酸為：月桂酸19.5%，肉豆蔻酸46.2%，棕櫚酸12.7%，硬脂酸1.6%，癸酸0.3%，油酸6.2%，亞油酸5.4%，十二碳烯酸0.3%，十四碳烯酸7.2%[3]。這些活性成分對人體內(nèi)DPPH自由基、ABTS自由基有良好的清除作用[4-5]，也有研究發(fā)現(xiàn)檳榔油具有抗炎、抑制微生物生長等作用[6-7]，在對大鼠的試驗(yàn)?zāi)Ｐ脱芯恐?，檳榔油和檳榔堿協(xié)同作用，能夠降低血脂，防止動脈粥樣硬化[8]。

自微乳藥物傳遞系統(tǒng)(self-microemulsifying drug delivery system，SMEDDS)為由油相，表面活性劑和助表面活性劑組成的口服制劑，能夠使難溶于水的組分在水相中稀釋后經(jīng)輕微攪拌或自發(fā)形成動力學(xué)和熱力學(xué)穩(wěn)定的納米級微乳[9]，藥物在人體胃消化系統(tǒng)蠕動過程中形成納米級微乳，以此提高溶解性，以及在小腸部位獲得更大的生物利用度[10]。

本試驗(yàn)研究檳榔籽油對SD大鼠產(chǎn)生的急性毒性反應(yīng)及嚴(yán)重程度、產(chǎn)生毒性反應(yīng)的靶器官，確定無毒反應(yīng)的劑量，以評估檳榔籽油用藥的安全性。根據(jù)檳榔油的脂肪酸組成特征，選取合適表面活性劑及助表面活性劑，優(yōu)化出最佳檳榔油自微乳處方。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

實(shí)驗(yàn)動物：無特定病原體(SPF級)SD大鼠64只，雌雄各半，雌性無孕，體重180～220 g，湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動物有限公司提供，實(shí)驗(yàn)動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(湘)2009-0004，實(shí)驗(yàn)動物合格證號：HNASLKJ20120444。

檳榔籽：取自新鮮檳榔(海南品種，采自海南五指山農(nóng)場) ，50 ℃烘干粉碎；吐溫20、吐溫80、1,2-丙二醇、PEG-400、正丁醇、石油醚：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；Cremophor EL(EL-35，聚氧乙烯氫化蓖麻油)：阿拉?。籐abrasol(聚乙二醇-8-甘油辛酸)、 Transcutol(乙二醇單乙基醚)：法國Gattefosse公司。

Zetasizer Nano S90激光粒度儀：英國Malvern；CW-2000型超聲-微波協(xié)同萃取儀：上海新拓微波溶樣測試有限公司；RE52CS-2旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海亞榮生化儀器廠； TG16-WS高速離心機(jī)：長沙平凡儀器儀表有限公司；85-1恒溫磁力攪拌器：常州澳華儀器有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 檳榔籽油及其制備方法[3]

用超聲-微波協(xié)同萃取法制備檳榔籽油樣品，石油醚為萃取劑，提取時(shí)間22 min、溫度65 ℃、液料比11∶1(mL/g)，微波功率50 W，頻率40 kHz。

1.2.2 檳榔油對SD大鼠急性毒理試驗(yàn)

依據(jù)《中藥、天然藥物急性毒性研究技術(shù)指導(dǎo)原則》和檳榔籽油相關(guān)信息，采用“最大給藥量”法進(jìn)行檳榔籽油對SD大鼠灌胃給藥急性毒性試驗(yàn)[11-12]。

1.2.2.1 預(yù)試驗(yàn)

依據(jù)檳榔籽油相關(guān)信息，檳榔籽油對SD大鼠可能不存在明顯的急性毒性。因此，按最大灌胃給藥體積(20 mL/kg)和最大給藥濃度進(jìn)行檳榔籽油對SD大鼠灌胃給藥急性毒性預(yù)試驗(yàn)。1日內(nèi)給藥2次，時(shí)間間隔為4 h，給藥前禁食12 h，不禁水。

給藥時(shí)觀察藥物對動物的毒性反應(yīng)情況、死亡數(shù)和死亡時(shí)間。依據(jù)表1每天觀察1次動物的一般癥狀。

1.2.2.2 正式試驗(yàn)

1)動物分組

取60只檢疫合格的SPF級SD大鼠，隨即分為供試品組、陰性對照組和空白對照組，每組20只，雌雄各半，雌者無孕。供試品組給予檳榔籽油，陰性對照組給予無菌水，空白對照組不給藥。

根據(jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，4只大鼠在給藥后均未見異常。正式試驗(yàn)按“最大給藥量”法進(jìn)行正式試驗(yàn)，按大鼠最大灌胃給藥體積20 mL/kg給予供試品檳榔籽油原液。供試品和陰性對照品均為1日內(nèi)給藥2次，時(shí)間間隔為4 h，全部藥量在20 s內(nèi)勻速給完。供試品和陰性對照品給藥途徑均為灌胃給藥，給藥前禁食12 h，不禁水。

2) 癥狀觀察

給藥時(shí)觀察藥物對動物的毒性反應(yīng)情況、死亡數(shù)和死亡時(shí)間，從給藥當(dāng)日到給藥后14 d，依據(jù)表1每天觀察動物的一般癥狀至少1次。

3) 尸體檢查

試驗(yàn)期間對死亡動物進(jìn)行大體剖檢，檢查各主要生命器官(心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、腎上腺、胸腺、膀胱、睪丸、附睪、子宮、卵巢和腸道等)檢查及給藥局部是否異常。

4) 體重

給藥前和給藥后1、3、7和14 d用電子天平各稱量1次體重。

5) 病理檢查

所有的試驗(yàn)動物均應(yīng)進(jìn)行大體解剖，包括試驗(yàn)過程中因?yàn)l死而處死的動物、死亡的動物以及試驗(yàn)結(jié)束時(shí)仍存活的動物。任何組織器官出現(xiàn)體積、顏色、質(zhì)地等改變時(shí)，及時(shí)進(jìn)行復(fù)診，必要時(shí)拍照，同時(shí)進(jìn)行組織病理學(xué)檢查[13]。

1.2.3 檳榔油微乳液的制備及乳化效果評價(jià)[14]

選取檳榔油作為油相，Tween 80、Tween 20、EL-35、Labrasol作為乳化劑，丙二醇為助乳化劑，取1 g自乳化液加入到100 mL水中，調(diào)整磁力攪拌器轉(zhuǎn)速為中速，室溫?cái)嚢? min成乳。以成乳前各組分的相融性、成乳時(shí)的自發(fā)性、分散性及成乳后的離心效果作為綜合評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)。

不同乳化劑濁點(diǎn)不同，乳化能力也不同，助表面活性劑可以提高乳化劑濁點(diǎn)。通過考察不同助表面活性劑在添加量為質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%時(shí)對10 mg/mL的Tween 80溶液濁點(diǎn)(采用甘油浴加熱)的影響，來選取助表面活性劑。

表1 癥狀觀察表

1.2.4 乳液粒徑及zeta電位的測定

將不同配比的自微乳在室溫下用蒸餾水稀釋100倍，用磁力攪拌器混勻5 min。根據(jù)動態(tài)光散射原理，用激光粒度儀測定微乳液的乳液粒徑以及zeta電位，檢測波長為633 nm,設(shè)置檢測散射光檢測角度為90°，電位測定選用Zeta dip cell樣品槽。

1.2.5 三相圖的繪制

以檳榔油為油相，在室溫下將表面活性劑與助表面活性劑以不同質(zhì)量比例(Km)充分混合，再與檳榔油按質(zhì)量比9∶1、8∶2、7∶3、6∶4、5∶5、4∶6、3∶7、2∶8和1∶9混勻，稀釋至100 mL蒸餾水中并用磁力攪拌器攪拌混勻，觀察記錄不同比例的成乳情況，以形成微乳區(qū)域?yàn)橹笜?biāo)繪制三相圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 檳榔油對SD大鼠急性毒理試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 癥狀觀察

在預(yù)試驗(yàn)和正式試驗(yàn)中，按照癥狀觀察表的各項(xiàng)指標(biāo)進(jìn)行觀察，未出現(xiàn)毒性反應(yīng)情況和死亡，動物在給藥后均未見異常。

2.1.2 尸體檢查

對恢復(fù)期處死動物進(jìn)行大體剖檢，檢查各主要生命器官(心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、腎上腺、胸腺、膀胱、睪丸、附睪、子宮、卵巢和腸道等)，結(jié)果均未見異常。

2.1.3 體重

給藥前和給藥后1、3、7和14 d各稱量1次體重，各供試品給藥組動物平均體重分別和陰性對照組動物平均體重用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)分析軟件對體重?cái)?shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，根據(jù)表2結(jié)果表明：給藥前和給藥后1、3、7和14 d，供試品組大鼠體重和空白對照組比較P>0.05，無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。說明在此次急性毒性試驗(yàn)中，檳榔籽油對大鼠體重影響和空白對照組比較無明顯影響。

表2 大鼠體重增長情況

張海德等[15]對檳榔籽油進(jìn)行GC-MS成分分析研究，成分主要是中長鏈脂肪酸以及各種活性成分，并未發(fā)現(xiàn)有毒副作用成分。在此基礎(chǔ)上進(jìn)行檳榔油對大鼠的急性毒理試驗(yàn)，動物均未見明顯的毒性癥狀，體重未見明顯影響，各主要生命器官剖檢均未見異常。這為檳榔油的進(jìn)一步研究利用提供了安全基礎(chǔ)與保障。

2.2 表面活性劑與助表面活性劑的選定

油通過表面活性劑的雙親基團(tuán)能與水形成乳液，表面活性劑分為離子型表面活性劑與非離子型表面活性劑，考慮長期服用安全性，SMEDDS選取非離子型表面活性劑。表面活性劑的乳化能力多用HLB值來表示，形成水包油型乳液表面活性劑的HLB值一般大于12[16]。試驗(yàn)中檳榔油與Tween 80、EL-35、Labrasol都可以不同程度地混合均勻，但與Tween 20互溶性較差，具體結(jié)果見表3。

表3 不同組分微乳液的表征

注：A：考察稀釋前3種材料的相容性；B：稀釋后是否需要物理攪拌以及攪拌時(shí)間；C：考察稀釋后溶液的透明度以及表面是否出現(xiàn)絮狀漂浮或油滴；D：在3 000 r/min條件下離心15 min。

正常乳液不穩(wěn)定，需要加入助表面活性劑，形成動力學(xué)和熱力學(xué)穩(wěn)定，油滴粒徑小于100 nm的微乳液體系，一般認(rèn)為助表面活性劑降低了乳液的界面張力，增加界面膜的柔性和流動性，減少微乳液形成時(shí)所需要的彎曲能，使微乳液液滴容易形成[17]。選取的幾種不同助表面活性劑對Tween 80的濁點(diǎn)都有提高(見表4)，其中丙二醇效果最好，但丙二醇為短鏈醇，揮發(fā)性較大，會影響處方組分的變化從而降低微乳體系的穩(wěn)定性；PEG400吸水性強(qiáng)，自微乳一般選取軟膠囊為外包裝材料，會導(dǎo)致膠囊殼變硬，因此選取Transcutol為助表面活性劑。

表4 不同助表面活性劑對Tween 80濁點(diǎn)的影響

2.3 三相圖的繪制

不同脂肪酸的自乳化特性不同，Shahba[18]等對不同自微乳配方三相圖相平衡研究表明，混合單雙甘油酯為油相的自微乳的液晶相區(qū)域小，自微乳粒徑??；中鏈甘油酯的乳化效果最好。檳榔油主要由各種中長鏈混合不飽和及飽和脂肪酸，多種功能性活性物質(zhì)組成。自微乳的制備一般是將難溶于水，不穩(wěn)定的藥物溶解在特定的油相中[19]，對川芎油進(jìn)行自微乳膠囊研究，川芎自微乳膠囊在6個(gè)月內(nèi)品質(zhì)穩(wěn)定，吸收利用率是普通川芎油的2.53倍[20]。直接將提取物作為油相也能取得較好乳化效果[21-22]。

以檳榔油為油相，Transcutol為助表面活性劑，對Labrasol ，Tween 80 ，EL-35分別作三相圖，繪制出檳榔油微乳化的乳化區(qū)域。由圖1可知，在以Transcutol為助表面活性劑，檳榔油與三種表面活性劑都能形成微乳液，形成微乳時(shí)間<1 min。其中Labrasol成乳載油量在10%以內(nèi)，效果較差，Tween 80成乳載油量也在10%以內(nèi)，但表面活性劑的量必須在50%以上，EL-35的乳化面積最大，成乳載油量能達(dá)到30%以上，成乳時(shí)對表面活性劑的需求量也很低。因此選取EL-35為檳榔油自微乳的表面活性劑，Transcutol為助表面活性劑。

圖1 檳榔油微乳化三元相圖

2.4 星點(diǎn)-效應(yīng)面法優(yōu)化自微乳處方

在三相圖基礎(chǔ)上，采用星點(diǎn)-效應(yīng)面法(Central-Composite Design，CCD)，選取對檳榔油自微乳影響較顯著的2個(gè)因素油相比例(X1)和Km值(X2)為響應(yīng)變量，以-1，0，+1分別代表因素水平，取值范圍由三相圖結(jié)果確定：以為乳液粒徑(Y1)，zeta電位(Y2)為響應(yīng)值對微乳液的乳化效果進(jìn)行評價(jià)，以此建立數(shù)學(xué)模型，優(yōu)化檳榔油自微乳配方。試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平見表5，試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表6。

表5 星點(diǎn)設(shè)計(jì)因素分析水平及代碼

表6 星點(diǎn)設(shè)計(jì)方案及其試驗(yàn)結(jié)果

用Design Expert 8.0.5對數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析,得到擬合方程：

粒徑：Y1=73.90+22.74X1-20.57X2-10.10X1X2-2.22X12-6.50X22(R2=0.855 1，P=0.007 5)

zeta電位：Y2=-34.50+6.51X1-1.57X2-4.62X1X2+8.74X12+10.35X22(R2=0.820 6，P=0.015 1)。

結(jié)果表明：粒徑和zeta電位均符合二次多元線性方程，相關(guān)系數(shù)較高，擬合度較好，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。其中油相比例X1對粒徑影響最大，其次是Km值X2，交叉作用也有一定的影響；對zeta電位影響較大的依次是Km值二次項(xiàng)X22，油相比例二次項(xiàng)X12和油相比例X1，模型響應(yīng)值的變化主要來自所選因變量，即油相比例和Km值，因此，回歸方程可以較好地描述隨機(jī)因子與響應(yīng)值之間的關(guān)系。

根據(jù)回歸方程，做出響應(yīng)曲面圖及其等高線圖(圖2)，可以直觀反映各因素之間以及各因素和響應(yīng)值之間的交互作用。以平均粒徑(Y1)為響應(yīng)值的圖2中，固定油相比例，粒徑隨著Km值的增大而減小，固定Km值時(shí)粒徑隨著油相比例的增大而增大，與等高線的圓心位置也偏外結(jié)果一致，同時(shí)在2個(gè)因素中一個(gè)因素X低編碼值和高編碼值時(shí)，響應(yīng)值Y隨著另一因素的變化趨勢相差較大，由此可以得出2個(gè)因素油相比例(X1)和Km值(X2)之間的交互作用也較大。以zeta電位(Y2)為響應(yīng)值的圖中，固定其中一個(gè)因素，響應(yīng)值都有隨另一個(gè)因素先減小后增大的趨勢，等高線在圖內(nèi)也呈比較圓的形狀，2個(gè)因子的交互作用也較小，響應(yīng)值zeta電位(Y2)在2個(gè)因子所選的-1～1范圍內(nèi)存在最小值。

圖2 響應(yīng)面圖和等高線圖

運(yùn)用Design Expert 8.0.5對數(shù)據(jù)預(yù)測優(yōu)化，以粒徑<60 nm，zeta電位<32 mV為限制條件，繪制等高線疊加圖，見圖3，得到檳榔油自微乳的預(yù)測最佳值為：油相比例19.56%，Km值2.078 1，微乳液粒徑理論值為53.49 nm，zeta電位理論值為-33.96 mV。

按優(yōu)化處方比例制備自乳化系統(tǒng)，進(jìn)行粒徑，zeta電位考察，對預(yù)測結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證，3次平行試驗(yàn)得到的實(shí)際平均粒徑為54.34 nm，zeta電位為-33.82 mV，與理論預(yù)測值相差不大。

圖3 優(yōu)化處方的效應(yīng)面等高線疊加圖

3 結(jié)論

檳榔油功能活性成分多，進(jìn)行檳榔油對大鼠的急性毒理試驗(yàn)，動物均未見明顯的毒性癥狀，體重未見明顯影響，各主要生命器官剖檢均未見異常。這為檳榔油的進(jìn)一步研究利用提供了安全基礎(chǔ)與保障。不同脂肪酸的自乳化特性不同，通過三相圖相平衡研究，選用安全性高，乳化效果好的EL-35為表面活性劑，Transcutol為助表面活性劑。配方優(yōu)化后為：檳榔油為自微乳油相(19.56%)、EL-35為表面活性劑(54.31%)、Transcutol為助表面活性劑(26.13%)，得到的微乳液平均粒徑為54.34 nm，zeta電位為-33.82 mV，自微乳在體內(nèi)經(jīng)過微乳化使油滴在人體內(nèi)自發(fā)形成納米級別的微粒，能極大提高人體對其吸收率，增加生物利用度[23]。

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Acute Toxicity Test and Study of Arecanut Oil SMEDDS

Jiang Xinxin1Zhang Haide1Wang Weitao1Liao Yun2
(College of Food Science, Hainan University1, Haikou 570228)(College of Biological Science and Engineering, Hebei University of Economics and Business2, Shijiazhuang 050061)

The aim of this research is to investigate the toxicological safety and micro-emulsifying properties of aercanut oil, and to develop the formulations of aercanut oil self-emulsifying system which had a high bioavailability. The acute oral toxicity test in SD rats was adopted to study the safety of areca nut oil; the optimum formulations of aercanut oil SMEDDS were screened by solubility test, cloud point, ternary phase diagram and central composite design-response surface methodology with excipients miscibility, the appearance after aqueous dilution, particle size and zeta electric potential as parameters. As a result, the animals in the acute oral toxicity test showed no obvious toxicity symptoms, body weight had no obvious effect, and major life organs were normal. The optimum self-microemulsifying delivery system was composed of aercanut oil (19.56%), EL-35(54.31%), and Transcutol (26.13%). The mean particle size after the emulsification was 54.34 nm and zeta electric potential was -33.82 mV. Aercanut oil has a large safe range with non-toxic side effects; meanwhile, the prepared of SMEDDS has a good stability.

arecanut oil, acute toxicity test, self-emulsifying, central composite design

TS222

A

1003-0174(2014)06-0057-06

國家科技支撐計(jì)劃(2007BAD76B03)，中西部高校提升綜合實(shí)力計(jì)劃學(xué)科建設(shè)(2014-hdsp-03)

2013-07-03

蔣欣欣，男，1988年出生，碩士，食品工程

張海德，男，1971年出生，教授，農(nóng)產(chǎn)品加工