李 恒， 趙 欣， 楊 濤， 龔勁松， 朱小燕，熊 雷， 陸震鳴， 許正宏， 史勁松

（江南大學 藥學院，江蘇 無錫 214122）

煙酸是一種重要的醫(yī)藥中間體，廣泛應用于醫(yī)藥、材料、日化、食品等行業(yè)[1]。煙酸的生產工藝主要采用氨氧化法、硝酸氧化法等化學合成法[2]。傳統(tǒng)化學法生產煙酸存在反應條件苛刻、環(huán)境污染大、副產物多等缺點。隨著綠色化學的發(fā)展，采用生物催化法制備煙酸受到越來越廣泛的重視。

腈水解酶在羧酸的生物法合成方面一直是研究的熱點[3]。目前，一系列具有腈水解酶活性的微生物被發(fā)掘和報道，如 Pseudomonas putida[4]，Bacillus subtilis[5]，Aspergillus niger[6]，Gibberella intermedia[7]等。利用酶法轉化腈類化合物主要有純酶及全細胞催化兩種形式。與純酶催化體系相比，全細胞催化具有穩(wěn)定性高、轉化成本低廉等優(yōu)勢[8]。而細胞固定化更進一步提高了生物催化劑的價值和效率。固定化細胞有利于產物的批量分離與提取，同時能夠最大程度上保留酶的活性，增加細胞對底物的耐受性[9]，從而達到重復利用的目的[10]。固定化方法主要包括包埋法、交聯(lián)法、吸附法和共價結合法，其中，包埋法具有溫和的固定化條件以及良好的生物相容性。海藻酸鈉、瓊脂、卡拉膠、聚丙烯酰胺等均是常用的固定化材料[11]。由海藻酸鈉與氯化鈣交聯(lián)生成的海藻酸鈣凝膠成型快，酶活損失少，制備簡單，是包埋法制備固定化細胞的首選材料。

作者所在研究室前期篩選獲得了一株含有較高腈水解酶活性的P.putida CGMCC3830[12]，該菌在3-氰基吡啶、4-氰基吡啶生物催化合成煙酸和異煙酸的反應中表現(xiàn)出很高的轉化效率。作者利用海藻酸鈉固定Pseudomonas putida CGMCC3830，通過固定化及轉化條件的優(yōu)化，確定固定化P.putida CGMCC3830轉化3-氰基吡啶合成煙酸的方法。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 菌種 P.putida，作者所在實驗室篩選獲得，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號CGMCC 3830。

1.1.2 主要試劑和設備 3-氰基吡啶、煙酸：分析純，Sigma公司；海藻酸鈉、殼聚糖、氯化鈣、甘油、尿素、亞硝基氰化鈉等主要試劑：均為國產分析純試劑。THZC型恒溫振蕩器：太倉市實驗設備廠；電子天平：上海鵬順科學儀器有限公司；Multitron培養(yǎng)振蕩器：瑞士INFORS HT；日立微量高速離心機CF15RXII：日本日立公司。

1.1.3 培養(yǎng)基 種子培養(yǎng)基組分（g/dL）：甘油1，胰蛋白胨1，酵母粉0.5，氯化鈉0.1，磷酸二氫鉀0.1，磷酸氫二鉀0.1。

發(fā)酵培養(yǎng)基在種子培養(yǎng)基的基礎上增加尿素0.1 g/dL，調節(jié)pH 6.0。上述培養(yǎng)基均在121℃滅菌20 min。

1.2 方法

1.2.1 菌體培養(yǎng)與菌懸液制備 接種：挑取單菌落接種于種子培養(yǎng)基中，在30℃、200 r/min培養(yǎng)24 h。擴大培養(yǎng)：向50 mL搖瓶中加入500 μL種子發(fā)酵液，在30℃、200 r/min條件下培養(yǎng) 48 h。在7 800 r/min、10℃下離心10 min，棄上清液，用生理鹽水洗滌菌體，在相同條件下重復離心分離、洗滌操作，制成菌懸液，冰箱保存，備用。

1.2.2 海藻酸鈉固定化細胞的制備 稱取一定量的海藻酸鈉，在50℃水浴中攪拌溶解，將海藻酸鈉溶液與P.putida CGMCC3830菌懸液混合均勻后，用蠕動泵緩慢的將上述混合液滴入氯化鈣溶液中成球固化。經(jīng)PBS緩沖液（pH 7.0）洗滌3次置于4℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 酶活力的測定及定義 酶活力的測定方法：取適量固定化細胞置于10 mL用磷酸緩沖液配置的100 mmol/L 3-氰基吡啶溶液中，在30℃搖床反應20 min，用2 mol/L的鹽酸終止反應。過濾收集轉化液，依次加入苯酚鈉溶液1 mL，次氯酸鈉1.5 mL，亞硝基鐵氰化鈉1.5 mL[13]，測定630 nm下OD值，計算產氨量。

一個單位酶活（U）的定義：在一定條件下，每分鐘催化氰基水解產生1 μmol羧酸所需的酶量。

1.2.4 溫度對固定化細胞的轉化性能的影響 取等量的固定化細胞，分別在 25、30、35、40、45、50、60℃條件下，于10 mL體系中轉化50 mmol/L 3-氰基吡啶，分別取樣測定酶活。以最適溫度下的酶活為100%，計算其他溫度下樣品的相對活力。

1.2.5 pH對固定化細胞的轉化性能的影響 取等量的固定化細胞，在最適溫度反應條件下，于10 mL體系中轉化50 mmol/L 3-氰基吡啶，調節(jié)pH分別為 3.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、11.0，轉化3-氰基吡啶，分別取樣測定酶活。以最適pH下的酶活為100%，計算其他pH值下樣品的相對活力。

1.2.6 底物濃度對固定化細胞的轉化性能的影響取等量的固定化細胞，在最適反應條件下，分別考察底物濃度為 50、75、100、200 mmol/L 時對固定化細胞轉化性能的影響，定時取樣測定酶活，計算底物轉化率。

1.2.7 固定化細胞與游離細胞的批次實驗 為了評價和比較固定化細胞的重復使用性，將固定化細胞與游離細胞分別在濃度為100 mmol/L的3-氰基吡啶的反應體系中轉化，轉化60 min后將細胞濾出，用生理鹽水清洗后進行下一批次的反應。

2 結果與討論

2.1 海藻酸鈉固定化條件的優(yōu)化

2.1.1 海藻酸鈉質量濃度的確定 考察包埋過程中海藻酸鈉質量濃度對酶活力的影響。如圖1所示，當海藻酸鈉質量濃度低于2 g/dL時，隨著其質量濃度的升高，固定化細胞的相對酶活逐漸增大；當海藻酸鈉質量濃度為2 g/dL時，酶活最高。進一步提高海藻酸鈉質量濃度，酶活反而降低，這與文獻[5]報道類似。這是由于海藻酸鈉的質量濃度過高導致凝膠網(wǎng)絡過于致密，從而使得底物分子難以進入固定化小球內部進行轉化，因此酶活降低。同時，海藻酸鈉質量濃度過高也會造成小球成型的欠缺。因此，海藻酸鈉的最適質量濃度為2 g/dL。

圖1 海藻酸鈉濃度對固定化細胞相對酶活的影響Fig.1 Effect of sodium alginate concentration on the relative activity of the immobilized cell

2.1.2 氯化鈣質量濃度對細胞酶活的影響 海藻酸鈉包埋法的主要原理是基于Ca2+的架橋作用，使海藻酸鈉形成空間網(wǎng)絡狀結構從而固定細胞，因此作為固定劑的氯化鈣的質量濃度對固定化細胞的制備也有極大的影響。由圖2可以看出，氯化鈣質量濃度對固定化P.putida CGMCC3830酶活的影響與海藻酸鈉的影響趨勢相似。當氯化鈣質量濃度為0.4 g/dL時，酶活最高；當氯化鈣質量濃度高于0.4 g/dL時，酶活降低。這同樣是由于高質量濃度的氯化鈣造成底物或產物的擴散限制[14]。

圖2 氯化鈣濃度對固定化細胞相對酶活的影響Fig.2 Effect of CaCl2concentration on the relative activity of the immobilized cell

2.1.3 固化時間對細胞酶活的影響 固化時間對固定化細胞相對酶活的影響見圖3。固化時間太短易導致凝膠交聯(lián)不夠充分，形成的凝膠網(wǎng)絡結構松散，機械強度差。當固化時間為6 h時，凝膠致密程度適中，固定化細胞的酶活最高。進一步的固化會導致凝膠過于致密，酶活反而降低。因此選定最佳固化時間為6 h。

圖3 固化時間對固定化細胞相對酶活的影響Fig.3 Effect of immobilization time on the relative activity of the immobilized cell

2.2 溫度對固定化細胞轉化性能的影響

溫度對固定化細胞酶活力的影響見圖4。當溫度低于35℃時，固定化細胞酶活隨著溫度的升高而增加；高于35℃時酶活降低速率快，這是由于高溫造成腈水解酶的失活。因此選擇最適溫度為35℃。

圖4 溫度對固定化細胞相對酶活的影響Fig.4 Effect of temperature on the relative activity of the immobilized cell

2.3 pH對固定化細胞轉化性能的影響

反應體系中pH值直接影響酶的催化活性。如圖5所示，當pH為7.0時，固定化細胞的酶活最高。pH過高或者過低，均易造成酶活力的降低。但固定化細胞對堿環(huán)境的耐受性較好，pH為11.0時，其相對酶活仍保留88.7%。

圖5 pH對固定化細胞相對酶活的影響Fig.5 Effect of pH on the relative activity of the immobilized cell

2.4 固定化細胞底物濃度選擇

底物濃度對固定化細胞相對酶活的影響見圖6。底物濃度由50 mmol/L增加到100 mmol/L過程中，隨著底物濃度的增加，固定化細胞轉化3-氰基吡啶的速率逐漸減慢，底物完全轉化所需時間逐漸延長。當?shù)孜餄舛冗_到200 mmol/L時，底物轉化率明顯下降，180 min的轉化率僅為17.4%。這是由于高底物濃度對細胞有有一定的毒害作用[15]，從而造成腈水解酶的失活。因此，選擇100 mmol/L為最適底物濃度。

圖6 不同濃度底物對固定化細胞酶活力影響Fig.6 Effect of substrate concentration on the relative activity of the immobilized cell

2.5 固定化細胞的批次轉化

固定化細胞與游離細胞的批次轉化效果見圖7?？梢钥闯觯潭ɑ毎B續(xù)使用10次后，酶活保留59.1%，產物煙酸的得率為91.8 g/g干細胞重。而相同條件下，游離細胞使用3次后，酶活下降至45.6%，煙酸得率僅為24.6 g/g干細胞重。由此可見，P.putida CGMCC3830經(jīng)過海藻酸鈉包埋后，批次使用次數(shù)及產物得率均明顯提高。

圖7 固定化細胞批次轉化性能Fig.7 Reuse of the immobilized cell

3 結語

作者采用包埋法對P.putida CGMCC3830細胞進行固定化，同時考察其轉化3-氰基吡啶為煙酸的性能。以海藻酸鈉為包埋材料，通過海藻酸鈉質量濃度、氯化鈣質量濃度以及固化時間等的優(yōu)化，得到固定化最適條件為：海藻酸鈉質量濃度2 g/dL，氯化鈣質量濃度0.4 g/dL，固化時間6 h。進一步優(yōu)化固定化細胞的轉化條件，得到最適轉化條件為：溫度35℃，pH 7.0，底物濃度100 mmol/L。批次轉化實驗結果顯示，當?shù)孜餄舛葹?00 mmol/L時，固定化細胞可重復使用10次，酶活保留59.1%，煙酸得率為91.8 g/g細胞干重，比游離細胞提高了2.7倍。由此可見，P.putida CGMCC3830經(jīng)固定化后，單位細胞的轉化能力以及使用穩(wěn)定性均顯著提高。

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