宋佳秀,任南琪,錢東旭,陸一凡,徐 怡 (.上海師范大學生命與環(huán)境科學學院,環(huán)境科學與工程系,上海0034；.哈爾濱工業(yè)大學市政與環(huán)境工程學院,黑龍江 哈爾濱 50090)

醌呼吸影響厭氧消化產(chǎn)CO2/CH4及轉(zhuǎn)化有毒物質(zhì)的研究

宋佳秀1*,任南琪2,錢東旭1,陸一凡1,徐 怡1(1.上海師范大學生命與環(huán)境科學學院,環(huán)境科學與工程系,上海200234；2.哈爾濱工業(yè)大學市政與環(huán)境工程學院,黑龍江 哈爾濱 150090)

利用蒽醌-2,6,-雙磺酸(AQDS)為模式物在厭氧消化過程中富集醌呼吸微生物,考察了富集產(chǎn)物厭氧消化同步醌呼吸的產(chǎn)氣特性和對有毒物質(zhì)的轉(zhuǎn)化.結果發(fā)現(xiàn),富集產(chǎn)物具有較強的腐殖質(zhì)還原能力,CO2:CH4為 1.7,高于未富集污泥;不同來源的腐殖質(zhì)因其具有不同的分子結構和醌功能基團數(shù)量,對污泥的醌呼吸的促進作用有所差別,而可從還原性腐殖質(zhì)接受電子的 Fe(III)可顯著加強醌呼吸速率;醌呼吸微生物在pH4.5～6條件下獲得較高活性,說明此時醌呼吸對厭氧消化貢獻較大;富集產(chǎn)物以乙酸為電子供體時可快速轉(zhuǎn)化苯和三氯乙烯, 27h的轉(zhuǎn)化率分為 85.9%和 82.2%,并可以苯為電子供體以三氯乙烯為電子受體同時降解苯和還原三氯乙烯,30h內(nèi)的轉(zhuǎn)化率分別為 81.7%和68.8%.

腐殖質(zhì)還原；蒽醌-2,6-雙磺酸；醌呼吸

近年來,消除天然(土壤、水體等)和人工(污水廠、剩余污泥等)生態(tài)中環(huán)境有毒物質(zhì)的研究受到人們的重視.其中腐殖質(zhì)(HS)是一種具有羰基結構的高分子芳香族聚合物,普遍存在于環(huán)境中,在生物地球化學循環(huán)過程中擔任重要角色.Lovley等[1]在 1996年最早發(fā)現(xiàn)Geobactermetallireducens和Shewanella alga在厭氧條件下能夠以腐殖質(zhì)模式物蒽醌-2,6-雙磺酸(anthraquinone-2,6-disulfonate,AQDS)為唯一電子受體,參與細菌的呼吸代謝過程.隨后,陸續(xù)在陸地有機物含量豐富的沉積物、污染的土壤以及廢水處理廠的活性污泥中發(fā)現(xiàn)多種細菌可以進行這種呼吸作用.其原理為 HS在厭氧條件下作為電子受體接受來自菌體細胞膜電子傳遞鏈上的電子,HS接受電子被還原,而電子在細胞膜傳遞過程中,形成跨膜的質(zhì)子濃度電勢梯度,偶聯(lián)能量的形成來支持菌體的生長,因 HS中的醌類基團是主要的電子接受位點[2],因此這種呼吸作用稱為醌呼吸.在醌呼吸中,HS不僅可在厭氧環(huán)境中充當有機物礦化的電子受體,而且可在腐殖質(zhì)還原菌和可還原態(tài)物質(zhì)(硝酸鹽、重金屬、有機污染物、染料等)之間充當氧化還原介體(電子穿梭體),促進這些物質(zhì)的還原[3-9],在環(huán)境修復中起到重要作用.因此這一新型代謝途徑自發(fā)現(xiàn)以來,逐漸受到國內(nèi)外學者的矚目[10-13],是近期環(huán)境微生物領域研究的一個熱點.

（11）以多分類變量newsubgroup為反應變量，對各協(xié)變量建立多分類Logistic回歸模型，并計算該模型判對率。

其三，社會治理系統(tǒng)的協(xié)同共治。在社會科學中，協(xié)同是不同行動者之間，以一方為主的協(xié)調(diào)與合作，二者之間是和諧非均衡關系[6]。社會治理系統(tǒng)既是一個合作共治的系統(tǒng)，又是一個協(xié)同共治的系統(tǒng)。多元主體在社會治理中，既是一種合作關系，又是一種政府主導下的協(xié)同關系。這一關系可為創(chuàng)新社會治理的共建共治提供有力的理論支點，同時還可以為推進社會組織和公眾參與協(xié)同社會治理的實踐探索提供方法。

目前,醌呼吸微生物在環(huán)境中的作用研究基于自然生態(tài)環(huán)境,針對活性污泥的腐殖質(zhì)還原作用的研究不多.已發(fā)現(xiàn)的進行醌呼吸的微生物包括地桿菌(Geobacter spp.)、希瓦氏菌(Shewanella spp.)、脫亞硫酸菌(Desulfitobacterium spp.)、嗜熱菌(Thermophilic bacteria)等[17].Straub 等[14]的研究證實,活性污泥中普遍存在醌呼吸作用,Wu等[15]在污水廠污泥中分離到了多株腐殖質(zhì)還原菌.Cervantes等[16]以 AQDS作為最終電子受體,對混合微生物進行加富培養(yǎng),實現(xiàn)了醌呼吸微生物的富集,這些微生物在將 HS還原的同時偶聯(lián)有毒有機物的降解.因此研究活性污泥中的醌呼吸作用具有重要的現(xiàn)實意義,本研究通過富集厭氧活性污泥中的醌呼吸微生物,考察了消化過程的醌呼吸作用及其影響因素,并對 2種有毒物質(zhì)的醌呼吸轉(zhuǎn)化進行了初探和分析,為探討該類菌在厭氧消化過程中貢獻及對有毒物質(zhì)的降解提供理論基礎.

1 材料與方法

1.1 污泥馴化

取自污水廠污泥濃縮池的活性污泥經(jīng) 14d的密閉擱置后,移至 2個 500mL密閉的發(fā)酵瓶內(nèi),1#進行常規(guī)厭氧消化培養(yǎng),以有機污水(來自某污水廠,BOD5為 181～232mg/L)為碳源,定期更換培養(yǎng)液;2#除添加相同碳源外,另添加腐殖質(zhì)模式物AQDS(1mmol/L)以強化污泥的醌呼吸作用,置于30℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng),測量發(fā)酵瓶頂部空間的 CH4和 CO2含量,直至 CH4含量超過 40%,AQDS的還原速率達到12h還原70%以上則馴化結束.

1.2 實驗方法

實驗中考察了pH4.5～7.5范圍內(nèi)馴化污泥的產(chǎn)氣情況.結果如圖 3所示,隨 pH 值的升高,CO2:CH4逐漸降低,由1.8降低至1.3,可見在低pH值(pH4.5～5.5)時醌呼吸對消化過程的貢獻較大.這一結果與 Jason等[20]對土壤消化作用的研究相符.Sachs等[21]在對腐殖質(zhì)的氧化還原作用及對重金屬的還原反應研究發(fā)現(xiàn),pH值低至 3時,腐殖質(zhì)對 Fe(III)的異化還原能力最高.這些研究似乎表明腐殖質(zhì)呼吸作用傾向于在較低pH值下進行.理論上,隨著 pH值的增加,HA的還原電位逐漸減小,這是由腐殖質(zhì)中功能基團醌的氧化還原特性決定的[22].因此 pH值是影響腐殖質(zhì)呼吸作用的重要因素,而環(huán)境中醌呼吸速率受很多因素影響,包括腐殖質(zhì)類型以及氧化還原環(huán)境,不同來源的腐殖質(zhì)醌基團數(shù)量及化學結構不同,氧化還原平衡存在差異,厭氧消化中亦同時存在多種氧化還原平衡,并與 pH值交互作用,因此有必要開展更深入的研究.

考察未馴化污泥(1#)和馴化污泥(2#)的消化特性,見圖 1,其中 cAQDS代表還原的 AQDS.可見,經(jīng)馴化后的污泥(2#)具有較強的 AQDS還原能力,20h可將90%的AQDS還原,而未經(jīng)馴化的污泥(1#)經(jīng)48h后達到60%,之后的還原則十分有限.厭氧消化過程中,污泥中的一部分有機物可緩慢演化成為腐殖質(zhì),因此未經(jīng)馴化的污泥可能存在少量醌呼吸微生物并進行十分有限的腐殖質(zhì)還原,大部分有機質(zhì)被甲烷化,同時生成 CO2.醌呼吸微生物通常以有機物為電子供體,將電子傳遞給腐殖質(zhì),最終轉(zhuǎn)化為CO2,這與有機物的甲烷化同時發(fā)生,其結果表現(xiàn)為CO2產(chǎn)量的提高.通常,厭氧消化產(chǎn)生的 CO2與甲烷的比例接近 1,本實驗中,經(jīng)馴化的污泥獲得了較高的 CO2:CH4值,60d的 CO2:CH4值為 1.7左右,未經(jīng)馴化的污泥60d獲得的CO2:CH4值為1.3左右,這是由于醌呼吸微生物與產(chǎn)甲烷微生物爭奪電子供體并將其轉(zhuǎn)化為 CO2所致.對于未添加 AQDS的實驗組,經(jīng)馴化的污泥的 CO2:CH4值也高于未經(jīng)馴化的污泥,但差距不大,因為未添加AQDS的實驗組缺乏醌呼吸微生物的電子受體,因此醌呼吸的活性較低.

1.3 主要試劑

綜上所述，在大面積燒傷之后，Th17細胞和Treg細胞都受到了顯著抑制，動態(tài)平衡被破壞，機體防御感染的免疫功能明顯減弱；但是早期使用右美托咪定能減輕大面積燒傷患者燒傷后引起的細胞免疫抑制，保持機體的免疫能力。

2 結果與討論

2.1 醌呼吸微生物的富集及對厭氧消化的影響

采用 Cervantes等[19]描述的方法于 450nm波長處用采用UNICO 1200型分光光度計測定其還原態(tài) AH2QDS的吸光度.利用無菌針頭,氮氣保護下抽取血清瓶頂部空間氣體,采用 SRI 8610C型氣相色譜、氫火焰離子化(FID)檢測器以及SRI 310C、熱導檢測器TCD檢測CO2、CH4含量;抽取液相樣品經(jīng)過濾后采用 HP5890Ⅱ型色譜儀,電子捕獲檢測器(ECD)檢測三氯乙烯含量;采用Agilent 6890氣相色譜儀,氫火焰離子化(FID)檢測器檢測苯含量.厭氧手套箱型號為14500COY型.

圖1 未馴化污泥(1#)和馴化污泥(2#)的消化特性Fig.1 The digestion characteristics of sludge with acclimation (1#) and sludge without acclimation sludge (2#)

2.2 電子介導載體的影響

考察了電子介導載體的影響,包括不同來源的腐殖質(zhì)以及金屬離子,其中 S-HA、L-HA、P-HA分別提取自土壤、風化褐煤和沼澤,其碳系數(shù)分別為0.54、0.58、0.65.腐殖質(zhì)和金屬離子在這一生化反應中充當電子中間體,將電子傳遞給電子受體.如圖 2所示,不同類型電子載體 7d的CO2:CH4呈現(xiàn)一定的差異,這在一定程度上反映了醌呼吸作用的差異.醌呼吸通過腐殖質(zhì)內(nèi)的醌基團的電子傳遞作用得以進行,不同類型的腐殖質(zhì)接受電子能力存在差異是重要的原因之一,同時與腐殖質(zhì)的結構特性有關.在醌呼吸過程中,腐殖質(zhì)作為中間電子傳遞體,胞外接受醌呼吸微生物傳遞的電子,起到電子傳遞作用的是分子中的醌基團[10],醌基團接受 H 轉(zhuǎn)化為氫醌.而天然腐殖質(zhì)分子結構極為復雜,官能團的數(shù)量結構迥異,因此接受電子和轉(zhuǎn)移電子的能力因受到數(shù)量、結構和生化活性等因素的影響而產(chǎn)生差別.盡管很難定量描述這種影響,此結果仍然具有一定的意義,可作為研究和應用的參考.同時,在有其他電子介導載體(FeCl3和 Fe2(SO4)3)存在的情況下,CO2/CH4的比率較單獨添加AQDS(10mmol/L)分別增加了0.26和 0.34.Fe(III)對醌呼吸的促進作用在研究中多次得到證實[1,21],在 Fe(III)存在的情況下,被還原的腐殖質(zhì)將被重新氧化并可繼續(xù)接受電子,起到電子穿梭中間體的作用,在本實驗中,Fe(III)的存在顯著增強了醌呼吸速率.

圖2 不同電子介導載體對CO2/CH4生成比的影響Fig.2 The effect of electron donor on the CO2:CH4 ratio

2.3 pH值的影響

在厭氧手套箱內(nèi),利用去離子水將污泥稀釋,采用均質(zhì)器將污泥均質(zhì)化,測定污泥初始 pH值為 6.32.利用定量移液器將 10mL污泥混合物分裝于 30mL血清瓶內(nèi),利用灰色聚乙烯膠塞加鋁制金屬圈利用卷縮器壓緊密封.采用無菌針,氮氣保護下分別進行各種物質(zhì)的添加.實驗分為3組,分別為電子介導載體影響實驗、pH值影響實驗和2種有毒有機物(苯和三氯乙烯,二者分別在醌呼吸中充當電子供體和電子受體)的影響實驗.實驗方法如下,第1組:添加不同類型電子介導載體,包括 AQDS(蒽醌-2,6,-雙磺酸,1mmol/L、10mmol/L)、FeCl3(氯化鐵,10mmol/L)和 AQDS(10mmol/L)、Fe2(SO4)3(硫酸鐵,10mmol/L)和AQDS(10mmol/L)、Peat humic (泥炭腐殖質(zhì)，10g/L)、Soil humic(土壤腐殖質(zhì),10g/L)和Leonardite humic (風化褐煤腐殖質(zhì),10g/L),對照樣未添加以上物質(zhì).第 2組:利用 0.5mol/L Homopipes (pH4.5)、1mol/L MES(2-(N-嗎啡啉)乙磺酸,pH4.5,5.6,6,6.5)及1mol/L CHES (2-(環(huán)己基氨基)乙磺酸,pH9.5,12.5)緩沖液調(diào)節(jié)pH值,每個血清瓶內(nèi)的添加量為500μL,測得實際pH值分別為4.56,5.01,5.58,5.66,6.91,6.4,7.45,8.02.第3組:分別添加苯,AQDS+苯,三氯乙烯,三氯乙烯+AQDS,三氯乙烯+乙酸+AQDS,苯+三氯乙烯+AQDS,以未添加 AQDS的樣品為對照,其中AQDS濃度為 1mmol/L,苯和三氯乙烯濃度均200μmol/L,乙酸濃度為1mmol/L.每個條件均為3組平行樣,結果取平均值.所有血清瓶按上述方法添加后,置于恒溫箱 30℃培養(yǎng).氮氣保護下,抽取頂部空間氣體利用氣相色譜檢測,利用無菌注射器抽取液體樣品,利用針頭過濾器進行過濾,注入膠塞密封的無氧小瓶內(nèi),再利用色譜針抽取檢測液相中的苯和三氯乙烯,加標回收率分別為97.8%和96.5%.

圖3 pH值對CO2和CH4產(chǎn)量的影響Fig.3 The effect of pH on the yield of CO2 and CH4

2.4 有毒有機物的影響

厭氧環(huán)境中,在多種微生物的作用下,苯和三氯乙烯降解化學反應式如下:

AQDS(anthraquinone-2, 6-disulfonate) 為分析純,購于Sigma公司.P-HA、L-HA、S-HA 來自 于 IHSS(International Humic Substance Society).FeCl3、Fe2(SO4)3為分析純,購于 Promega Corporation,其余藥品均為分析純,分別購于Fisher Scientific和Promega Corporation.

考察了馴化污泥對苯和三氯乙烯(TCE)的降解特性(27h),結果如圖 4.可見,無 AQDS時,苯和TCE的降解十分有限.在 AQDS存在的情況下,苯的降解得到大幅度強化,轉(zhuǎn)化率為 85.9%,而TCE的降解十分有限.TCE在厭氧條件下應是通過還原脫氯而得到降解,所以當電子供體缺乏時,TCE無法降解.而當乙酸存在時,TCE的轉(zhuǎn)化率為 82.2%,乙酸此時作為電子供體,通過醌呼吸微生物將電子傳遞給 AQDS,繼而將電子傳遞給TCE實現(xiàn)還原脫氯進而轉(zhuǎn)化,或經(jīng)由其他脫氯細菌進行還原脫氯,本系統(tǒng)中起主導作用的應是醌呼吸微生物.當系統(tǒng)中僅存在苯和TCE時,27h轉(zhuǎn)化率分別達到 81.7%和 68.8%,這說明醌呼吸微生物可以苯為電子供體以TCE為電子受體同時實現(xiàn)這2種有機物的降解.在土壤培養(yǎng)物中,苯的厭氧降解偶聯(lián)AQDS的還原已經(jīng)得到證實[16],而同時降解苯和三氯乙烯的實驗研究不多,因此這一結果對于污泥或污水的脫毒具有重要意義.

圖4 苯和三氯乙烯的降解Fig.4 The degradation of benzene and trichlorethylene

圖5 厭氧消化同步醌呼吸電子流動分析Fig.5 Electron flow analysis in anaerobic digestion synchronization with quinone respiration Hydrolysis fermentation bacteria:水解發(fā)酵菌;Hydrogen production bacteria:產(chǎn)氫菌;Methanobacteriales:產(chǎn)甲烷菌;Geobacter:地桿菌;Dehalococcoides:脫氯球菌;TCE:三氯乙烯;cis-DCE:順式二氯乙烯; C2H2:乙烯

式(2)是在一些脫氯菌(如Dehalococcoides)的作用下,TCE的還原脫氯,這一過程在本系統(tǒng)中應較難發(fā)生,因為實驗污泥并未富集此類微生物.本研究中起主導作用的是醌呼吸微生物(如Geobacter),并存在 AQDS,因此三氯乙烯的降解反應應如式(3)所示.圖5為厭氧消化同步醌呼吸過程的電子流動和微生物群分析,其中虛線代表醌呼吸的電子傳遞方向,醌呼吸微生物與產(chǎn)甲烷菌競爭電子供體,包括有毒有機物,將其轉(zhuǎn)化為CO2,并藉電子的傳遞還原轉(zhuǎn)化環(huán)境有毒物質(zhì).

當有AQDS和電子供體的情況下,三氯乙烯的降解反應式如下:

我院2016年12月至2017年12月42例急性腎炎急性期患兒均符合小兒急性腎炎急性期臨床診斷標準,患者均出現(xiàn)肢體非凹陷性水腫,尿量減少,同時伴有腹水、胸腔積液等臨床癥狀。排除標準:(1)排除合并心、肝、腎等重要臟器疾病患兒。(2)排除合并認知障礙患兒。(3)排除合并甲狀腺疾病、糖尿病等全身系統(tǒng)疾病患兒。本次研究經(jīng)醫(yī)院倫理會以及患兒家屬同意,所有患兒家屬均表示自愿參與本次實驗。

3 結論

3.1 馴化的剩余污泥富含醌呼吸微生物,具有還原腐殖質(zhì)的能力,醌呼吸微生物與產(chǎn)甲烷微生物在厭氧消化過程中共同爭奪氫供體,其結果表現(xiàn)為CO2:CH4值升高.

3.2 不同類型的腐殖質(zhì)由于其分子結構及醌基團數(shù)量的差異,具有不同的還原能力,而 Fe(III)可以顯著增強醌呼吸速率.

我國新修編的面板堆石壩設計規(guī)范(SL 228—2013)規(guī)定高壩、重要工程、地震設計烈度為8、9度的面板壩工程，應設置放空設施。從面板壩運行中的事故處理和經(jīng)驗總結看，高壩設置放空設施，可適當控制水庫蓄水和有條件降低庫水位，主要目的是用于大壩超標滲漏檢查與修補，在非常情況（如地震等災害）減少次生災害影響。如2009年紫坪鋪面板壩災后恢復重建時，降低庫水位以修復擠壓破壞面板；2000年株樹橋面板堆石壩放空檢修時，利用發(fā)電引水洞將庫水位降低，加高原上游圍堰，并由發(fā)電引水洞導流，獲得了在壩體較低部位進行修補的機會和時間。

3.3 在厭氧消化過程中,醌呼吸作用在 pH 值4.5～6范圍內(nèi)表現(xiàn)出優(yōu)勢,在消化過程中貢獻較大.

3.4 馴化污泥可快速轉(zhuǎn)化苯和三氯乙烯(乙酸為電子供體),27h的轉(zhuǎn)化率分為85.9%和82.2%.醌呼吸微生物可以苯為電子供體以三氯乙烯為電子受體同時實現(xiàn)這兩種有機物的轉(zhuǎn)化,無其他電子供體時,27h的轉(zhuǎn)化分別達到81.7%和68.8%.

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The effect of quinone respiration on CO2/CH4production and transformation of toxic substances in anaerobic digestion.

SONG Jia-xiu1*, REN Nan-qi2, QAN Dong-xu1, LU Yi-fan1, XU Yi1
(1.College of Life and Environment Sciences, Shanghai Normal University, Shanghai 200234, China；2.School of Municipal and Environmental Engineering,Harbin Institute of Technology, Harbin 150090, China). China Environmental Science, 2014(5)：1236～1241

In this study, anthraquinone -2 ,6 , - disulfonic acid (AQDS) was employed as a model substance to enrich the quinone respiration bacteria in the process of anaerobic digestion. The characteristics of gas production were investigated as well as the toxic substance conversion in sludge by enriched quinone respiration bacteria . A high humus reducing capacity for enriched anaerobic sludge was verified with a high ratio of CO2: CH4= 1.7. The quinone respiration rate was found to vary while adding different sources of humus which can be attributed to different molecular structures and numbers for quinone functional groups. Fe (III), which is able to accept electron from a reductive humus, can significantly enhance quinone respiration rate. Quinone respiration in pH (4.5 ～ 6) showed the results of higher activity which indicated that at this pH, quinone respiration is likely to contribute more to anaerobic digestion. Enriched sludge can rapidly convert benzene and richlorethylene into CO2with acetate as an electron donor. For example, the conversion rates were up to 85.9% and 82.2% in 27h which can also oxidize benzene as an electron donor and deoxidize trichlorethylene as electron acceptor simultaneously, whose conversion rates were about 81.7% and 68.8% within 30h.

humus reduction；anthraquinone 2,6 - disulfonic acid；quinone respiration

X703.1

A

1000-6923(2014)05-1236-06

2013-10-08

國家自然科學基金青年基金項目(51208302);教育部博士點新教師基金(20123127120008);上海市教育委員會科研創(chuàng)新項目(12YZ083)

* 責任作者, 講師, songjiaxiu @shun. edu. cn

宋佳秀(1979-),女,黑龍江哈爾濱人,講師,博士,主要從事污水厭氧生物處理技術.發(fā)表論文20余篇.