張晉蔚，錢 江，何玉巧，楊麗華，林楚慧，鄭文瑋，王 響，胡滿江，陳驍熠

(廣州醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，廣東廣州510182)

慢性便秘是臨床常見的復(fù)雜癥狀，長期便秘造成有害物質(zhì)在腸道堆積，產(chǎn)生過量的自由基、炎癥介質(zhì)、細(xì)胞因子［1］使腸黏膜受損甚至誘發(fā)心腦血管疾病、結(jié)直腸癌等嚴(yán)重的并發(fā)癥。流行病學(xué)調(diào)查表明，受慢性便秘影響的人群已經(jīng)高達(dá)20%［2］，尤其多見于中老年人和體弱多病者［3］。天然產(chǎn)物相對于藥物在治療慢性便秘中具有毒副作用小、安全性高的優(yōu)點(diǎn)，然而傳統(tǒng)用于通便的大黃和番瀉葉如果長期使用容易引起結(jié)腸黑變病和增加患結(jié)腸癌的風(fēng)險(xiǎn)［4］。因此，探求一種長期有效且無毒副作用的天然產(chǎn)物具有重要意義。

腸道粘膜是抵御有害物質(zhì)氧化損傷的第一道屏障［5］，因此增強(qiáng)腸道粘膜的抗氧化能力是治療慢性便秘的重要手段。研究發(fā)現(xiàn)槲皮素等黃酮類化合物能夠通過抗氧化作用改善小鼠腸粘膜的氧化損傷［6］。松針食用歷史悠久［7-8］，安全性高［9］，其中的黃酮類化合物、胡蘿卜素、原花青素等天然抗氧化劑能夠清除自由基，增強(qiáng)抗氧化能力［10-11］，保護(hù)腸黏膜，維持腸道功能?，F(xiàn)代藥理實(shí)驗(yàn)表明松針的抗氧化性對心血管疾病［12］、糖尿?。?3］、腫瘤［14］等慢性疾病有積極的防治作用，但對其通便功能鮮有報(bào)道。本研究擬通過評價(jià)腸道抗氧化能力和通便作用等方面考察松針提取液對慢性便秘小鼠的影響，以期增加松針開發(fā)利用的附加值，并為治療慢性便秘提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

復(fù)方地芬諾酯片 長春長紅制藥有限公司;馬尾松松針 采自湖北;大黃 購于大參林藥房;復(fù)方地芬諾酯片 江蘇康普藥業(yè);丙二醛(MDA)試劑盒，超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒，谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)試劑盒、一氧化氮(NO)試劑盒 均購于南京建成生物工程研究所;其它試劑 均為分析純;昆明小鼠，雄性，SPF級，體重(18～22g) 由廣東省動物實(shí)驗(yàn)中心提供。

AK-98超細(xì)中藥粉碎機(jī) 溫嶺市奧力;DK-8D電熱恒溫水槽 上海一恒科技;X-22R低溫臺式高速離心機(jī) 美國Beckman Coulter公司;UV-3900紫外可見分光光度計(jì) 日本日立。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1．2．1 松針提取液的制備 稱取新鮮松針，洗凈，剪成0．5～1cm長，粉碎松針至可通過20目篩后，稱取松針粉 60、3、1．5g于燒瓶中，加入 60mL 蒸餾水，在90℃條件下熱浸提120min，冷卻后減壓抽濾，分別得到 1∶1、1∶20、1∶40(g∶mL)松針提取液。大黃磨粉后，以1∶20(g∶mL)料液比在松針提取液相同條件下浸提制得大黃提取液。

1．2．2 動物分組及處理 將76只健康昆明小鼠隨機(jī)分成空白組與便秘組，空白組給予生理鹽水，便秘組給予復(fù)方地芬諾酯(5mg/kg BW)造模。兩周后，測定兩組小鼠體重及結(jié)腸丙二醛(MDA)含量。再將便秘組按體重隨機(jī)分成便秘組、1∶1、1∶20 和 1∶40 松針組、1∶20大黃組，便秘組給予生理鹽水，其余各組給予相應(yīng)提取液進(jìn)行干預(yù)，共10d。各組小鼠在第7d進(jìn)行通便作用評價(jià)，第10d處死小鼠，取出樣本進(jìn)行測定。

1．2．3 小鼠通便作用的評價(jià) 第6d干預(yù)后，各組小鼠禁食不禁水16h，各小鼠給予等量墨汁灌胃，立即放至鋪有濾紙的鼠籠內(nèi)，每籠小鼠1只，并恢復(fù)飼料和飲水，同時(shí)開始準(zhǔn)確計(jì)時(shí)。觀察記錄每只小鼠首粒黑便排出用時(shí)，并連續(xù)觀察5h，記錄5h小鼠黑便的粒數(shù)，同時(shí)記錄黑便的性狀，并及時(shí)稱量排出黑便的濕重。

1．2．4 小鼠結(jié)腸丙二醛(MDA)、一氧化氮(NO)含量、超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)活性的測定 末次干預(yù)1h后，眼球取血，靜置2h 后，3500r/min，4℃離心 15min，制備血清，檢測血清中NO的含量。剖開處死后小鼠的腹腔，分離腸系膜，剪取距離回盲部1cm處大腸組織2cm，按照試劑盒提供方法測定其 MDA、NO的含量和SOD、GSH-Px的活性。

1．2．5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)通過 SPSS20．0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，各組計(jì)量資料的描述采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)，使用單因素方差分析(ANOVA)及Dunnett-t檢驗(yàn)進(jìn)行組間差異比較，p＜0．05表示差異有顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 慢性便秘對小鼠體重及結(jié)腸MDA含量的影響

由表1可知，與空白組比較，造模兩周后，便秘組體重明顯減輕(p＜0．05)，說明慢性便秘會造成小鼠體重減輕。而便秘組MDA含量與空白組比較明顯升高(p＜0．01)，表明慢性便秘能夠增加結(jié)腸組織氧化程度。

表1 慢性便秘對小鼠體重及結(jié)腸MDA含量的影響(±s，n=8)Table 1 The effect of chronic constipation on body weight and colonic MDA content(±s，n=8)

表1 慢性便秘對小鼠體重及結(jié)腸MDA含量的影響(±s，n=8)Table 1 The effect of chronic constipation on body weight and colonic MDA content(±s，n=8)

注:與空白組比較，*p ＜0．05，＊＊p ＜0．01。

組別 體重(g) 結(jié)腸MDA含量(nmol/mL)34．15 ± 1．55 0．76 ± 0．40便秘組 31．23 ± 1．44* 1．62 ± 0．44空白組＊＊

2.2 松針提取液對慢性便秘小鼠結(jié)腸MDA含量、SOD和GSH-Px活性的影響

如表2所示，與空白組比較，便秘組的MDA含量顯著增加，SOD與GSH-Px活性顯著降低(p＜0．01)。說明在停藥10d后，便秘小鼠腸道的氧化程度仍比正常小鼠高，而抗氧化酶活性降低。與便秘組比，各提取液均能顯著降低結(jié)腸組織的MDA含量(p＜0．01)，三組松針提取液均能顯著提高SOD活性(p＜0．05)，而大黃提取液能提高SOD活性，但差異不顯著。研究顯示只有1∶1松針提取液能顯著提高GSH-Px的活性(p＜0．01)，其余各組效果不顯著。結(jié)果說明松針提取液能夠提高結(jié)腸抗氧化能力，減少結(jié)腸的氧化損傷。

表2 松針提取液對慢性便秘小鼠結(jié)腸MDA含量、SOD和GSH-Px活性的影響(±s，n=10)Table 2 The effect of pine needle extract on antioxidant capacity of chronic constipated mice(±s，n=10)

表2 松針提取液對慢性便秘小鼠結(jié)腸MDA含量、SOD和GSH-Px活性的影響(±s，n=10)Table 2 The effect of pine needle extract on antioxidant capacity of chronic constipated mice(±s，n=10)

注:與空白組比較，*p＜0．05，＊＊p ＜ 0．01;與模型組比較，#p ＜0．05，##p ＜0．01，表 3，表 4 同。

組別 MDA含量(nmol/mL)SOD活性(U/mL)GSH-Px活性(U/mL)2．61 ± 1．11 22．22 ± 6．14 41．47 ± 18．40便秘組 5．58 ±2．25＊＊ 14．02 ±2．73＊＊ 35．93 ±14．02＊＊1∶20 大黃 1．94 ± 0．40## 16．73 ± 0．93 30．68 ± 15．19 1∶40 松針 2．55 ± 1．28## 22．46 ± 5．83## 48．40 ± 19．31 1∶20 松針 3．22 ± 1．10## 22．45 ± 7．26# 45．09 ± 15．37 1∶1 松針 2．84 ± 0．91## 24．95 ± 9．77## 55．28 ± 11．93空白組##

2.3 松針提取液對慢性便秘小鼠排便的影響

由表3可知，與空白組比較，便秘組小鼠首粒黑便排出用時(shí)明顯延長，5h內(nèi)黑便粒數(shù)和黑便重量明顯減少，結(jié)果均具有顯著性差異(p＜0．05)，且經(jīng)過7d停灌復(fù)方地芬諾酯，便秘小鼠的排便功能仍得不到改善，說明慢性便秘小鼠模型穩(wěn)定。與模型組比較，1∶40松針提取液對黑便重量增加不顯著(p＞0．05)但可以減短首粒黑便排出用時(shí)及增加粒數(shù)(p＜0．05)，其余各提取液均能明顯縮短便秘小鼠首粒黑便排出用時(shí)(p＜0．01)，增加5h內(nèi)黑便的粒數(shù)和重量(p＜0．05)。結(jié)果表明，經(jīng)過松針和大黃提取液干預(yù)后，小鼠便秘得到緩解。

表3 松針提取液對慢性便秘小鼠排便的影響(±s，n=10)Table 3 The effect of pine needle extract on laxative activity of chronic constipated mice(±s，n=10)

表3 松針提取液對慢性便秘小鼠排便的影響(±s，n=10)Table 3 The effect of pine needle extract on laxative activity of chronic constipated mice(±s，n=10)

組別 首粒黑便排出用時(shí)(min)黑便粒數(shù)(粒)黑便重量(mg)84．22 ± 22．83 13．75 ± 6．43 455．07 ± 28．19便秘組 121．80 ±35．75＊＊ 8．17 ±4．31* 365．04 ±124．75*1∶20 大黃 95．85 ± 16．13# 17．00 ± 4．29## 461．80 ± 63．00#1∶40 松針 85．52 ± 10．61## 13．17 ± 4．12# 435．08 ± 35．15 1∶20 松針 65．14 ±15．57## 14．33 ±3．98# 444．53 ±21．62#1∶1 松針 69．93 ± 28．75## 14．83 ± 4．07# 459．38 ± 46．51空白組#

2.4 松針提取液對慢性便秘小鼠血清及結(jié)腸NO含量的影響

表4結(jié)果顯示，便秘小鼠血清和結(jié)腸中NO的含量均比空白組顯著升高(p＜0．01);各劑量組與便秘組相比，均能顯著降低便秘小鼠中血清與結(jié)腸中NO的含量。說明松針與大黃皆能減少NO的產(chǎn)生和作用。

表4 松針提取液對慢性便秘小鼠血清及結(jié)腸NO含量的影響(±s，n=10)Table 3 The effect of pine needle extract on serum and colonic NO content of chronic constipated mice(±s，n=10)

表4 松針提取液對慢性便秘小鼠血清及結(jié)腸NO含量的影響(±s，n=10)Table 3 The effect of pine needle extract on serum and colonic NO content of chronic constipated mice(±s，n=10)

組別 血清NO含量(μmol/g)結(jié)腸NO含量(μmol/g)12．95 ± 5．60 4．70 ± 0．62便秘組 40．09 ±7．13＊＊ 20．19 ±13．51＊＊1∶20 大黃 21．02 ± 5．79## 14．63 ± 6．37#1∶40 松針 23．16 ± 6．79## 13．99 ± 5．32#1∶20 松針 30．87 ± 11．15## 10．63 ± 6．10##1∶1 松針 21．56 ± 11．54## 4．85 ± 4．32空白組##

3 討論

3.1 小鼠慢性便秘致氧化損傷模型的建立

為研究慢性便秘對腸道的氧化作用，本研究參考劉海峰［15］，包云光［16］，智會［17］等使用大鼠造模方法，成功得到穩(wěn)定的小鼠慢性便秘模型，并首次檢測到結(jié)腸的MDA含量升高(p＜0．01)(表1)，結(jié)果證明慢性便秘可以造成腸道的氧化損傷。這可能由于小鼠服用復(fù)方地芬諾酯后，抑制了腸道蠕動功能，使腸內(nèi)容物長時(shí)間停留在腸道內(nèi)。腸內(nèi)容物中的有害物質(zhì)如吲哚、亞硝胺、酚類等長時(shí)間對腸黏膜造成刺激，產(chǎn)生的炎癥介質(zhì)、自由基等［1］不斷攻擊腸道上皮黏膜、使腸黏膜受到氧化損傷，進(jìn)而影響腸道的消化及代謝功能，最后導(dǎo)致體重減輕(p＜0．05)(表 1)。

3.2 松針提取液對慢性便秘小鼠氧化損傷的干預(yù)作用

本實(shí)驗(yàn)對慢性便秘小鼠進(jìn)行干預(yù)后發(fā)現(xiàn)，不同濃度的松針提取液均能明顯增強(qiáng)結(jié)腸的抗氧化能力。松針提取液富含蘆丁、槲皮素、葉綠素等多種抗氧化物質(zhì)，能夠調(diào)劑體內(nèi)的氧化應(yīng)激反應(yīng)［18］，加快自由基的清除，減少脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA的產(chǎn)生。同時(shí)，松針提取液也可以通過明顯提高SOD的活性(p＜0．05)(表2)，增強(qiáng)便秘小鼠腸道內(nèi)源性抗氧化能力，使腸道免受自由基的損傷［10］。

本實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)，不同濃度的松針提取液均能夠降低體內(nèi)NO的水平減少腸道的氧化損傷。NO亦屬于自由基。便秘小鼠腸道內(nèi)的有害物質(zhì)會促使腸道菌群產(chǎn)生過量的內(nèi)毒素，進(jìn)而激活巨噬細(xì)胞和白細(xì)胞產(chǎn)生大量的NO［19］。而過量的NO能夠?qū)е录?xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)的失衡，從而產(chǎn)生炎癥反應(yīng)［20］，損傷腸黏膜，降低腸道功能。在松針提取液干預(yù)后，便秘小鼠血清和結(jié)腸中的 NO含量明顯減少(p＜0．05)(表4)，小鼠的腸道損傷明顯降低。

3.3 松針提取液對慢性便秘小鼠通便功能的影響

從表3看出松針提取液能夠明顯縮短便秘小鼠排首粒黑便的用時(shí)，并能夠增加排黑便的粒數(shù)和濕重。表明經(jīng)過松針提取液干預(yù)后，腸道功能得到一定程度恢復(fù)，便秘癥狀得到緩解。本實(shí)驗(yàn)中，由于三組松針是在不同料液比的條件下進(jìn)行提取，各提取液中活性物質(zhì)的含量和組成各不相同，因此對小鼠體內(nèi)的抗氧化活性和排便的效果也有所不同。

4 結(jié)論

本研究通過使用松針提取液對慢性便秘小鼠進(jìn)行干預(yù)，發(fā)現(xiàn)松針提取液能夠緩解慢性便秘致小鼠結(jié)腸的氧化損傷，提高腸道的抗氧化能力，進(jìn)而改善小鼠的通便功能。本研究為開發(fā)松針通便功能性食品提供了理論依據(jù)。

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