劉慧瑾，杜芳艷，高立國(guó)，代 帥

(榆林學(xué)院化學(xué)與化工學(xué)院，陜西榆林719000)

果膠是人體七大營(yíng)養(yǎng)素中膳食纖維的主要成分，具有良好的抗腹瀉、抗癌、治療糖尿病降血脂、止血、消腫、解毒和減肥等功效，是公認(rèn)安全的食品添加劑。果膠的需求量呈高速增長(zhǎng)態(tài)勢(shì)［1］。果膠的提取方法有微波法［2-3］、超聲波法［4］、酶法［5］、離子交換法［6］、膜分離法［7］、鹽析法［8］、微生物法［9］等。表面活性劑具有特殊的兩親結(jié)構(gòu)，可形成分子液膜萃取，增加液固接觸面積，增強(qiáng)溶劑對(duì)物料的潤(rùn)濕性和滲透性;另外，表面活性劑具有顯著的降低表面張力的能力，它的許多應(yīng)用都與此特性有關(guān)，例如分散、潤(rùn)濕、滲透和鋪展作用;由于表面活性劑降低了細(xì)胞膜與水溶液間的界面張力，有利于水溶液通過(guò)毛細(xì)管滲透進(jìn)入細(xì)胞壁內(nèi)，溶解更多有效成分，且物料更易被溶劑分散、潤(rùn)濕和鋪展開(kāi)來(lái)，增加了有效成分的溶出幾率;當(dāng)表面活性劑存在于界面時(shí)還表現(xiàn)出一定的吸附作用;表面活性劑的這種特性，使得其在提取分離中能增加浸出效能和萃取率，在天然產(chǎn)物提取中得到應(yīng)用。利用微波加熱能破壞原料的薄壁組織細(xì)胞，提高組織細(xì)胞的多孔滲透性和吸水能力。將微波和表面活性劑兩者的功能結(jié)合起來(lái)，起到協(xié)同作用，可降低成本，提高萃取效率。表面活性劑增效提取果膠的研究已有報(bào)道［10］，但應(yīng)用表面活性劑增效與微波輔助技術(shù)提取果膠的研究未見(jiàn)報(bào)道。海紅果為薔薇科植物海紅子(Malus micromalus)的果實(shí)，學(xué)名西府海棠［11］，是我國(guó)稀有果樹(shù)資源。我們采用表面活性劑/微波輔助技術(shù)提取海紅果渣中的果膠，通過(guò)響應(yīng)面法對(duì)提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，以求為海紅果的開(kāi)發(fā)利用提供技術(shù)支撐和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

海紅果 采自陜西省府谷縣。

十二烷基硫酸鈉(SDS) 西安化學(xué)試劑公司;無(wú)水乙醇;D-半乳糖醛酸對(duì)照品 中國(guó)藥品及生物制品鑒定所;咔唑 阿拉丁試劑網(wǎng);所用試劑均為分析純，水為二次蒸餾水。

MDS-8型多通量密閉微波化學(xué)工作站 上海新儀微波化學(xué)科技有限公司;電子分析天平沈陽(yáng)龍騰電子有限公司;722S型可見(jiàn)分光光度計(jì) 上海箐華科技儀器有限公司;80-2型電動(dòng)離心機(jī) 江蘇環(huán)宇科學(xué)儀器廠;pHS-3C型酸度計(jì) 上海理連儀器廠;101-1型數(shù)顯電熱鼓風(fēng)干燥箱 上海恒一科學(xué)儀器有限公司;FZ102型粉碎機(jī) 北京中興偉業(yè)儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 原料預(yù)處理 海紅果去除果肉部分，果核放入烘箱內(nèi)于60℃下烘干，粉碎，過(guò)60目篩得果渣粉，果渣粉用90℃水(料液比為1∶20)煮10min，使果膠酶失去活性，冷卻過(guò)濾，濾渣用35℃的溫水沖洗，至濾液為無(wú)色，以除去濾渣中的糖類(lèi)、色素等雜質(zhì)，60℃下干燥，保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 果膠提取工藝 稱(chēng)取2.000g果渣粉，按照1∶15(g/mL)的料液比，加入0.8%的十二烷基硫酸鈉(SDS)溶液，用0.05mol/L的鹽酸調(diào)節(jié)pH2.0，在50℃下，于MDS-8型多通量密閉微波化學(xué)工作站中提取14min，過(guò)濾，重復(fù)提取兩次，合并濾液，濾液定容至100mL得樣品儲(chǔ)備液。

1.2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線與果膠含量的測(cè)定 以D-半乳糖醛酸為標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，采用咔唑-硫酸分光光度法測(cè)定［12］。準(zhǔn)確量取樣品儲(chǔ)備液10.0mL于50mL燒杯中，加入1.0mol/L硫酸溶液6.0mL，在70℃水浴中加熱20min進(jìn)行水解，水解物冷卻至室溫后移入50mL容量瓶，水稀釋定容，得到樣品溶液。準(zhǔn)確移取樣品溶液10.0mL并定容到50mL，移取稀釋后的樣品溶液1.0mL于試管中，加入濃硫酸6.0mL，邊加邊流水冷卻，冷至室溫后加入0.15%的咔唑無(wú)水乙醇溶液0.50mL，搖勻，在室溫下暗處放置30min后，以試劑空白為參比，在530nm處測(cè)定其吸光度。樣品中的果膠物質(zhì)總含量以半乳糖醛酸表示:

果膠得率(%)=c×50×50×10-6/W×100

式中:c為從標(biāo)準(zhǔn)曲線查得的所測(cè)果膠液中的半乳糖醛酸的濃度(mg/L);W為樣品的質(zhì)量，g。取8支50mL 比色管，依次加入濃度為 0、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100μg/mL 的半乳糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)溶液1.0mL，按實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行測(cè)定，以吸光度為縱坐標(biāo)，半乳糖醛酸濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.4 單因素實(shí)驗(yàn) 按照1.2.2方法，采用單因素輪換實(shí)驗(yàn)分別考察pH、提取時(shí)間、料液比、表面活性劑用量、提取溫度對(duì)果膠得率的影響，確定各因素的最佳范圍。

1.2.5 響應(yīng)面法組合設(shè)計(jì)工藝優(yōu)化實(shí)驗(yàn) 在單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，確定采用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.8%的SDS為溶劑，微波提取功率為700W，溫度為50℃，同法提取兩次，選取溶劑的pH A、微波提取時(shí)間B及料液比C三個(gè)對(duì)海紅果渣中果膠得率影響較大的主要因素進(jìn)行優(yōu)化實(shí)驗(yàn)。以海紅果渣中果膠得率R1為目標(biāo)，使用中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和響應(yīng)面分析法，在三因子三水平上對(duì)提取工藝進(jìn)行優(yōu)化。實(shí)驗(yàn)因子和水平見(jiàn)表1。通過(guò)Design Expert 8.0.6軟件分析對(duì)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行回歸分析，預(yù)測(cè)提取果膠的最優(yōu)工藝參數(shù)。

表1 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)因素水平編碼Table 1 Levels and factors of the Box-Behnken design

2 結(jié)果與分析

2.1 半乳糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)曲線

在0～100.0mg/L范圍內(nèi)，吸光度和半乳糖醛酸的濃度呈良好的線性關(guān)系(誤差量＜±0.05)，見(jiàn)圖1。回歸方程為:A=0.0115c+0.0204(R2=0.9993)。式中:A為波長(zhǎng)530nm處的吸光度;c為D-半乳糖醛酸的含量(mg/L)。

圖1 半乳糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Egression curve of galaturonic acid

2.2 單因素實(shí)驗(yàn)

pH對(duì)果膠得率的影響:固定提取溫度50℃、SDS濃度為 0.8%，選用料液比 1∶20，微波輔助提取10min，微波功率700W，考察不同pH對(duì)果膠得率的影響，結(jié)果如圖2所示，當(dāng)pH＜2.0時(shí)，果膠得率隨pH增大而增加，在pH為2.0時(shí)果膠的得率達(dá)到最大，pH繼續(xù)增大時(shí)果膠得率下降，這是因?yàn)樗嵝赃^(guò)低，果膠不穩(wěn)定，逐步水解成單糖，而酸度過(guò)大對(duì)果膠分子甙鍵及酯鍵破壞大，果膠發(fā)生脫酯裂解，導(dǎo)致果膠得率下降。所以pH為2.0較合適。

微波時(shí)間對(duì)果膠得率的影響:固定提取溫度50℃、SDS濃度為0.8%，選用料液比1∶20，pH 為2.0，微波功率700W，考察不同微波輔助提取時(shí)間對(duì)果膠得率的影響，結(jié)果如圖3所示，在微波提取時(shí)間低于12min時(shí)，果膠得率隨著提取時(shí)間的增加而增大，在12min時(shí)果膠得率最大，時(shí)間大于12min時(shí)，再增加提取時(shí)間，果膠的得率反而下降。這一方面是因?yàn)槲⒉ㄗ饔糜诩?xì)胞壁，破壞原料的薄壁組織細(xì)胞，促進(jìn)細(xì)胞間果膠的釋放，另一方面是由于表面活性劑的吸附量在吸附初期，隨時(shí)間平方根成正比，且隨濃度增大而增加，吸附量增大，表面張力降低，有利于果膠的溶出。但處理時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，表面吸附經(jīng)過(guò)一定時(shí)間達(dá)到了飽和吸附量，表面張力基本不變［13］，而微波產(chǎn)生的高溫又會(huì)使果膠中的半乳糖醛酸分解，從而使果膠得率下降。

圖2 pH對(duì)果膠得率的影響Fig.2 Effect of pH value on the yield of pectin

圖3 提取時(shí)間對(duì)果膠得率的影響Fig.3 Effect of extraction time on the yield of pectin

料液比對(duì)果膠得率的影響:固定提取溫度50℃、SDS濃度為0.8%，pH為2.0，微波功率700W，微波輔助提取時(shí)間12min，考察不同料液比對(duì)果膠得率的影響，結(jié)果如圖4所示，當(dāng)料液比為1∶15時(shí)果膠得率最大，料液比過(guò)小時(shí)，不利于果膠質(zhì)水解成果膠，溶液中含有的果膠濃度低。料液比過(guò)大時(shí)，稀釋了提取物的濃度，提取量反而下降，并且由于其他物質(zhì)的溶出，造成過(guò)濾困難。

圖4 料液比對(duì)果膠提取率的影響Fig.4 Effect of solid to liquid ratio on the yield of pectin

SDS濃度對(duì)果膠得率的影響:固定提取溫度50℃、料液比 1∶15(g/mL)，pH 為 2.0，微波功率700W，微波輔助提取時(shí)間14min，考察SDS濃度對(duì)果膠得率的影響，結(jié)果如圖5所示，當(dāng)SDS濃度小于0.4%時(shí)得率隨濃度增加而增大，在0.8% 時(shí)，果膠得率最大。果膠得率提高的原因其一是表面活性劑形成分子液膜萃取，增加液固接觸面積，其二是因?yàn)楸砻婊钚詣┨囟ǖ碾p親結(jié)構(gòu)，具有分散、滲透、潤(rùn)濕等作用，可降低細(xì)胞膜與水溶液間的界面張力，有利于水溶液通過(guò)毛細(xì)管滲透進(jìn)入細(xì)胞壁內(nèi)，溶解更多的果膠，且在小于臨界膠束濃度時(shí)，表面張力隨著表面活性劑濃度的增加而降低，因此果膠得率隨著SDS濃度的增加而增大。當(dāng)SDS濃度大于0.4%時(shí)，增大SDS的濃度，果膠得率總體變化不是很大。這是因?yàn)楫?dāng)表面活性劑濃度達(dá)到臨界膠束濃度后，表面張力隨表面活性劑濃度的增加變化很小甚至不變［13］。因此果膠得率沒(méi)有太大的增加。實(shí)驗(yàn)選擇SDS濃度為0.8%。

圖5 SDS濃度對(duì)果膠得率的影響Fig.5 Effect of SDS concentration on the yield of pectin

微波提取溫度對(duì)果膠得率的影響:固定SDS濃度為0.8%，選用料液比1∶15，pH為2.0，微波輔助提取時(shí)間12min，考察提取溫度對(duì)果膠得率的影響，結(jié)果如圖6所示，當(dāng)溫度低于45℃時(shí)，隨著溫度的升高，果膠迅速溶解，果膠得率隨之而增大，溫度在45℃～65℃果膠溶解速率達(dá)到最大，果膠得率達(dá)到最高且隨溫度變化不大，當(dāng)溫度高于70℃時(shí)，由于果膠耐熱性較差，發(fā)生水解成單糖，導(dǎo)致果膠得率隨溫度升高而降低。

圖6 提取溫度對(duì)果膠提取率的影響Fig.6 Effect of extraction temperature on the yield of pecti

2.3 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果及分析

以果膠得率R1為響應(yīng)值，以溶劑的pH A、提取時(shí)間 B、料液比 C為主要影響因素，根據(jù) Box-Behnken的原理，由實(shí)驗(yàn)水平因素編碼進(jìn)行實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。對(duì)表2中實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多項(xiàng)式逐步回歸擬合，得到的回歸方程為:R1=16.16+0.39A+0.29B-0.075C-0.050A·B-0.18A·C+0.42B·C-0.96A2-0.86B2-0.68C2。

表2 響應(yīng)面分析方案及實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2 Program and test results of response surface analysis

回歸統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果見(jiàn)表3。擬合方程的每個(gè)變量對(duì)響應(yīng)值影響的顯著程度，可以通過(guò)p值來(lái)判斷［14］。p值越小則表示對(duì)應(yīng)變量的影響顯著性越高，當(dāng)p≤0.05時(shí)為顯著水平，當(dāng)p≤0.01時(shí)為水平極顯著。由表3可知，二次回歸模型的F=63.65，其(p＞F)值小于0.0001則表示二次回歸模型具有顯著性。失擬項(xiàng)F=263，p=0.1868＞0.05，說(shuō)明實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)擬合效果好，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)合理。模型二次項(xiàng)A2、B2、C2與影響因素 A、B以及交互項(xiàng) BC均具有極顯著性(p＜0.01)，其他因素不顯著。說(shuō)明pH、提取時(shí)間在本實(shí)驗(yàn)中的影響是極其重要的。BC兩個(gè)因素的交互作用對(duì)果膠得率有較大的影響。由此可以看出，回歸模型不是簡(jiǎn)單的線性關(guān)系。各因素對(duì)提取海紅果渣果膠得率的影響大小順序?yàn)?溶劑pH＞提取時(shí)間＞料液比。模型調(diào)整確定系數(shù)R2=0.9573，說(shuō)明該模型能較好的解釋響應(yīng)值的變化。

由二次回歸模型得出以下三個(gè)響應(yīng)曲面圖，見(jiàn)圖7～圖9，分析圖可以了解以下因素對(duì)響應(yīng)目標(biāo)(海紅果渣果膠得率)的影響和各個(gè)因素間的交互作用。由圖可以看出，響應(yīng)曲面均是開(kāi)口向下的凸面，且其中心位于所考察區(qū)域內(nèi)，說(shuō)明在考察的區(qū)域范圍內(nèi)存在響應(yīng)值的最大值，通過(guò)軟件分析，表面活性劑SDS/微波輔助提取海紅果渣中果膠的最佳條件為:表面活性劑SDS的濃度為0.8%的條件下，控制溶劑的pH為2.04，提取時(shí)間 14.3min，料液比為 1∶14.8(g/mL)，海紅果渣中果膠的得率為16.22%。

圖7R1=(A，B)的響應(yīng)面圖Fig.7 Response surface plot of R1between A and B

2.4 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

對(duì)優(yōu)化所得實(shí)驗(yàn)方案進(jìn)行驗(yàn)證，即采用0.500g海紅果渣，按照1∶15(g/mL)的料液比，加入0.8%SDS溶液，用0.05mol/L的鹽酸調(diào)節(jié)pH2.0，控制微波溫度50℃，微波提取時(shí)間為14min，重復(fù)提取兩次。進(jìn)行5次平行實(shí)驗(yàn)求平均值。結(jié)果海紅果渣中果膠得率為16.1%。與模型預(yù)測(cè)值之間的誤差為-0.12%。

表3 回歸模型方差分析Table 3 Analysis of variance for regression Model

圖8 R1=(A，C)的響應(yīng)面圖Fig.8 Response surface plot of R1between A and C

圖9 R1=(B，C)的響應(yīng)面圖Fig.9 Response surface plot of R1between B and C

3 結(jié)論與討論

一定濃度的表面活性劑SDS具有分散、滲透、潤(rùn)濕等作用，增加液固接觸面積，有效降低界面張力，從而促進(jìn)果膠的充分溶出。

海紅果渣中含有一定量的果膠，采用響應(yīng)面法所得到的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ涂煽浚哂幸欢▽?shí)用價(jià)值，其優(yōu)化的提取工藝條件是:按照1∶15(g/mL)的料液比，加入0.8%SDS溶液，用0.05mol/L的鹽酸調(diào)節(jié)pH2.0，控制微波溫度50℃，微波提取時(shí)間為14min，重復(fù)提取兩次。進(jìn)行5次平行實(shí)驗(yàn)求平均值。結(jié)果海紅果渣中果膠得率為16.1%。

采用表面活性劑SDS/微波輔助法提取果膠，將微波和表面活性劑兩者的功能結(jié)合起來(lái)，起到協(xié)同作用，可以顯著提高海紅果渣中果膠得率，而且提取時(shí)間短，溫度低，可降低成本。

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