魏金鋼，韓曉萍，劉英俊，蘭芳菲，梁愛心，吳紅翔，舒鄧群*

(1.江西農業(yè)大學 動物科學技術學院，江西 南昌 330045;2.華中農業(yè)大學 動物科學技術學院，湖北 武漢 430070)

生長速度、產肉率和飼料利用率等是衡量肉用動物生產性能的主要指標，動物的生長既可以從營養(yǎng)方面調控，也可以通過動物生長軸的調控進行調節(jié)。動物生長軸是由動物體內下丘腦-垂體-靶器官及其相關的激素和受體所組成的具有自動調節(jié)的神經內分泌系統(tǒng)，下丘腦分泌生長激素釋放因子(growth hormone-releasing factor，GRF)和生長抑素(somatostatin，SS)，GRF 促進垂體加強生長激素(growth hormone，GH)的分泌，從而促進動物的生長;生長抑素則抑制垂體分泌生長激素，從而抑制動物的生長。粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony-stimulating factor，GM-CSF)是一個具有多項潛能的造血生長因子，不僅能刺激造血祖細胞增殖、分化和成熟，而且還能活化中性粒細胞、巨噬細胞、DC 及其它單核細胞，常用作DNA 疫苗的免疫佐劑，以提高DNA 疫苗的免疫效果［1］。舒鄧群等以豬的真核表達質粒pGM-CSF 為模板，構建GM-CSF 與SS 融合表達質粒(pGM-CSF/SS)，免疫小鼠后，可增強小鼠脾臟淋巴細胞的增殖能力，提高生長抑素抗體的P/N 值［2］，提高肌肉組織中GHR 和IGF-I mRNA 的表達［3］。本研究利用動物的生長軸的原理，采用生物工程的方法，應用共表達載體pIRES 將GM-CSF 基因和SS 基因分別克隆到載體的多克隆位點A 和B，構建共表達基因疫苗，旨在同時表達GM-CSF 和SS 兩種蛋白，研究基因佐劑GM-CSF 對生長抑素的免疫增強作用，為提高動物的生產性能提供理論基礎。

圖1 pIRES 質粒結構Fig.1 Structure of pIRES plasmid

1 材料與方法

1.1 質粒和菌種

質粒pIRES 由暨南大學醫(yī)學院血液病研究所李揚秋老師惠贈，質粒結構見圖1。質粒pVGS/2SS-asd 由華中農業(yè)大學楊利國教授惠贈［4］，該質粒包括GM-CSF 片段和含有乙肝表面抗原的2SS 片段，E.coli DH5α受體菌購于天根生物有限公司。

圖2 pIRES-GM-CSF/2SS 質粒的構建圖Fig.2 Schematic illustration for construction of pIRES-GM-CSF/2SS

1.2 酶和試劑

Taq DNA 聚合酶;DNA 分子量標準DL5000 和DL10000;pEASYTM-T1 Simple T載體;T4DNA 連接酶均購自北京全式金有限公司;PCR 產物純化試劑盒、質粒提取試劑盒由北京原平皓公司生產;限制性內切酶Xba Ⅰ、Nhe I、EcoR Ⅰ、Not I、Sal I 購 于Toyobo 公司;其它試劑均為國產分析純。GM-CSF 與SS 共表達質粒構建的技術路線見圖2。

1.3 引物的設計與合成

采用Primer 5.0 軟件設計引物，分別根據(jù)豬的GM-CSF 序列［5］和2SS 片段(含有乙肝表面抗原S 基因)序列設計擴增GM-CSF 和2SS 片段的引物［6］(表1)，設計引物由上海生物工程有限公司合成。

表1 目的基因引物參數(shù)Tab.1 Parameter of oligo-nucleotide primer pairs for the target genes

1.4 pIRES 質粒的提取與酶切

將pIRES 質粒轉入感受態(tài)大腸桿菌E.coli DH5α中，鋪板與擴大培養(yǎng)后挑取單菌落進行培養(yǎng)，采用質粒提取試劑盒提取質粒pIRES，然后進行酶切，酶切體系為:10×M buffer 1.0 μL、XbaⅠ0.2 μL、EcoR I 0.2 μL、pIRES 質粒2 μL、ddH2O 至總體積10 μL，37 ℃，反應2～3 h，酶切后，用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切結果。

1.5 pIRES-GM-CSF 質粒的構建

1.5.1 GM-CSF 基因的擴增 按試劑盒說明書抽提和純化pVGS/2SS-asd 質粒。以pVGS/2SS-asd質粒為模板，按照如下PCR 反應體系進行GM-CSF 基因的擴增:5×Buffer 2 μL、d NTP 0.4 μL、Taq DNA 聚合酶0.4 μL、引物p1、p2 各0.5 μL、pVGS/2SS-asd 質粒1.5 μL、ddH2O 至合計20 μL。按以下條件進行PCR 反應:94 ℃變性6 min，然后，94 ℃變性1 min、51 ℃退火1 min、72 ℃延伸1 min，35 個循環(huán)后72 ℃續(xù)延10 min、16 ℃降溫5 min。PCR 產物1.0%瓊脂糖電泳檢測，膠回收，純化和定量，備用。

1.5.2 GM-CSF 基因與T 載體相連 按照如下連接體系將GM-CSF 基因與T 載體進行相連:PCR 的產物GM-CSF 4 μL、T-載體1 μL，35 ℃反應15 min，將反應產物轉化感受態(tài)DH5α中，培養(yǎng)后，采用質粒提取試劑盒提取質粒TGM-CSF 質粒。然后按以下酶切體系進行酶切鑒定:T-GMCSF 質粒2 μL、Nhe I 0.1 μL、EcoR I 0.3 μL、10×M Buffer 1 μL、加ddH2O 至總體積10 μL，鑒定正確的質粒送往北京奧科生物技術有限公司測序，備用。

1.5.3 pIRES-GM-CSF 質粒的構建 純化后的pIRES 質粒和TGM-CSF 質粒分別用Nhe I 和EcoR I 雙酶切，酶切體系分別為:pIRES 質粒12 μL、Nhe I 0.4 μL、EcoR I 0.8 μL、10×M Buffer2 μL、加dd H2O 至總體積20 μL;TGM-CSF 12 μL、Nhe I 0.2 μL、EcoR I 0.2 μL、10×M Buffer 2 μL、加ddH2O 至總體積20 μL，37 ℃，反應2～3 h，酶切后，用1.0%瓊脂糖凝膠電泳，分別分離回收pIRES 大片段和GM-CSF 片段，備用。

然后，將回收、純化的pIRES 大片段和GM-CSF 片段按如下體系進行連接反應:pIRES 載體線性片段1 μL、GM-CSF 線性片段4 μL、5×T4Ligase Buffer 2 μL、T4DNA Ligase 1 μL、dd H2O 2 μL、共計10 μL，23 ℃水浴，連接20 min。

1.5.4 陽性重組質粒(pIRES-GM-CSF)的篩選和鑒定 將連接產物轉化感受態(tài)E.coli DH5α細菌，固體培養(yǎng)基鋪板培養(yǎng)，挑取陽性克隆，LB 培養(yǎng)，提取質粒DNA，進行酶切鑒定，酶切體系為:陽性克隆2 μL、Nhe I 0.1 μL、EcoR I 0.3 μL、10×M Buffer 1 μL、ddH2O 至總體積10 μL，37 ℃，反應2～3 h，1.0%瓊脂糖電泳檢測，電泳條帶與目的條帶大小相符，鑒定正確的質粒送往北京奧科生物技術有限公司測序，獲得的陽性克隆命名為pIRES-GM-CSF。

1.6 pIRES-GM-CSF/2SS 質粒的構建

1.6.1 2SS 基因的擴增 以pVGS/2SS-asd 質粒為模板，按照如下PCR 反應體系進行SS 基因的擴增:5×Buffer 2 μL、d NTP 0.4 μL、Taq DNA 聚合酶0.4 μL、引物p3、p4 各0.5 μL、pVGS/2SS-asd 模板1.5 μL、ddH2O 至總體積20 μL，按以下條件進行PCR 反應:94 ℃變性6 min，然后94 ℃變性1 min、54.9 ℃退火1 min、72 ℃延伸1 min，35 個循環(huán)后，72 ℃續(xù)延10 min、16 ℃降溫5 min，PCR 產物1.0%瓊脂糖電泳檢測，膠回收，純化和定量，備用。

1.6.2 T2SS 質粒的構建 將2SS 的PCR 產物與T 載體相連，連接體系:PCR 的產物2SS 4 μL、T 載體1 μL、35 ℃反應15 min，反應結束后放于冰上。然后將陽性質粒轉入DH5α，進行培養(yǎng)擴增，提取T2SS質粒進行酶切鑒定，酶切體系為T2SS 2 μL、Not I 0.2 μL、Sal I 0.2 μL、10×H Buffer 1 μL、dd H2O 至總體積共計10 μL，酶切產物進行1.0%瓊脂糖電泳檢測，同時，將鑒定正確的質粒送往北京奧科生物技術有限公司測序，測序正確的質粒進行保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6.3 pIRES-GM-CSF/2SS 質粒的構建 純化后的pIRES-GM-CSF 質粒和T2SS 質粒分別采用NotI 和SalI 雙酶切pIRES-GM-CSF 質粒酶切體系為:pIRES-GM-CSF 質粒12 μL、Not I 1 μL、Sal I 1 μL、10×H Buffer 2 μL、dd H2O 至總體積20 μL;T2SS 質粒酶切體系為:T2SS 11.2 μL、Not I 0.8 μL、Sal I 1 μL、10×H Buffer 2 μL、dd H2O 至總體積20 μL。分別在37℃，反應2～3 h，回收、純化的pIRES-GM-CSF 大片段和2SS 片段，1.0%瓊脂糖電泳檢測，酶切產物保存?zhèn)溆谩?/p>

將回收、純化的pIRES-GM-CSF 大片段和2SS 片段按如下體系進行連接反應:pIRES-GM-CSF片段1 μL、2SS 線性片段5 μL、5×T4Ligase Buffer2 μL、T4DNA Ligase 1 μL、dd H2O 至總體積10 μL，23℃水浴，連接20 min。連接產物備用。將連接產物轉化感受態(tài)E.coli DH5α細菌，固體培養(yǎng)基鋪板培養(yǎng)，挑取陽性克隆，LB 培養(yǎng)，提取質粒DNA。

1.6.4 pIRES-GM-CSF/2SS 的酶切鑒定和測序 將上述提取的質粒按如下體系進行酶切鑒定:酶切體系1:陽性克隆2 μL、Nhe I 0.1 μL、EcoR I 0.3 μL、10×M Buffer1 μL、dd H2O 至總體積10 μL;酶切體系2:陽性克隆2 μL、Not I 0.2 μL、Sal I 0.2 μL、10×H Buffer 1 μL、dd H2O 至總體積10 μL，37 ℃，反應2～3 h，1.0%瓊脂糖電泳檢測，將鑒定正確的質粒送往北京奧科生物技術有限公司測序，獲得的陽性克隆命名為pIRES-GM-CSF/2SS。

2 結果與分析

2.1 pIRES 質粒提取

用試劑盒提取目的質粒，用TE 溶解后，1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果如圖3 所示。由圖3 可見，在5 000 bp 之后有條6 100 bp 的條帶，與pIRES 質粒大小相符，而且，OD260/OD280值均在1.8～2.0 之間，說明DNA 純度較高，可直接用于酶切反應。再用Xba I 和EcoR I 酶切pIRES 質粒，結果見圖4。由圖4 可以看出，在500～750 bp 之間有條651 bp 的條帶，與IRES 片段大小相符。

圖3 pIRES 質粒Fig.3 pIRES plasmid

圖4 pIRES 質粒的酶切Fig.4 Digestion of pIRES plasmid

2.2 GM-CSF 片段的擴增

采用pVGS/2SS-asd 模板，通過PCR 的方法擴增GM-CSF 的片段，1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物，結果如圖5 所示，由圖5 可見，在250～500 bp之間有條465 bp 條帶，與GM-CSF 片段的大小符合。

2.3 TGM-CSF 質粒的提取

將T 載體與GM-CSF 片段連接，35 ℃、反應15 min，然后轉化感受態(tài)的大腸桿菌，提取質粒鑒定，1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果如圖6 所示。由圖6可見，在3 000～5 000 bp 之間有條4 299 bp 的條帶，與TGM-CSF 質粒的大小相符。

2.4 TGM-CSF 質粒的雙酶切鑒定

用EcoR I 和Nhe I 對TGM-CSF 質粒進行雙酶切，37 ℃酶切3 h，1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果如圖7 所示。由圖7 可見，3 829 bp 的條帶為T 載體，與T 載體的大小相符;另外，在圖還可看到條465 bp 的條帶，與GM-CSF 片段的大小相符。

圖5 GM-CSF 的PCR 片段Fig.5 GM-CSF fragment by PCR

圖6 TGM-CSF 質粒Fig.6 TGM-CSF plasmid

圖7 TGMCSF 質粒酶切Fig.7 Digestion of TGM-CSF plasmid

2.5 pIRES-GM-CSF 質粒的鑒定

將pIRES 質粒和TGM-CSF 質粒分別用EcoR I和Nhe I 雙酶切，37 ℃酶切3 h，然后回收pIRES 的大片段和GM-CSF 片段，回收的片段后在23 ℃水浴環(huán)境下連接20 min，然后導入大腸桿菌，提取質粒用EcoR I 和Nhe I 雙酶切鑒定，37 ℃酶切3 h，酶切結果用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果如圖8 所示。由圖8 可見，一條6 089 bp 的條帶與pIRES 載體的大小相符，還有一條465 bp 的條帶與GM-CSF 目的片段的大小相符。

2.6 PCR 擴增SS 目的基因

以pVGS/2SS-asd 質粒為模板擴增SS 基因，擴增結果1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果如圖9 所示。由圖9 可見，有一條822 bp 的條帶，與預期的2SS 片段的大小相符。

圖8 pIRES-GM-CSF 酶切Fig.8 Digestion of pIRES-GM-CSF plasmid

圖9 擴增的SS 片段Fig.9 PCR fragment of 2SS

2.7 T2SS 質粒的鑒定

將SS 片段回收后與T 載體連接，35 ℃反應15 min，回收后導入大腸桿菌，提取質粒。用EcoR I和Nhe I 酶切質粒，1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果如圖10 所示。由圖10 可見，有條822 bp 的條帶，與預期的2SS 片段大小相符。

2.8 pIRES-GM-CSF/2SS 的鑒定

分別用Not I 和Sal I、EcoR I 和Nhe I 酶切共表達基因疫苗pIRES-GM-CSF/2SS，1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果如圖11 所示。從電泳圖中可以看出有條465 bp 的條帶，與目的片段GM-CSF 的大小相符，另有條822 bp 的條帶，與目的片段2SS 的大小相符。

圖10 T2SS 酶切Fig.10 Digestion of T2SS

圖11 pIRES-GM-CSF/2SS 酶切Fig.11 Digestion of pIRES-GM-CSF/2SS plasmid

3 討論

曹少先等成功構建了生長抑素基因疫苗pcS/SS，且在真核細胞中都得到很好的表達，具有SS 的反應原性，用pcS/SS 免疫SD 大鼠，50 μg 的劑量表現(xiàn)出良好的免疫反應性，抗體陽性率為60%［6］。但由于種與種之間的免疫遺傳差異，DNA 疫苗對大動物特別是對哺乳動物，免疫原性差［7］，免疫效果往往不理想，因而影響DNA 疫苗的實用性。要獲得效力更持久、免疫應答更強以及最優(yōu)化的免疫應答，需進一步改善DNA 疫苗的免疫應答。使用重組的細胞因子蛋白或質粒編碼的細胞因子作為基因佐劑，即采用將抗原基因與細胞因子質粒聯(lián)合注射、融合表達或共表達的方式，可增強機體免疫應答效率，提高免疫效果。

GM-CSF 由多種細胞分泌，能夠刺激和活化專業(yè)的APC，可提高體液免疫和CTL 應答，因而是基因免疫中極有應用前景的細胞因子［8］。大量研究表明，編碼GM-CSF 的質粒能增強DNA 疫苗的免疫效果［9］。

目前基因疫苗與基因佐劑表達的方式有以下3 種:(1)共注射:采用表達質粒分別構建基因疫苗和佐劑質粒，然后在動物的不同部位分別注射這兩種質粒。李琳等同時對小鼠注射pcDNA3/mGM-CSF和pcDNA3/MDC-VP1，發(fā)現(xiàn)GM-CSF 基因對pcDNA3/MDC-VP1 有免疫增強的作用，但是其存在操作相對來說比較繁瑣，可能存在局部免疫不均勻［10］。(2)共免疫:采用表達質粒將目的基因與佐劑以融合表達的形式構建融合表達基因疫苗。舒鄧群等首先成功構建了融合表達基因疫苗pGM-CSF/SS，通過小鼠口服融合表達疫苗pGM-CSF/SS 的免疫方式，觀察其對小鼠淋巴細胞增殖和GH、IGF-Ⅰ分泌的影響，發(fā)現(xiàn)pGM-CSF/SS 的免疫效果優(yōu)于pGM-CSF+pcS/2SS 組［11］。(3)共表達基因疫苗:在一個共表達質粒的兩個多克隆位點上同時克隆目的基因和佐劑基因，可同時表達2 個完全獨立的蛋白。李闖等構建的TCR Vα1-pIRES-TCR Vβ8 的共表達載體，轉染A549 和Molt4 細胞后，在mRNA 和蛋白水平檢測到了TCR Vα1 和TCR Vβ8 的表達，為利用特異性TCR 基因修飾T 細胞的研究提供方法學依據(jù)［12］。韓雷等構建了pIRES-hVEGF121cDNA/hBMP-4 質粒，并且在轉染COS-7 細胞，提取總RNA和總蛋白，進行RT-PCR 和Western-blot 分別檢測到目的基因和目的蛋白［13］。

IRES 序列來源于腦心肌炎病毒(ECMV)，它具有不依賴于5'帽子結構的翻譯起始，pIRES 載體質粒上有兩個多克隆位點MCSA 和MCSB，當目的基因被克隆進這兩個位點時，該載體能夠同時翻譯出兩種目的蛋白。Camille Allera-Moreau 等用光度計檢測到連接了IRES 的FGF-1 和FGF-2 基因在小鼠肌肉細胞中的表達［14］。Liu S 等通過構建pIRES-Sj97-Sj14-Sj26 免疫小鼠，通過ELISA 檢測抗體和MTT 法檢測CD4+and CD8+T 細胞增值，發(fā)現(xiàn)其與對照組相比能夠增強小鼠的免疫力［15］。胡剛等首先構建了pIRES-PML-RARα-hIL-2 重組質粒，然后轉染A549 細胞，通過點雜交試驗和ELISA 檢測到這兩個基因的表達［16］。黃梅娟等分別構建了pIRES-Jurkat Vβ8、pIRES-Molt4 Vβ2(1)和pIRES-Molt4 Vβ2(2)三種質粒，首先通過測序證明質粒構建的正確性，然后轉染K562 細胞，通過間接免疫熒光法、SDS-PAGE 和Western-blotting 等檢測其能夠表達相應的目的蛋白［17］。

本研究利用共表達載體pIRES，分別在核糖體進入位點(IRES)的兩個多克隆位點(MCSA 和MCSB)分別克隆GM-CSF 基因和SS 基因，成功構建了含GM-CSF 基因和SS 基因的共表達基因疫苗pIRES-GM-CSF/2SS，為共表達基因疫苗pIRES-GM-CSF/2SS 的后續(xù)研究奠定了良好的基礎。

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