陳潔瓊，江 瑛，陳 瓊，黃水金*，李保同

(1.江西農業(yè)大學 農學院，江西 南昌 330045;2.江西省農業(yè)科學院，江西 南昌 330200)

小菜蛾(Plutella xylostella)屬于鱗翅目菜蛾科，是世界性的十字花科蔬菜主要害蟲［1］。由于其年發(fā)生代數(shù)多，繁殖系數(shù)高，危害極為嚴重?；瘜W藥劑一直是防治小菜蛾的主要手段，由于長期的不合理用藥，導致抗藥性十分嚴重，如對氯蟲苯甲酰胺等均產生了較高的抗性水平［2-3］。唑蟲酰胺(tolfenpyrad)為新型吡唑雜環(huán)類殺蟲殺螨劑，其作用機理為阻礙線粒體代謝系統(tǒng)中的電子傳遞系統(tǒng)復合體I，從而使電子傳遞受到阻礙，使昆蟲不能提供和貯存能量，被稱為線粒體電子傳達復合體阻礙劑(METI)［4］。該藥劑對多種螨類以及鱗翅目、半翅目、膜翅目、雙翅目和纓翅目害蟲均有效，特別是對小菜蛾、薊馬和茶葉小綠葉蟬有特效［4］。目前，尚未見田間害蟲對唑蟲酰胺產生抗性的報道。已有研究表明，大田使用殺蟲劑除可直接殺死靶標害蟲，其在環(huán)境中的毒力隨著時間的延續(xù)會逐漸遞減到亞致死劑量，可能造成昆蟲生態(tài)行為、生殖力、發(fā)育歷期和抗藥性的變化［5-7］。隨著唑蟲酰胺的廣泛應用，其對害蟲的選擇壓力也將隨之增大，施用后同樣可能存在田間亞致死效應。為此，筆者研究了唑蟲酰胺對小菜蛾3 齡幼蟲的亞致死效應，旨在為唑蟲酰胺的合理應用及小菜蛾的綜合治理提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試昆蟲 供試小菜蛾采自江西省南昌縣郊區(qū)菜地，幼蟲參照蛭石蘿卜苗法［8］飼養(yǎng)。幼蟲化蛹后，轉至25 cm×15 cm×25 cm(長×寬×高)的養(yǎng)蟲紗籠內羽化，籠內放置沾有10%蜂蜜水的棉球供成蟲取食，以及1 盆高約10 cm 的新鮮蘿卜苗供其產卵。每天更換新鮮蘿卜苗并補充糖水，將帶卵蘿卜苗放入60 cm×30 cm×25 cm(長×寬×高)的養(yǎng)蟲籠內孵化和飼養(yǎng)。

1.1.2 供試藥劑、試劑及儀器 15%唑蟲酰胺水乳劑(江西正邦生物化工股份有限公司技術部配制)，α-乙酸萘酯(α-NA，廣州齊云生物技術有限公司，分析純)，固藍RR 鹽(南京生工進口分裝)，對硝基苯甲醚(β-NA，瑞士Adamas-beta 公司，分析純)，還原型輔酶Ⅱ(NADPH)(Roche，進口分裝)，牛血清白蛋白和考馬斯亮藍G-250(上海藍季科技發(fā)展公司)，苯甲基磺酰氟(PMSF)、二硫代蘇糖醇(DTT)、苯基硫脲(PTU)、2，4-二硝基氯苯(CDNB)、還原性谷胱甘肽(GSH)均為國產分析純。UV9100 型紫外可見分光光度計(北京萊伯泰科儀器有限公司)。

1.2 試驗方法

1.2.1 生物測定 毒力測定采用浸葉法［9］:取新鮮甘藍葉片，清洗擦拭干凈后，用打孔器打成直徑約6 cm的圓片，分別置于用水稀釋的系列濃度的藥液中，浸漬10 s 后取出，晾干，放入φ7 cm 的培養(yǎng)皿內，每皿接入小菜蛾3 齡中期幼蟲10 頭，置于溫度(25±1)℃、相對濕度65%±5%、光周期14L:10D 的人工養(yǎng)蟲室中飼養(yǎng)。每處理重復4 次，并設清水作對照。每隔24 h 觀察記錄試蟲死亡情況，并于處理后72 h統(tǒng)計死亡率，計算毒力回歸方程、LC30和LC50。

1.2.2 生物學特性觀察 按毒力回歸方程計算的LC30和LC50值配制唑蟲酰胺藥液，參照1.2.1 方法對小菜蛾3 齡中期幼蟲進行藥劑處理和飼養(yǎng)，處理后72 h 將存活幼蟲轉入無毒的新鮮甘藍葉片上繼續(xù)飼養(yǎng)。每處理重復10 次，并設清水處理作對照。對藥前和藥后72 h 的幼蟲以及化蛹當日的蛹稱量，以后每隔24 h 觀察記錄幼蟲發(fā)育進度與死亡、幼蟲化蛹與蛹期及成蟲羽化情況。將相同濃度同日羽化的雌雄成蟲放入口徑為7 cm 的一次性塑料杯內配對產卵，杯中放置一小團浸有10%糖水的棉球為成蟲補充能量，每個處理配對20～30 對，每天更換棉球并記錄成蟲壽命和產卵數(shù)量。

1.2.3 幼蟲體內解毒酶活性測定 按毒力回歸方程計算的LC30和LC50值配制唑蟲酰胺藥液，參照1.2.1方法對小菜蛾3 齡中期幼蟲進行藥劑處理和飼養(yǎng)，分別測定處理后24，48，72 h 存活幼蟲體內解毒酶活性。

酶原制備:①酯酶:挑選5 頭幼蟲，加入1 000 μL 磷酸緩沖液(0.1 mmol/L，pH=7.0，含0.1%TritonX-100)冰浴勻漿2 min。②谷胱甘肽-s-轉移酶:挑取5 頭幼蟲，加入1 000 μL 磷酸緩沖液(0.1 mmol/L，pH=7.0，含1 mmol/L EDTA)冰浴勻漿2 min。③多功能氧化酶:挑取5 頭幼蟲，加入1 100 μL磷酸緩沖液(0.1 mol/L，pH=7.8，含1 mmol/L EDTA、1 mmol/L DTT、1 mmol/L PTU 和1 mmol/L PMSF)冰浴勻漿2 min。將勻漿液于4 ℃10 000 r/min 條件下離心10 min，取上清液在4 ℃12 000 r/min條件下離心30 min，最后所得上清液作為酶原備用。

酶活性測定:①酯酶:于比色皿中依次加入2 000 μL 底物與顯色劑的混合液(含2.1 mmol/Lα-NA和2.1 mmol/L 固藍RR 鹽)，900 μL 0.1 mol/L 磷酸緩沖液和100 μL 酶液(稀釋10 倍)，混勻，27 ℃溫育5 min 后，置于分光光度計450 nm 波長下測定光密度值。②谷胱甘肽-s-轉移酶:于比色皿中加入900 μL 0.1 mol/L 的磷酸緩沖液，1 000 μL 6 mmol/L GST 和1 000 μL 1.2 mmol/L 的CDNB，最后加入100 μL酶液(稀釋10 倍)，混勻，27 ℃溫育5 min，置于分光光度計340 nm 波長下測定光密度值。③多功能氧化酶:于比色皿中加入1 000 μL 2 mmol/L p-NA，100 μL 9.6 mmol/L NADPH 和900 μL 酶液，混勻后置于分光光度計405 nm 波長下測定光密度值。

蛋白質含量測定:參照Bradford［10］考馬斯亮藍G-250 法，以BSA 作標準曲線。

1.2.4 數(shù)據(jù)分析 毒力回歸方程、LC30和LC50值以及LSD 多重比較均使用SPSS 17.0 軟件進行計算與分析。

2 結果與分析

2.1 唑蟲酰胺對小菜蛾的毒力

根據(jù)生物測定結果，利用機率值分析法建立的唑蟲酰胺對小菜蛾的毒力回歸方程為y=2.727 4+2.185 9x，R2=0.964 3，LC30值為6.306 1 mg/L，LC50值為10.955 5 mg/L(95% 置信限為8.956 3～13.416 2 mg/L)。以此LC30和LC50值作為以下研究的藥劑亞致死濃度。

2.2 唑蟲酰胺亞致死濃度對小菜蛾幼蟲體質量及蛹質量的影響

參試的不同處理組幼蟲的初始體質量無顯著性差異，而處理后72 h 不同處理組存活的幼蟲體質量存在差異(表1)。其中，CK 組的幼蟲體質量最大，平均為3.08 mg/頭，分別為LC30和LC50處理組幼蟲體質量的2.5 倍和2.9 倍，均顯著高于2 個藥劑處理組。CK 組的雌雄蛹質量分別為5.18 mg/頭和6.13 mg/頭，均明顯高于2 個用藥處理組。同時，高濃度藥劑處理組幼蟲體質量和蛹質量均低于低濃度藥劑處理組，但彼此間差異不顯著。由此表明，唑蟲酰胺亞致死濃度可顯著降低小菜蛾幼蟲和蛹的體質量。

表1 亞致死濃度唑蟲酰胺對小菜蛾幼蟲體質量及蛹質量的影響Tab.1 Effects of sublethal concentration of tolfenpyrad on the body mass of larval and pupal of Plutella xylostella(L.)

2.3 唑蟲酰胺亞致死濃度對小菜蛾生長發(fā)育及繁殖的影響

藥劑處理后，小菜蛾幼蟲和蛹的發(fā)育歷期顯著延長，其中LC30和LC50處理組從3 齡幼蟲發(fā)育至4 齡幼蟲的時間分別延長0.46 d 和0.56 d(表2)，用藥后小菜蛾3 齡至蛹發(fā)育歷期可以看出，唑蟲酰胺亞致死濃度處理小菜蛾3 齡幼蟲，對其幼蟲和蛹的發(fā)育有顯著的遲滯效應。同時，唑蟲酰胺亞致死濃度可顯著降低幼蟲化蛹率、成蟲羽化率、成蟲壽命和成蟲單雌產卵量，

LC30和LC50處理組的化蛹率分別為77.60%和73.82%，明顯低于未用藥對照組(89.21%)，2 個藥劑處理組的羽化率亦均明顯低于對照組。此外，唑蟲酰胺還影響小菜蛾成蟲壽命，LC30和LC50處理組的成蟲壽命均顯著短于對照組的成蟲壽命。

從表2 還可看出，藥劑處理組的單雌產卵量均顯著低于對照組，且隨著藥劑濃度增加而降低。此外，藥劑處理組的卵孵化率也明顯低于對照組。表明亞致死濃度唑蟲酰胺處理對小菜蛾的繁殖不利。

表2 亞致死濃度唑蟲酰胺對小菜蛾生長發(fā)育的影響Tab.2 Effects of sublethal concentration of tolfenpyrad on the development and reproduction of Plutella xylostella(L.)

2.4 唑蟲酰胺亞致死濃度對小菜蛾幼蟲體內解毒酶活性的影響

2.4.1 唑蟲酰胺對小菜蛾多功能氧化酶活性的影響 藥劑處理后24 h，LC30和LC50處理組幼蟲的多功能氧化酶活性分別為0.18 OD/(min·mg pro)和0.11 OD/(min·mg pro)，均明顯低于CK，且其活性隨著唑蟲酰胺濃度的提高而降低;藥劑處理后48 h 和72 h，LC30和LC50處理組幼蟲的多功能氧化酶活性均明顯低于CK(圖1)。由此表明，小菜蛾3 齡幼蟲經唑蟲酰胺亞致死濃度處理后，其體內多功能氧化酶活性受到不同程度的抑制。

圖1 亞致死濃度唑蟲酰胺對小菜蛾多功能氧化酶活性的影響Fig.1 Effects of sublethal concentration of tolfenpyrad on MFOs activity of P.xylostella

圖2 亞致死濃度唑蟲酰胺對小菜蛾酯酶活性的影響Fig.2 Effects of sublethal concentration of tolfenpyrad on EST activity of P.xylostella

2.4.2 唑蟲酰胺對小菜蛾幼蟲體內酯酶活性的影響 藥劑處理后24，48，72 h，小菜蛾幼蟲酯酶活性顯著低于CK，其中，LC30處理組小菜蛾幼蟲酯酶活性比CK 分別降低32.02%、27.55%和28.28%，但高于LC50處理組(圖2)。由此表明，小菜蛾3 齡幼蟲經過唑蟲酰胺亞致死濃度處理后，其體內的酯酶活性受到不同程度抑制。

圖3 亞致死濃度唑蟲酰胺對小菜蛾谷胱甘肽-s-轉移酶活性的影響Fig.3 Effects of sublethal concentration of tolfenpyrad on GSTs activity of P.xylostella

2.4.3 唑蟲酰胺亞致死濃度對小菜蛾幼蟲體內谷胱甘肽-s-轉移酶活性的影響 藥劑處理后24，48，72 h，LC30和LC50處理組的GSTs 酶活性均顯著降低(圖3)。由此表明，小菜蛾3 齡幼蟲經唑蟲酰胺亞致死濃度處理后，其體內谷胱甘肽-s-轉移酶活性也受到顯著的抑制。此外，LC30處理組的GSTs 酶活性波動較大，藥后24 h 的GSTs 酶活性顯著高于LC50處理組，而藥后48 h和72 h 均顯著低于LC50處理組(圖3)。

3 討論

亞致死劑量的殺蟲劑會顯著影響昆蟲的生長發(fā)育［11-13］。例如，亞致死劑量多殺菌素導致小菜蛾種群的化蛹率和蛹質量顯著降低，生殖力顯著下降［14］;亞致死劑量氰戊菊酯導致小菜蛾的化蛹率、羽化率和蛹質量明顯降低［15］;亞致死劑量氰氟蟲腙處理小菜蛾種群后，顯著降低其化蛹率、蛹質量和羽化率，明顯延長蛹期，縮短成蟲產卵期和壽命［16］;茚蟲威LC30和LC50以及高效氯氰菊酯LC15、LC30和LC50處理組各蟲態(tài)發(fā)育歷期比對照組顯著延長，3 齡、4 齡幼蟲和蛹的重量均顯著低于對照組，茚蟲威LC30和LC50以及高效氯氰菊酯LC30和LC50處理組小菜蛾后代的總產卵期顯著短于相應對照組［17］;亞致死濃度氯蟲苯甲酰胺處理小菜蛾后，顯著延長了4 齡至化蛹的歷期、顯著降低了化蛹率、蛹重和成蟲羽化率，延長了成蟲的產卵前期［18］。本研究發(fā)現(xiàn)，唑蟲酰胺LC30和LC50處理后，可延長小菜蛾幼蟲和蛹的發(fā)育歷期，降低化蛹率和羽化率，縮短成蟲壽命，減輕小菜蛾幼蟲的體質量和蛹質量，且藥劑濃度越高幼蟲體質量和蛹質量越低，與前人報道的結果相似。由此推測，應用低劑量的唑蟲酰胺防治小菜蛾，可能會導致田間小菜蛾種群的世代重疊，對作物的為害時間延長。

本生殖研究結果表明，亞致死濃度唑蟲酰胺處理將導致小菜蛾的繁殖力下降，表現(xiàn)為產卵量及卵孵化率的降低。Kamleshk［19］報道亞致死濃度的甲胺磷和甲萘威處理小菜蛾3 齡幼蟲后，雌蟲的產卵量下降;Mahmoudvand［20］報道亞致死濃度的氟鈴脲處理小菜蛾后，其蛹質量、產卵量、凈生殖率和內稟增長率顯著降低。而Nemoto 等［21］報道用亞致死劑量的滅多威處理小菜蛾4 齡幼蟲后，其成蟲的繁殖力增強，卵的體積增大，并且卵孵化率明顯高于對照;Sotan 等［22］和Fujiwaray 等［23］報道亞致死劑量的氰戊菊酯處理小菜蛾后，使小菜蛾種群的內稟增長率提高，單雌產卵量比對照有所增加。這可能與藥劑的種類不同有關，但還需要進一步證實。

酯酶、谷胱甘肽-s-轉移酶和多功能氧化酶是昆蟲體內3 種重要的解毒酶，在昆蟲代謝藥物的過程中起著重要的作用［24］。亞致死劑量殺蟲劑處理昆蟲后，不僅影響其生長發(fā)育和繁殖，還將對害蟲體內的解毒酶產生誘導或抑制作用［25-27］。梁沛等［28-29］報道亞致死劑量阿維菌素和高效氯氰菊酯處理小菜蛾后，其谷胱甘肽-s-轉移酶比對照組分別提高了42%和70%，其羧酸酯酶活性也比對照顯著升高;尹顯慧等［30］報道敏感種群小菜蛾經亞致死劑量多殺菌素處理后，其羧酸酯酶活性在不同時間段有波動，開始時段比活力增加，隨著處理時間的延長，比活力逐漸被抑制，細胞色素P450 酶系的O-脫甲基酶活性具有明顯的抑制作用但對谷胱甘肽-s-轉移酶有明顯的誘導作用。在本研究中發(fā)現(xiàn)，唑蟲酰胺亞致死濃度LC30和LC50處理小菜蛾3 齡幼蟲后，3 種解毒酶活性均明顯低于CK 組，表明亞致死劑量唑蟲酰胺對小菜蛾幼蟲體內的酯酶、谷胱甘肽-s-轉移酶和多功能氧化酶活性有顯著的抑制作用。在藥后24 和72 h，唑蟲酰胺LC30處理組的多功能氧化酶活性均高于LC50處理組，而在藥后48 h LC30處理組多功能氧化酶活性略低于LC50處理組，說明多功能氧化酶在唑蟲酰胺的代謝中發(fā)揮了重要作用。本研究中還發(fā)現(xiàn)，在藥后24、48 和72 h 小菜蛾體內的酯酶活性表現(xiàn)出劑量效應，推測酯酶是小菜蛾對唑蟲酰胺解毒代謝的主要酶系，并且可能在小菜蛾對唑蟲酰胺的抗藥性進化過程中具有極其重要的作用。此外，唑蟲酰胺LC30處理組的GSTs 酶活性波動較大，其在藥后24 h 的GSTs 酶活性顯著高于LC50處理組，而在藥后48 和72 h 的GSTs 酶活性均顯著低于LC50處理組。這在一定程度上說明谷胱甘肽-s-轉移酶可能不是小菜蛾幼蟲代謝唑蟲酰胺的主要因素，而是小菜蛾在不同程度脅迫下采取的一種生存對策。

［1］Talekar N，Shelton A.Biology，ecology，and management of the diamondback moth［J］.Annual Review of Entomology，1993，38:275-301.

［2］張友軍，吳青君，王少麗，等.我國蔬菜重要害蟲研究現(xiàn)狀與展望［J］.植物保護，2013，39(5):38-45.

［3］胡珍娣，陳煥瑜，李振宇，等.華南小菜蛾田間種群對氯蟲苯甲酰胺已產生嚴重抗性［J］.廣東農業(yè)科學，2013，39(1):79-81.

［4］張一賓.新穎殺蟲殺螨劑:唑蟲酰胺［J］.世界農藥，2003(6):43-45.

［5］萬年峰，陳曉勤，季香云，等.當歸和蓖麻乙醇提取液對甜菜夜蛾生長發(fā)育和繁殖的亞致死效應［J］.中國生態(tài)農業(yè)學報，2013，21(9):1137-1138.

［6］楊洪，王召，金道超.氯蟲苯甲酰胺對非靶標害蟲褐飛虱實驗種群的亞致死效應［J］.應用生態(tài)學報，2013，24(2):550-552.

［7］任龍，徐希寶，張靖，等.甲氧蟲酰肼對棉鈴蟲解毒酶活力的亞致死效應研究［J］.農藥學學報，2013，15(3):274-277.

［8］劉傳秀，韓招久，李鳳良，等.應用蛙石蘿卜苗法室內繼代大量繁殖小菜蛾的研究［J］.昆蟲知識，1993，30(6):342-343.

［9］Zhao J，Li Y，Collins H，et al.Monitoring and characterization of diamondback moth(Lepidoptera:Plutellidae)resistance to spinosad［J］.Journal of Economic Entomology，2002，95(2):430-436.

［10］Bradford M.A Rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye bingding［J］.Analytical Biochemistry，1976，72:248-254.

［11］李國平，封洪強，梁雙雙，等.四種殺蟲劑亞致死劑量對中黑盲蝽發(fā)育和繁殖的影響［J］.昆蟲學報，2008，51(12):1260-1264.

［12］陳瓊，黃水金，秦文婧.氯蟲苯甲酰胺對甜菜夜蛾的亞致死效應研究［J］.江西農業(yè)大學學報，2011，33(4):414-416.

［13］王海榮，吳進才，楊帆，等.不同藥劑亞致死劑量對褐飛虱不同種群生命表參數(shù)的影響［J］.生態(tài)學報，2009，29(9):4753-4760.

［14］Yin X，Wu Q，Li X，et al.Sublethal effects of spinosad on Plutella xylostella(Lepidoptera:Plutellidae)［J］.Crop Protection，2008，27:1385-1391.

［15］Wei H，Wang J，Li H，et al.Sublethal effects of fenvalerate on the development，fecundity，and juvenile hormone esterase activity of diamondback moth，Plutella xylostella(L.)［J］.Agricultural Sciences in China，2010，9(11):1612-1622.

［16］Han W，Ren C，Yan H，et al.Sublethal effects of metaflumizone on abamectin-resistant and-susceptible strains of the diamondback moth，Plutella xylostella(Lepidoptera:Plutellidae)［J］.昆蟲學報，2012，55(6):694-702.

［17］宋亮，章金明，呂要斌.茚蟲威和高效氯氰菊酯對小菜蛾的亞致死效應［J］.昆蟲學報，2013，56(5):525-527.

［18］Guo L，Desneux N，Sonoda S，et al.Sublethal and transgenerational effects of chlorantraniliprole on biological traits of the diamondback moth，Plutella xylostella L.［J］.Crop Protection，2013，48:29-34.

［19］Kamleshk.Sublethal effects of insecticides on the diamondback moth Plutella xylostella(L.)［J］.Pesticide Science，1984，15(4):344-352.

［20］Mahmoudvand M，Abbasipour H，Garjan A S，et al.Sublethal effects of hexaflumuron on development and reproduction of the diamondback moth，Plutella xylostella(Lepidoptera:Yponomeutidae)［J］.Insect Science，2011，18(6):689-696.

［21］Nemotoh.Mechanism of resurgence of the diamondback moth，Plutella xylostella(L.)［J］.Japan Agricultural Research Quarterly，1993，27(1):27-32.

［22］Sotan，Motoyaman，F(xiàn)ujisaki K，et al.Possible amplification of insecticide hormoligosis from resistance in the diamondback，Plutella xylostella［J］.Applied Entomology and Zoology，1998，33:435-440.

［23］Fujiwaray，Takahashit，Yoshiokat，et al.Changes in egg size of the diamondback moth Plutella xylostella treated with fenvalerate at sublethal doses and viability of the eggs［J］.Applied Entomology and Zoology，2002，37:103-109.

［24］Chatonp F，Ravanel P，Meyran J C，et al.The toxicological effects and bioacumulation of fipronil in larvae of the mosquito Aedes aegypti in aqueous medium［J］.Pest Biochemistry and Physiology，2001，69(3):183-188.

［25］李曉濤，黃青春，唐振華，等.氟蟲腈對二化螟生長發(fā)育的影響及對解毒酶的誘導效應［J］.農藥學學報，2006，8(3):250-254.

［26］任學祥，王剛，左一鳴，等.噻蟲胺對桃蚜的毒力及其亞致死劑量對桃蚜解毒酶系活力的影響［J］.昆蟲學報，2011，54(3):299-305.

［27］王建軍，田大軍.甲氧蟲酰肼對斜紋夜蛾亞致死效應研究［J］.棉花學報，2009，21(3):212-217.

［28］梁沛，夏冰，石泰，等.阿維菌素和高效氯氰菊酯亞致死劑量對小菜蛾谷胱甘肽-s-轉移酶的影響［J］.中國農業(yè)大學學報，2003，8(3):65-68.

［29］夏冰，石泰，梁沛，等.殺蟲劑亞致死劑量對小菜蛾羧酸酯酶的影響［J］.農藥學學報，2002，4(1):23-27.

［30］尹顯慧，吳青君，李學鋒，等.多殺菌素亞致死濃度對小菜蛾解毒酶系活力的影響［J］.農藥學學報，2008，10(1):28-34.