尚嘯+王健+龔勝+張珂+孫海燕

摘要：以三色堇（Viola tricolor L.）葉片為材料，采用SDS法、CTAB法及改良CTAB法分別對三色堇葉片DNA進行了提取，并用瓊脂糖凝膠電泳和紫外光譜對DNA提取質(zhì)量和濃度進行檢測。結(jié)果表明，改良CTAB法提取的DNA純度最高，提取效率較高;SDS法提取的DNA含有較多的蛋白質(zhì)或糖類雜質(zhì);CTAB法雖然能夠除去蛋白質(zhì)等雜質(zhì)，但是DNA濃度低于改良CTAB法。

關(guān)鍵詞：三色堇（Viola tricolor L.）;葉片;產(chǎn)率;純度

中圖分類號：Q78 ? ? ? ?文獻標(biāo)識碼：A ? ? ? ?文章編號：0439-8114（2014）20-4999-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2014.20.063

DNA Extracting from Viola tricolor L. Leaves

SHANG Xiao， WANG Jian，GONG Sheng，ZHANG Ke，SUN Hai-yan

（Key Laboratory of Protection， Development and Μtilization of Tropical Crop Germplasm Resources of Ministry of Education/College of Horticulture and Landscape， Hainan Μniversity， Haikou ?570228，China）

Abstract： High-quality DNA sample is important for plant molecular study. DNA was extracted from Viola tricolor L. leaves with SDS， CTAB and modified CTAB. The quality and concentration of extracted DNA was detected by agarose gel electrophoresis and ultraviolet spectrum. The results showed that the purity of DNA extracted with modified CTAB method was the best. DNA extracted with SDS method contained more impurities including protein or carbohydrate. Although CTAB method removed proteins， DNA concentration was lower than that with the modified CTAB method. The modified CTAB method was an appropriate， rapid and practical way for extracting DNA from Viola tricolor L. leaves.

Key words： Viola tricolor L.; leaves; productivity;purity

三色堇（Viola tricolor L.）屬堇菜科（Violaceae）堇菜屬（Viola），又稱貓臉花、貓兒臉、鬼臉花，原產(chǎn)于歐洲，為一二年生花卉，性喜溫涼，我國各地均有栽培。三色堇品種繁多，色彩鮮艷，花期長且耐寒，有“花壇皇后”的美譽，深受人們喜愛[1]。三色堇的花色豐富多彩，有白色、黃色、粉紅色、紅色、淡紫色、紫色、杏黃色和橙色等;單朵花有純色花和復(fù)色花兩類，花瓣還常帶有條紋、花斑、花邊等。三色堇是我國重要的花壇和盆栽花卉，且市場需求量大，國內(nèi)外關(guān)于三色堇的研究主要集中于其引種栽培研究和雜交育種工作上[2]。自18世紀(jì)40年代培育出具色斑的類型以來，三色堇的育種工作也得到了發(fā)展，但是關(guān)于其分子生物學(xué)方面的研究還較少。

高質(zhì)量的DNA是進行分子生物學(xué)研究的必要前提，SDS、CTAB法及其改良方法等是常用的植物DNA提取方法[3]。三色堇葉片DNA提取方法已有報道[4]，但是總體來看，提取過程比較繁瑣，提取效率比較低，需時較長，尚不能滿足快速大量提取DNA用于分子生物學(xué)研究的要求。本研究根據(jù)前期試驗研究，以三色堇葉片為試驗材料，研究了不同方法提取三色堇總DNA的提取效果，為三色堇分子水平研究提供技術(shù)支持。

1 ?材料與方法

1.1 ?試驗材料

三色堇種植于自海南大學(xué)園藝園林基地，選用莖頂端新鮮嫩葉，立即投入液氮冷凍處理，然后放入-70 ℃冰箱待用。

1.2 ?方法

1.2.1 ?不同方法三色堇提取DNA ?取備用的三色堇嫩葉，用液氮充分研磨后分別稱取0.2 g粉末于2 mL離心管中，分別采用CTAB法、改良CTAB法、SDS法對樣品進行抽提，提取的DNA均溶解于100 μL TE中，每個方法取3個樣品做重復(fù)。

1）CTAB法：操作參考文獻[5]。

2）改良CTAB法：將液氮研磨好的嫩葉0.2 g轉(zhuǎn)移至2 mL離心管中，并加入1 mL STE緩沖液，混勻靜置5 min后5 000 r/min離心5min。棄上清后加入預(yù)熱的1 mL 2% CTAB緩沖液裂解釋放DNA，并加入15 μL的β-巰基乙醇，65 ℃水浴1 h，每隔10 min振蕩以便充分裂解，然后8 000 r/min離心10 min;取上清，加等體積氯仿/異戊醇（24∶1）進行抽提，輕微振蕩、混勻;10 ℃下10 000 r/min離心10 min，吸取上清液，重復(fù)1～3次。加入1/10體積的3 mol/L NaAc和兩倍體積無水乙醇，晾干，用無水乙醇洗滌后吹干，溶于100 μL TE中。endprint

3）SDS法：見參考文獻[6]。

1.2.2 ?DNA質(zhì)量檢測 ?取5 μL DNA樣品以1%的瓊脂糖凝膠進行電泳，同時紫外分光光度計測定A230 nm、A260 nm、A280 nm。

1.2.3 ?PCR擴增檢測 ?根據(jù)文獻[1]設(shè)計了三色堇actin基因特異性引物（正向5′-CAGTGGTCGTACAACTGGTAT-3′;反向5′-ATCCTCCAATCCAGACACTGT-3′）。以改良CTAB法提取的DNA作為模板，PCR檢測提取DNA質(zhì)量。PCR反應(yīng)體系為：DNA模板3 μL，10×PCR Buffer 5 μL，25 mmol/L MgCl2 4 μL，2.5 mmol/L dNTPs 4 μL，上、下游引物各4 μL，Taq DNA聚合酶（5 U/μL） 0.8 μL，無菌水補足至50 μL。PCR反應(yīng)程序為：95 ℃預(yù)變性5 min;95 ℃變性30 s，56 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，36個循環(huán);最后72 ℃延伸10 min。

2 ?結(jié)果與分析

2.1 ?不同提取方法提取DNA的電泳檢測

由圖1可知，CTAB法和改良CTAB法提取的DNA上樣孔中幾乎無殘留物，雜質(zhì)少，條帶清晰。CTAB法能夠?qū)⒌鞍踪|(zhì)、多糖及一些帶正電荷的雜質(zhì)去除，提取到較純的DNA。改良CTAB法提取的DNA條帶更清晰，提取的DNA質(zhì)量更高。而SDS法上樣孔中殘留雜質(zhì)較多，而且有輕微的拖尾現(xiàn)象，表明提取的DNA中含有糖類和蛋白質(zhì)，雜質(zhì)較多，且有輕微的降解。從提取時間上來看，改良CTAB法提取時間約3 h，且在沉淀DNA過程中不需要置于-20 ℃，操作比較簡單，而SDS法和CTAB法均需約5～7 h，提取步驟比較繁瑣，效率較低。

2.2 ?產(chǎn)率及純度檢測

由表1可以看出，改良CTAB法提取DNA的A260 nm/A280 nm在1.8～2.0之間，表明DNA無蛋白質(zhì)和RNA污染，DNA純度高，提取效果較好。SDS法提取DNA的A260 nm/A280 nm在1.2～1.5之間，表明DNA中有雜質(zhì)的影響，這與DNA凝膠電泳結(jié)果一致。CTAB法提取DNA的A260 nm/A280 nm大于2.0，表明有RNA殘留。同時，改良CTAB法提取DNA的A260 nm/A230 nm大于2.0，說明該法所得DNA糖類、鹽類或有機溶劑少，純度較高。同時，從表1還可以看出，改良CTAB法提取的DNA濃度明顯大于另外兩種方法，DNA產(chǎn)率較高。因此，改良CTAB法更適合于三色堇葉片DNA的提取。

2.3 ?PCR檢測結(jié)果

通過PCR擴增得到一條約1 kb明亮清晰的PCR產(chǎn)物（圖2），表明改良CTAB法提取的DNA能用于后期的PCR分子生物學(xué)試驗。

3 ?結(jié)論與討論

植物基因組DNA的提取方法很多，最常見的提取方法是CTAB法和SDS法[7，8]。SDS和CTAB都是一類去污劑，其作用是破壞細胞膜釋放DNA。這兩種方法對多數(shù)植物基因組DNA的提取均比較有效[9-11]。但對某些特定植物，或不同的器官部位，提取效果有明顯差異，有的適宜用SDS法，有的適宜用CTAB法。不同植物因其特點不同，所提取效果也有差異。余曉麗等[12]以黃刺玫的嫩葉為材料，比較了改良SDS法、CTAB法等對其基因組DNA的提取效果。結(jié)果表明，改良SDS法可有效控制材料的褐變及DNA污染，提取的DNA純度和產(chǎn)率均較高。趙喜華等[13]用SDS法提取杜鵑屬基因組DNA時，DNA沉淀為淡黃色，純度過低。SDS法可能是對多糖及次生代謝物含量較高植物的DNA提取效果不理想[14]。而本試驗中可能是三色堇含有較多的多糖及次生代謝物，用SDS法提取的DNA濃度不高，并且?guī)в蓄伾?，DNA凝膠電泳后，點樣孔很亮，可能是DNA中殘留有較多的蛋白質(zhì)及多糖等雜質(zhì)，SDS法提取步驟相對繁瑣且耗時長。

CTAB法通過改變鹽濃度選擇性地沉淀DNA，可早期去除色素、多糖類雜質(zhì)，避免DNA與其共沉淀后再難分離而得到較純的DNA[15]。但由于使用鹽濃度改變沉淀DNA會使DNA沉淀不完全，收率會較低。一般而言，CTAB法比較適用于草本植物和不含酚類或含酚類較少的植物DNA提取[16]，但在進行DNA提取時，應(yīng)當(dāng)確定植物材料和CTAB提取液的最佳比例，提高CTAB濃度不一定能提到高質(zhì)量的DNA，加入CTAB過多或過少都會影響DNA的提取效果，可能不能徹底去除蛋白質(zhì)，點樣孔雜質(zhì)較多[17，18]。三色堇葉片的酚類物質(zhì)含量較高，在磨樣過程中，葉片中的酚類物質(zhì)會釋放出來，易褐變[19]，在提取中加入β-巰基乙醇和PVP可以抑制葉片中酚類物質(zhì)的氧化[20]。使用CTAB法提取DNA時，水浴時間至少需要30 min，過短的水浴時間會造成DNA得率的下降，而過長的水浴時間，如超過90 min，則可能會引起DNA的降解，或者最終產(chǎn)物中增加其他雜質(zhì)，因此，適宜的水浴時間為45～60 min[21]。

本試驗中改良CTAB法加入了STE緩沖液，使DNA中混入雜質(zhì)的幾率大大減低，所得的DNA純度較高。且此法在沉淀DNA過程中不需要置于-20 ℃，在加入NaAc和無水乙醇后，絮狀物的DNA沉淀清晰可見。改良CTAB法步驟簡單，且能有效地去除多糖、酚類和蛋白質(zhì)等物質(zhì)，在短時間內(nèi)獲得純度高、完整性好的DNA，節(jié)省了時間，整個提取過程大約3 h，比SDS法和CTAB法的時間都有較大縮短，極大地提高了提取效率，且能夠進一步滿足分子生物學(xué)的試驗要求，是快速大量提取三色堇葉片DNA的理想方法。同時，該方法也對其他植物葉片DNA的提取提供了一定的借鑒。

在DNA提取過程中，影響提取效果的因素很多，如葉片研磨時間的長短，吸取上清液時是否吸出下層蛋白質(zhì)以及混勻振蕩程度高低等[22]。本試驗中三色堇DNA提取結(jié)果在盡量使各種因素影響程度最小的情況下進行，因此想要獲得高質(zhì)量的DNA，除了注意選擇提取方法外，還應(yīng)進行嚴(yán)格的技術(shù)操作。endprint