劉德玉+楊尚雪+黃明光+李美珍+李珣+潘天彪+黃光云+胡傳活

摘要：為了評價(jià)細(xì)管類型在不同品種公豬精液冷凍中的效果，為豬精液冷凍的實(shí)際生產(chǎn)中冷凍細(xì)管的選擇提供理論依據(jù)，試驗(yàn)將長白、大約克與杜洛克3種美系公豬（每品種7頭次）精液進(jìn)行不同細(xì)管類型（5.00、0.50、0.25 mL）的分裝冷凍，比較各種細(xì)管類型下不同品種公豬之間和同一品種公豬不同細(xì)管類型精液凍后質(zhì)量（凍后精子活力、畸形率及頂體完整率）。結(jié)果表明，①相同劑型下，除了0.25 mL細(xì)管分裝時(shí)杜洛克公豬凍后精子頂體完整率顯著（P<0.05）高于長白公豬外，3種公豬之間在3個(gè)指標(biāo)上差異均不顯著（P>0.05）;②3種公豬凍后精子活力最高的劑型均為0.50 mL細(xì)管，凍后精子畸形率及頂體完整率最好的劑型均為5.00 mL細(xì)管。總之，3種細(xì)管類型中，僅0.25 mL劑型存在品種效應(yīng)，而3個(gè)品種公豬卻存在著基本類似的劑型效應(yīng)。

關(guān)鍵詞：豬;精液;冷凍保存;劑型;品種

中圖分類號：S828 ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A ? ? ? ?文章編號：0439-8114（2014）20-4917-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2014.20.038

Effects of Package Type and Breed on the Cryopreservation of Boar Semen

LIU De-yu1，2，YANG Shang-xue3，HUANG Ming-guang1，LI Mei-zhen2，LI Xun3，PAN Tian-biao1，

HUANG Guang-yun1，HU Chuan-huo3

（1. Guangxi Institute of Animal Sciences/Guangxi Key Laboratory of Livestock Genetic Improvement， Nanning 530001， China; 2. Guangxi Work Station of Livestock & Poultry Breed Improvement， Nanning 530001， China; 3. College of Animal Science and Technology， Guangxi University， Nanning 530005， China）

Abstract： To evaluate the effects of straw type on cryopreservation of semen from various breeds of boars and provide a theorectical reference for choosing one suitable straw in production practice of frozen semen， the semens of three kinds of American-derived boar （Landrace， large Yorkshire and Duroc） were packed / frozen with three different types of straws including 5.00 mL， 0.50 mL and 0.25 mL. Each breed had seven samples of semen. The evaluation indexes were made up of the sperm motility， abnormality and acrosomal integrity after frozen among three breeds and straw types. The results showed that for the same straw type， there had no significant differences（P>0.05） among the three breeds except from the acrosomal integrity of Duroc boar at 0.25 mL package significantly higher than that of Landrace boar（P<0.05）. For three breeds， the package type with the highest sperm motility was at 0.50 mL straw. And at 5.00 ml straw， the abnormality and acrosomal integrity was the best. It is indicated that there had breed effect only in the 0.25 mL straw type and while it showed analogous package-type effect in the three breeds.

Key words： boar; semen; cryopreservation; package type; breed

早期的豬精液冷凍技術(shù)研究中，豬精液采用玻璃瓶或玻璃試管和較高濃度的甘油溶液進(jìn)行冷凍保存。后來，牛的粒狀干冰法被應(yīng)用到豬上，把甘油溶液濃度降到1%～3%，可以實(shí)行快速冷凍降溫操作[1]。隨后，豬精液冷凍技術(shù)又采用多種分裝方式，有5.00 mL大型細(xì)管、5.00 mL不同類型的塑料袋、4.00～5.00 mL鋁袋、1.70～2.00 mL扁平細(xì)管、0.50 mL中型細(xì)管以及0.25 mL微型細(xì)管，但不同的分裝方式凍后精液質(zhì)量不盡相同。目前，尚未有研究小組將常用的冷凍分裝方式在相同的條件下進(jìn)行系統(tǒng)的比較，以確定較優(yōu)的承載工具，為實(shí)際的凍精生產(chǎn)中承載工具的選擇提供有價(jià)值的理論依據(jù)?；诩?xì)管法是新近發(fā)展起來的冷凍方法，采用細(xì)管法便于保存，有助于提高精液的利用率，本試驗(yàn)試圖比較眾多的冷凍保存承載工具中細(xì)管劑型（5.00、0.50、0.25 mL）對豬精液凍后質(zhì)量的影響，從而為豬凍精的實(shí)際生產(chǎn)中細(xì)管劑型的選擇提供理論依據(jù)。

1 ?材料與方法

1.1 ?材料

1.1.1 ?試劑及樣品 ?葡萄糖由天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司提供，檸檬酸由國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司提供，三羥甲基氨基甲烷（Trishydroxymethylaminomethane， Tris）、N-乙酰半胱氨酸（N-acetylcysteine， NAC）、青霉素與鏈霉素由北京索萊寶科技有限公司提供，甘油由汕頭市西隴化工廠有限公司提供，卵黃取自南寧市富鳳農(nóng)牧有限公司生產(chǎn)的初產(chǎn)雞蛋，0.25、0.50及5.00 mL塑料細(xì)管由Minitube公司提供。

新鮮精液用手握法采自廣西科達(dá)畜禽改良有限責(zé)任公司飼養(yǎng)的健康、性欲旺盛的美系長白、大約克及杜洛克種公豬，每品種采集7頭次，收集富含精子段的精液于預(yù)溫的潔凈燒杯中，1 h內(nèi)送達(dá)實(shí)驗(yàn)室。先用8層紗布過濾，然后檢查精子活力、畸形率及密度?；盍?gt;0.7，畸形率<20%的精液繼續(xù)用于后續(xù)試驗(yàn)。

1.1.2 ?主要儀器 ?冰箱（Haier集團(tuán)）、移液槍（Eppendorf）、相差顯微鏡（Olympus）、離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）、電子恒溫水浴鍋（北京長安科學(xué)儀器廠）、程序降溫儀（IMV卡蘇公司）。

1.2 ?方法

1.2.1 ?精液冷凍-解凍程序 ?10層紗布包裹精液，置于室溫下緩慢降溫，然后與稀釋液[2]（表1）等溫混合（稀釋比為1∶2，即先加入1份稀釋液，混合均勻，室溫下平衡15 min后，再加入另1份稀釋液）。分別以0.25、0.50及5.00 mL塑料管分裝，10層以上紗布包裹，置于冰箱內(nèi)5 ℃平衡4 h。

取出塑料管，檢查平衡后活力合格待放入程序降溫儀冷凍（5～-5 ℃，3 ℃/min;-5～-42 ℃，100 ℃/min;-42 ℃～-140 ℃，30 ℃/min;最后停留2 min），完成后取出塑料管迅速投入液氮中。解凍時(shí)，從液氮中取出塑料管，迅速投入37 ℃水浴30～60 s。

1.2.2 ?精液凍后質(zhì)量評估

1）活力。從解凍后的精液抽取5 μL滴于載玻片上，加蓋玻片后在相差顯微鏡下觀察5個(gè)視野，每個(gè)視野至少200個(gè)精子。

2）畸形率及頂體完整率。參考Zou等[3]的方法染色后于相差顯微鏡下觀察，每個(gè)處理制片2張，每片至少統(tǒng)計(jì)200個(gè)精子。

1.2.3 ?試驗(yàn)設(shè)計(jì) ?試驗(yàn)按塑料管容量分5.00、0.50、0.25 mL 3個(gè)組，每個(gè)品種重復(fù)7次。

1.2.4 ?數(shù)據(jù)處理 ?所得數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，并用SPSS軟件處理，分別進(jìn)行相同劑型3種公豬之間和同種公豬不同劑型之間3個(gè)指標(biāo)的差異顯著性分析。

2 ?結(jié)果與分析

2.1 ?相同劑型下3種公豬精液凍后質(zhì)量的比較

從表2可知，除了0.25 mL細(xì)管分裝時(shí)杜洛克公豬凍后精子頂體完整率顯著（P<0.05）高于長白公豬外，相同劑型下3種公豬之間在凍后精子活力、畸形率及頂體完整率上差異均不顯著（P>0.05）。

2.2 ?同種公豬下不同劑型精液凍后質(zhì)量的比較

從表2可知，在凍后精子活力上，3種公豬均是0.50 mL劑型組最高，雖然在大約克和杜洛克公豬該劑型組與0.25 mL劑型組差異不顯著（P>0.05），但顯著高于5.00 mL劑型組（3種公豬）及0.25 mL劑型組（長白公豬）（P<0.05）。在凍后精子畸形率上，長白、杜洛克公豬5.00 mL劑型組顯著低于0.25 mL劑型組（P<0.05），該2個(gè)劑型與0.50 mL劑型組對比或大約克公豬3個(gè)劑型之間對比差異均不顯著（P>0.05），3種公豬均為5.00 mL劑型組最低。在凍后精子頂體完整率上，3種公豬均為5.00 mL劑型組最高，而且隨著劑型變小，頂體完整率有降低的趨勢。

2.3 ?公豬之間較優(yōu)劑型精液凍后質(zhì)量的比較

從表2可知，3種公豬凍后精子活力最高的劑型均為0.50 mL，凍后精子畸形率及頂體完整率最好的劑型均為5.00 mL，而且同一指標(biāo)在不同品種之間均不存在顯著差異（P>0.05）。

3 ?討論

目前，冷凍時(shí)用細(xì)管分裝牛精液已經(jīng)比較普遍[4-6]，在豬精液冷凍方面也已經(jīng)由傳統(tǒng)的塊狀或顆粒型轉(zhuǎn)為細(xì)管型[7-10]，但將常用細(xì)管的冷凍效果進(jìn)行對比的報(bào)道較少[11]。本試驗(yàn)比較了3種常用細(xì)管（5.00、0.50、0.25 mL）應(yīng)用于豬精液冷凍時(shí)的效果，其中包括精子活力、畸形率及頂體完整率等3個(gè)能體現(xiàn)凍后精子質(zhì)量的最基本指標(biāo)的對比。相同劑型下3種公豬之間精液凍后質(zhì)量的比較結(jié)果表明，除了0.25 mL細(xì)管分裝時(shí)在凍后精子頂體完整率上存在品種效應(yīng)外，3個(gè)劑型在凍后精子活力、畸形率及頂體完整率上均沒有品種效應(yīng)，其原因尚需進(jìn)一步研究分析。

同種公豬下不同劑型精液凍后質(zhì)量的比較結(jié)果表明，3種劑型中，0.50 mL細(xì)管分裝的精液凍后精子活力在3種公豬均為最高，5.00 mL細(xì)管分裝的精液凍后精子畸形率及頂體完整率均最好，提示細(xì)管的形狀對豬精液凍后質(zhì)量影響較大，可能由于凍后豬精液解凍時(shí)釋放潛伏熱受表面積/體積的影響，用較大的表面積/體積的載體分裝后冷凍，精子形態(tài)較好[1]。5.00 mL細(xì)管的長度和直徑較大，所以其承載的豬精子凍后形態(tài)較好，但用其冷凍豬精液在技術(shù)上還有一些難點(diǎn)，例如使用大直徑細(xì)管冷凍，會使冷凍速率變慢，熏蒸時(shí)間變長，管內(nèi)精液異源性更高，導(dǎo)致更高的精子損傷率，不均勻的解凍速率也將導(dǎo)致凍后精子活率降低[1]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，三種劑型承載的精液凍后精子活力從高到低是0.50、0.25和5.00 mL，這與Bwanga等[12]及Cordova等[13]的研究結(jié)果相似;而凍后精子頂體完整率的結(jié)果與2個(gè)研究小組的研究結(jié)果相反，本試驗(yàn)中，5.00 mL承載的精液凍后精子頂體完整率最高，且隨著劑型變小，頂體完整率有降低的趨勢。這可能是因?yàn)樵囼?yàn)所使用的冷凍保存稀釋液不同，而稀釋液所含成分對豬精液凍后質(zhì)量有很大的影響。其次，稀釋的方法不同，本試驗(yàn)將稀釋液分兩次加入到精液中，但是兩次添加的稀釋液中均含有甘油，研究顯示甘油對精子具有保護(hù)作用的同時(shí)也有一定的毒害作用[14，15]。再次，本試驗(yàn)所使用的指標(biāo)測定方法不同，本試驗(yàn)采用考馬斯亮藍(lán)染色后在相差顯微鏡下觀察計(jì)數(shù)，而Bwanga研究小組所使用的方法是署紅-苯胺黑染色后電鏡下觀察。最后，指標(biāo)測定人員不同可能也是影響試驗(yàn)結(jié)果的重要因素。李林林[16]研究發(fā)現(xiàn)，顆粒、0.25 mL細(xì)管、5.00 mL細(xì)管冷凍后精子活力和活率的差異不顯著，這與本試驗(yàn)的結(jié)果相同（5.00 mL與0.25 mL承載的3種公豬凍后精子活力差異均不顯著）。

Watson[17]在總結(jié)精液受精力與具備正常功能的活精子數(shù)的關(guān)系時(shí)認(rèn)為，只有正常功能的精子數(shù)達(dá)到一定臨界值時(shí)，精液的受精力才能得到保證。5.00 mL大型細(xì)管長度與直徑大，便于分裝并節(jié)約時(shí)間，且1支細(xì)管就具有1頭份的輸精劑量，方便輸精。0.25 mL小型細(xì)管和0.50 mL中型細(xì)管，1頭份的輸精劑量一般需要20～10根細(xì)管，因此不利于輸精和生產(chǎn)上普遍推廣。本試驗(yàn)研究結(jié)果顯示，5.00 mL細(xì)管凍后精子畸形率最低，頂體完整率最高，是3種劑型中更有利于凍精實(shí)際生產(chǎn)的細(xì)管。但對于5.00 mL劑型凍后精子活力較低的原因還需進(jìn)一步研究，以便加快其商業(yè)應(yīng)用的步伐。

4 ?結(jié)論

在本試驗(yàn)條件下，凍后精子活力最優(yōu)的劑型為0.50 mL細(xì)管，凍后精子畸形率及頂體完整率最優(yōu)的劑型為5.00 mL細(xì)管。

參考文獻(xiàn)：

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Watson[17]在總結(jié)精液受精力與具備正常功能的活精子數(shù)的關(guān)系時(shí)認(rèn)為，只有正常功能的精子數(shù)達(dá)到一定臨界值時(shí)，精液的受精力才能得到保證。5.00 mL大型細(xì)管長度與直徑大，便于分裝并節(jié)約時(shí)間，且1支細(xì)管就具有1頭份的輸精劑量，方便輸精。0.25 mL小型細(xì)管和0.50 mL中型細(xì)管，1頭份的輸精劑量一般需要20～10根細(xì)管，因此不利于輸精和生產(chǎn)上普遍推廣。本試驗(yàn)研究結(jié)果顯示，5.00 mL細(xì)管凍后精子畸形率最低，頂體完整率最高，是3種劑型中更有利于凍精實(shí)際生產(chǎn)的細(xì)管。但對于5.00 mL劑型凍后精子活力較低的原因還需進(jìn)一步研究，以便加快其商業(yè)應(yīng)用的步伐。

4 ?結(jié)論

在本試驗(yàn)條件下，凍后精子活力最優(yōu)的劑型為0.50 mL細(xì)管，凍后精子畸形率及頂體完整率最優(yōu)的劑型為5.00 mL細(xì)管。

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Watson[17]在總結(jié)精液受精力與具備正常功能的活精子數(shù)的關(guān)系時(shí)認(rèn)為，只有正常功能的精子數(shù)達(dá)到一定臨界值時(shí)，精液的受精力才能得到保證。5.00 mL大型細(xì)管長度與直徑大，便于分裝并節(jié)約時(shí)間，且1支細(xì)管就具有1頭份的輸精劑量，方便輸精。0.25 mL小型細(xì)管和0.50 mL中型細(xì)管，1頭份的輸精劑量一般需要20～10根細(xì)管，因此不利于輸精和生產(chǎn)上普遍推廣。本試驗(yàn)研究結(jié)果顯示，5.00 mL細(xì)管凍后精子畸形率最低，頂體完整率最高，是3種劑型中更有利于凍精實(shí)際生產(chǎn)的細(xì)管。但對于5.00 mL劑型凍后精子活力較低的原因還需進(jìn)一步研究，以便加快其商業(yè)應(yīng)用的步伐。

4 ?結(jié)論

在本試驗(yàn)條件下，凍后精子活力最優(yōu)的劑型為0.50 mL細(xì)管，凍后精子畸形率及頂體完整率最優(yōu)的劑型為5.00 mL細(xì)管。

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