朱秋菊 孫長城 王億 侯筱宇

(江蘇省腦病生物信息重點實驗室 徐州醫(yī)學院生物化學與分子生物學研究中心,江蘇徐州 221002)

GluK2受體酪氨酸磷酸化突變體的構建及其功能研究

朱秋菊 孫長城 王億 侯筱宇

(江蘇省腦病生物信息重點實驗室 徐州醫(yī)學院生物化學與分子生物學研究中心,江蘇徐州 221002)

研究表明谷氨酸過度激活其受體是缺血性腦中風腦損傷的關鍵,KA受體的GluK2亞基參與了腦缺血再灌注引起的神經細胞的死亡。然而,對于KA 受體在缺血性腦中風中的調節(jié)機制知之甚少。本室前期電生理膜片鉗研究結果表明Src激酶通過介導GluK2的酪氨酸磷酸化上調KA受體的功能。本課題擬在探索GluK2酪氨酸磷酸化的修飾方式及進一步研究酪氨酸磷酸化修飾GluK2受體功能的調節(jié)。

GluK2 酪氨酸磷酸化 Src激酶

缺血性腦損傷中，KA受體的持續(xù)激活與神經功能紊亂以及喪失具有密切關系。KA受體在中樞神經系統(tǒng)尤其是海馬區(qū)廣泛表達，是由不同亞基組成的四聚體離子型谷氨酸受體，包括GluK1，2，3;GluK4，5。其中，GluK1，2，3可形成同源功能性KA受體。GluK2基因敲除的小鼠對海人藻酸誘導的神經毒性有抵抗力[1]。我室前期研究表明腦缺血再灌注以及癲癇可以增加GluK2-PSD95-MLK3信號模塊的組裝繼而促進MLK3-JNK3信號通路的活化，最終導致神經元的凋亡[2]。然而，關于KA受體GluK2亞基功能的具體調節(jié)機制尚不清楚。

可逆磷酸化是受體功能調節(jié)的重要方式之一。越來越多的證據(jù)表明酪氨酸磷酸化參與腦缺血后NMDA受體多種功能的調節(jié)。然而，關于酪氨酸磷酸化是否參與調節(jié)Kainate受體的功能尚未見報道。在哺乳動物中樞神經系統(tǒng)中，非受體酪氨酸蛋白激酶Src激酶家族包括不同的成員：Src，F(xiàn)yn，Yes，Lck和Lyn[3]。之前的研究表明：腦缺血后，在神經系統(tǒng)大量表達的Src成員在缺血敏感區(qū)尤其是海馬區(qū)的活性顯著增強[4-7]。

本研究中采用定點突變體試劑盒獲得GluK2胞內區(qū)域的酪氨酸位點突變體(Y587/590/844F)，用電生理方法檢測不同突變體受體功能的變化。結果表明，GluK2亞基的酪氨酸磷酸化位點主要位于胞內區(qū)。

圖1 構建的不同突變體的測序結果

圖2 構建的不同突變體在HEK293細胞中的表達

圖3 磷酸化缺失型突變體顯著降低GluK2受體介導的全細胞電流,結果均表示為平均值±標準誤

1 實驗材料和方法

1.1 引物和抗體

引物由上海生工生物公司合成提供，兔多克隆抗體抗GluK2/3(06-309)購自Millipore生物公司，堿性磷酸酶AP標記的羊抗兔二抗購自Sigma生物公司。

1.2 GluK2磷酸化缺失突變體的構建

根據(jù)文章報道的GluK2受體結構[8]，細胞內側區(qū)域存在三個酪氨酸位點，分別為Y587，Y590，Y844。根據(jù)GeneBank中GluK2(GenBank：Z11548.1)的序列分別設計在Y587，Y590，Y844對應酪氨酸的附近設計一對上下游引物。以本實驗室保存的GluK2(Q型)的重組質粒為模板，利用三個位點定點突變的引物以獲得對應三個位點的突變體。Y587F上游引物序列為：

下游引物序列為：

Y590F上游引物序列為：

下游引物序列為：

Y844F上游引物序列為：

下游引物序列為：

Y587/590F上游引物序列為：

下游引物序列為：

以上述構建成功的GluK2(Q型)Y844F的重組質粒為模板，以Y587/590F雙位點突變體引物進行PCR擴增，構建GluK2磷酸化缺失型突變體Y587/590/844F重組真核表達質粒。

以Q型GluK2為模板，按照STRATAGENE 公司快速定點突變試劑盒的操作說明確定合適的實驗條件進行PCR反應和質粒轉化，按照常規(guī)的實驗方法進行質粒的篩選，小制備獲得的質粒經金斯瑞生物公司測序鑒定

1.3 免疫印跡

按Lowry法進行蛋白質含量測定。構建的質粒轉染于HEK293細胞，收取的細胞樣品分裝及處理均在4℃條件下進行。含相同蛋白量的樣品中加入等體積 4×laemmli蛋白上樣緩沖液，置沸水浴中5 min變性處理。取等量的變性蛋白質樣品(100μg)或IP處理后樣品，經SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(polyacrylamide gel electrophoresis;PAGE)分離后，以濕轉法電轉移至NC膜上。將NC膜置封閉液中室溫孵育3 h后，加入一抗工作液，4℃孵育4 h或過夜，TBST洗膜(5min×3)后，加入AP標記的二抗的工作液，室溫孵育2小時，TBST洗膜(3min×5)，水洗。使用NBT/BCIP試劑盒，在新鮮配制的AP顯色液中顯色，流水洗滌終止反應。

2 全細胞電壓鉗

電生理記錄方式采用全細胞電壓鉗模式，鉗制電壓為-60mV，細胞外液配方(mM)：NaCl 140，KCl 5，MgCl2 1，CaCl2 2，HEPES 10，glucose 10。電極內液配方為(mM)：CsCl 140，CaCl2 0.5，MgCl2 2，EGTA 5，Na2ATP 3，HEPES 10。使用Axonpatch 700B放大器進行數(shù)據(jù)測量，Digidata 1322A數(shù)據(jù)采集器進行數(shù)據(jù)采集，Clampex和Clampfit軟件進行數(shù)據(jù)分析。

3 實驗結果

3.1 成功構建GluK2(Q型)磷酸化缺失型突變體

為了研究GluK2(Q型)可能的磷酸化位點，本實驗構建了GluK2受體胞區(qū)域序列中的3個酪氨酸位點的單點突變體(Y587F，Y590F，Y844F)以及三點突變體(Triple)。序列比對結果顯示，全自動測序的結果中，GluK2 Y587F與GeneBank中GluK2序列僅在1760處堿基的差異(A→T)，其余序列完全一致。GluK2 Y590F與GeneBank中GluK2序列僅在1769處堿基的差異(A→T)，其余序列完全一致GluK2 Y844F與GeneBank中GluK2序列僅在2531處堿基的差異(A→T)，其余序列完全一致。證明所構建的GluK2(Q型)酪氨酸磷酸化缺陷型突變體Y587F、Y590F及Y844F序列均完全正確。

以上述構建成功的GluK2(Q型)Y844F的重組質粒為模板，以Y587/590F雙位點突變體引物進行PCR擴增，構建GluK2磷酸化缺失型突變體Y587/590/844F重組真核表達質粒。序列比對結果顯示， Y587/590/844F與GeneBank中GluK2序列在1760bp，1769bp和2531bp三個堿基存在差異，均為A→T。結果證明，本實驗成功構建GluK2(Q型)酪氨酸磷酸化缺陷型突變體Y587/590/844F。

3.2 構建的各種突變體在COS-7細胞中的表達

將上述構建成功的各種GluK2(Q型)胞內區(qū)域酪氨酸位點突變體的真核表達質粒進行中量制備，中制備的質粒采用PEI 轉染法進行COS-7細胞轉染。轉染24h收集細胞，制備的細胞樣品以抗GluK2的抗體進行免疫印跡檢測GluK2不同突變體的蛋白表達。結果顯示Fig.2，GluK2的各種突變體在轉染的COS-7細胞中得到很好的表達。結果表明，本實驗成功構建的各種GluK2酪氨酸磷酸化缺失型突變體可用于GluK2功能調節(jié)的進一步研究。

3.3 Y587/590/844F降低GluK2(Q)同聚型受體電流增強

為了驗證GluK2亞基的酪氨酸磷酸化與GluK2同聚型受體功能之間的關系，將三個酪氨酸位點的突變體與活化的Src激酶(aSrc)共轉染于HEK293細胞，利用全細胞電壓鉗技術，記錄HEK293細胞上GluK2同聚型受體介導的電流，進一步探索GluK2同聚型受體功能與Src激酶介導的酪氨酸磷酸化反應之間的關系。

結果顯示Fig.3，在Src激酶作用下，在Y587/590/844F轉染(8.29±1.12pA/pF，n=11)記錄到的電流密度小于野生型(wildtype，wt)組(46.95±5.91pA/pF，n=25)，差異有統(tǒng)計學意義(P〈0.05)，實驗結果表明，Src激酶介導的GluK2(Q)酪氨酸磷酸化

對其受體功能的調節(jié)主要與其胞內區(qū)域的酪氨酸位點有關。

4 討論

谷氨酸興奮毒是腦缺血引起神經元功能損傷的重要機制。腦缺血引起各種谷氨酸受體主要包括NMDA 受體和海人藻酸受體的過度激活，最終引起神經元死亡。對受體功能調節(jié)機制的研究在闡明腦缺血神經元損傷機制的研究以及腦缺血中風疾病的治療方面具有非常重要的意義。

報道稱離子通道型受體受到多種可逆共價修飾方式的調節(jié)。蛋白質的酪氨酸磷酸化是調節(jié)蛋白質功能的重要方式之一[9]，已有研究報道腦缺血再灌注過程中Src家族激酶介導了NMDA受體、AMPA受體的酪氨酸磷酸化并能上調其功能[10，11]。關于Src家族激酶介導KA受體功能的調節(jié)尚未見報道。本文中成功構建各種可能是Src介導KA受體GluK2亞基酪氨酸磷酸化位點的定點突變體，為研究Src激酶催化GluK2酪氨酸磷酸化及其對GluK2受體功能調節(jié)的具體過程提供了基礎。

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