曹雨誕,陳海鷹,張 麗,丁安偉
(南京中醫(yī)藥大學(xué),江蘇省方劑高技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江蘇南京 210046)
京大戟為大戟科植物大戟(Euphorbia pekinensisRupr.)的干燥根[1],始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》,列為下品,為中醫(yī)臨床常用的峻下逐水藥。其性寒,味苦,有毒。由于其生品毒性較大,故采用醋制法降低京大戟的毒性,緩和其瀉下作用[2]。本課題組前期實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證實(shí)京大戟的細(xì)胞毒性部位為石油醚、乙酸乙酯部位[3],但有關(guān)醋制降低京大戟毒性作用的物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機(jī)制尚缺乏明確的揭示。因此,本實(shí)驗(yàn)擬采用整體動(dòng)物模型,通過(guò)多次給予小鼠京大戟生品和醋品細(xì)胞毒性部位提取物,比較醋制前后對(duì)小鼠的肝組織形態(tài)和氧化損傷的影響,初步探討醋制降低京大戟對(duì)小鼠肝毒性的作用機(jī)制,以期為進(jìn)一步研究京大戟醋制減毒的物質(zhì)基礎(chǔ)及作用機(jī)制提供依據(jù)。
1.1 動(dòng)物 ICR小鼠70只,♀♂各半,體質(zhì)量18~22 g,購(gòu)自浙江省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,合格證號(hào):SCXK(浙)2008-0033。
1.2 藥物 京大戟飲片購(gòu)于安徽省亳州市藥材總公司,經(jīng)南京中醫(yī)藥大學(xué)樂(lè)巍副教授鑒定為大戟科植物大戟Euphor-bia pekinensisRupr.的塊根。京大戟生品:取凈京大戟飲片2 kg,打粉;京大戟醋品:取凈京大戟飲片2 kg,用米醋600 g悶潤(rùn),加水稀釋至3 000 ml,繼續(xù)悶潤(rùn),文火煮沸至醋吸凈,取出,室溫晾干,40℃減壓干燥,打粉。
將京大戟生品和醋品粗粉(過(guò)2號(hào)篩)以6倍量乙醇回流提取3次,回收乙醇提取液,得到京大戟生、醋品醇提浸膏(得率分別為13.65%和15.64%),醇提浸膏用水懸浮,懸浮物依次用石油醚、乙酸乙酯萃取,得到京大戟生、醋品石油醚部位和乙酸乙酯部位混合浸膏(得率分別為10.12%和9.01%)。臨用前,用0.5%的CMC-Na溶液和食用油(9∶1)分別配成所需濃度的藥液。
1.3 試劑 谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)測(cè)定試劑盒、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)測(cè)定試劑盒、乳酸脫氫酶(LDH)測(cè)定試劑盒、BCA蛋白測(cè)定試劑盒、超氧化物歧化酶(SOD)測(cè)試盒、微量丙二醛(MDA)測(cè)定試劑盒、微量還原型谷胱甘肽(GSH)測(cè)定試劑盒,購(gòu)自南京建成生物工程研究所。
1.4 儀器 TP1020自動(dòng)脫水機(jī)、RM2135型石蠟切片機(jī)、DM1000光學(xué)顯微鏡(均為德國(guó)LEICA公司),CS-VI型攤片烤片機(jī)(湖北孝感宏業(yè)醫(yī)用儀器有限公司),Tissue-Tek TEL組織包埋機(jī)(日本SAKURA公司),powerwave X340全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀(美國(guó)Bio-Tek公司),AY220電子分析天平(日本島津),TGL-16M高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)(長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司)。
2.1 動(dòng)物分組 小鼠按體重隨機(jī)分為7組,即空白對(duì)照組,京大戟生品細(xì)胞毒性部位高、中、低劑量組,京大戟醋品細(xì)胞毒性部位高、中、低劑量組,每組10只。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)于室溫、通風(fēng)的清潔級(jí)動(dòng)物室中,自由攝食飲水,適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d。2.2 劑量設(shè)計(jì) 按照人臨床用量的6、4、2倍,并結(jié)合本課題組前期預(yù)試結(jié)果,本實(shí)驗(yàn)京大戟生品和醋品高、中、低劑量組分別灌胃給予60、40、20 mg·g-1,空白對(duì)照組灌胃等體積的0.5%CMC-Na溶液和食用油(9∶1),每日兩次,連續(xù)灌胃6 d。
2.3 肝功能指標(biāo)測(cè)定 末次給藥后,禁食16 h,不禁水,小鼠稱(chēng)重,摘眼球取血,待血清析出后,3 500 r·min-1,10 min,分離血清,按照試劑盒說(shuō)明書(shū),進(jìn)行ALT、AST、LDH活性的測(cè)定。
2.4 肝臟氧化損傷指標(biāo)測(cè)定 稱(chēng)取0.5 g肝組織,加入預(yù)冷的0.9%生理鹽水,冰浴勻漿,制成10%肝組織勻漿,3 500 r·min-1,10 min,吸取上清,用 BCA 法測(cè)定蛋白含量,按照試劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)定SOD活性、MDA含量、GSH含量。
2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,各組定量檢測(cè)數(shù)據(jù)以±s表示,組間比較采用LSD檢驗(yàn)。
Tab 1 Effects of Euphorbia Pekinensis before and after processed with vinegar on the activities of ALT,AST,LDH on liver function and the levels of SOD,GSH and MDA in liver tissue(±s,n=10)
Tab 1 Effects of Euphorbia Pekinensis before and after processed with vinegar on the activities of ALT,AST,LDH on liver function and the levels of SOD,GSH and MDA in liver tissue(±s,n=10)
*P <0.05,**P <0.01 vs control;#P <0.05,##P <0.01 vs Crude
Group ALT/U·Pro Control 8.182 ±0.377 8.910 ±2.404 11860 ±599 0 L-1 AST/U·L-1 LDH/U·L-1 MDA/μmol·g-1Pro GSH/mg·g-1Pro SOD/U·mg-1.220 ±0.137 0.828 ±0.072 15.25 ±0.245 Crude 20 mg·g-116.16 ±1.267** 22.24 ±3.036** 15509 ±1126* 1.284 ±0.351** 0.326 ±0.064** 8.371 ±0.919**40 mg·g-120.63 ±0.743** 31.66 ±2.229** 18667 ±978** 1.612 ±0.349** 0.238 ±0.023** 4.221 ±0.858**60 mg·g-127.61 ±1.139** 45.69 ±2.438** 22456 ±851** 1.955 ±0.326** 0.194 ±0.016** 2.073 ±0.933**Vinegar 20 mg·g-111.97 ±0.911# 12.42 ±1.374# 12982 ±677# 0.635 ±0.145# 0.561 ±0.093# 11.21 ±0.608##40 mg·g-115.70 ±0.569## 20.00 ±2.489## 15053 ±1671# 0.969 ±0.305# 0.408 ±0.040## 8.037 ±1.078##60 mg·g-119.57 ±1.900## 34.44 ±1.124## 19123 ±790## 1.193 ±0.334# 0.322 ±0.014## 3.862 ±0.588##
3.1 一般情況觀察 空白對(duì)照組小鼠未見(jiàn)明顯異常,京大戟生品和醋品給藥組小鼠均表現(xiàn)出少食、少動(dòng)、精神不佳、毛發(fā)無(wú)光澤、下腹腫脹、體重降低等癥狀,并隨給藥劑量增加而癥狀加重。
3.2 京大戟醋制前后對(duì)小鼠肝功能的影響 與空白對(duì)照組比較,60、40、20 mg·g-1京大戟生品均明顯升高小鼠血清中ALT、AST、LDH活力(P<0.05),且呈一定的劑量相關(guān)性;與生品各劑量組比較,醋品各濃度組可明顯降低小鼠血清中ALT、AST、LDH活力(P<0.05),呈一定的劑量相關(guān)性,見(jiàn)Tab 1。
3.3 京大戟醋制前后對(duì)小鼠肝臟氧化損傷指標(biāo)的影響 與空白對(duì)照組比較,60、40、20 mg·g-1京大戟生品可明顯降低小鼠肝臟中SOD活性和GSH含量(P<0.01),增加小鼠肝臟中MDA含量(P<0.05),且呈一定的劑量相關(guān)性;與生品各濃度組比較,醋品各劑量組可明顯提高小鼠肝臟中SOD活性和GSH含量(P<0.01),降低小鼠肝臟中MDA含量(P<0.05),且呈一定的劑量相關(guān)性,見(jiàn)Tab 1。
中藥致肝毒性損傷時(shí),可使血中ALT、AST活性升高[4];LDH是一種糖酵解酶,廣泛存在于人體各組織器官中,LDH的釋放是細(xì)胞膜受損的敏感指標(biāo)之一[5],因此ALT、AST和LDH可作為評(píng)價(jià)肝損傷程度的指標(biāo)[6]。氧化損傷機(jī)制是引起肝損傷的主要機(jī)制[7],主要變化為丙二醛(MDA)含量升高,超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽(GSH)含量下降[8],因此MDA、SOD和GSH可作為肝毒性氧化損傷程度的指標(biāo)。
本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示,與空白對(duì)照組相比,連續(xù)6 d給予小鼠不同劑量的京大戟細(xì)胞毒性部位后,小鼠血清中ALT、AST和LDH活性明顯增高,且隨給藥劑量增加而增高,呈現(xiàn)一定的“量-毒”關(guān)系。小鼠肝臟中SOD活性明顯下降,GSH含量明顯降低,MDA含量明顯增加。該結(jié)果提示京大戟細(xì)胞毒性部位致小鼠肝損傷途徑可能與氧化損傷有關(guān)。
與京大戟生品組相比,連續(xù)6 d給予小鼠不同劑量的京大戟醋品細(xì)胞毒性部位后,肝功能損傷指標(biāo)明顯降低,氧化損傷指標(biāo)減輕,這個(gè)結(jié)果與前期的京大戟細(xì)胞毒性部位對(duì)人正常肝細(xì)胞LO2毒性研究的結(jié)果相符[3]。上述結(jié)果提示醋制可明顯降低京大戟肝毒性,其可能機(jī)制為通過(guò)降低京大戟對(duì)肝細(xì)胞膜通透性的影響及減輕氧化損傷而實(shí)現(xiàn),這為進(jìn)一步闡明京大戟醋制減毒的物質(zhì)基礎(chǔ)及作用機(jī)制提供了的一定依據(jù)。
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