蔣超 石厚霞 丁思加 趙晨

RPE細胞是神經視網膜外側的一層單層終末分化的細胞，當RPE細胞中表達的基因(RPE65、RLBP1、LRAT等 )存 在 先 天 突 變，引起RPE功能障礙時，會引起各種遺傳性視網膜變性疾病[1-2]。誘導多功能干細胞（induced pluripotent stem cell,iPS）將成為細胞移植的一個重要來源，iPS可以無限期地自我更新和分化，使得人類胚胎干細胞成為RPE細胞移植的一個重要供體來源[3-4]。然而，iPS來源的RPE細胞和所有體外培養(yǎng)的細胞一樣都面臨著共同的問題，那就是與自然的組織細胞在屬性和生化表達上存在著一定的差異。mTOR信號通路在上皮細胞的增殖和分化過程中發(fā)揮著重要調節(jié)作用。研究表明[5]，RPE細胞受到損傷時，AKT/mTOR(mammalian target of rapamycin，mTOR)細胞信號通路的激活是最早發(fā)生的分子事件。這一信號通路的激活延長了RPE細胞的壽命,但同時導致了RPE的異常增殖、發(fā)生去分化的現(xiàn)象。

人們對iPS細胞向RPE細胞分化過程中的mTOR信號調控機制知之甚少。因此，本文將建立獲得高等分化、功能高效的iPS-RPE細胞的方法，并研究iPS-RPE細胞分化過程中mTOR信號通路的調控機制，通過添加雷帕霉素處理iPSRPE細胞，找到促進iPS-RPE細胞成熟分化并使其更接近自然RPE細胞的方法和靶點，本研究將對采用細胞移植的方法治療視網膜變性疾病提供優(yōu)質供體細胞。

材料和方法

一、材料

1.細胞：iPS細胞系（由上海同濟大學范國平課題組提供），MEF細胞購自上海斯丹賽生物技術有限公司，

2.試劑：DMEM/F12培養(yǎng)基、Knockout血清替代物、非必需氨基酸、L-谷氨酰胺、β-巰基乙醇、膠原酶Ⅳ、Trizol、以及引物合成均來自Invitrogen；堿性成纖維生長因子bFGF(RD)、0.1﹪明膠 (Millipore)、Matrigel膠（BD）、化合物 CKI-7和SB-431542（sigma）、反轉錄試劑盒（TAKARA）、Q-PCR 試劑（Roche）、雷帕霉素（sigma）。

二、方法

（一）小鼠胚胎成纖維細胞（MEF）細胞培養(yǎng)

使用含10﹪胎牛血清的DMEM/F12作為MEF的培養(yǎng)基，培養(yǎng)板用0.1﹪的明膠預處理1h，鋪板生長后的MEF細胞需要在10d內使用。

（二）iPS細胞的培養(yǎng)

待iPS克隆長到一定程度后，用1 mg/ml的膠原酶Ⅳ進行消化，按1:4進行傳代，后培養(yǎng)在預先鋪好的MEF細胞上生長。

（三）體外分化擬胚體（EB）[6]

1.懸浮培養(yǎng)：iPS細胞長至密度為80﹪的時候，消化細胞克隆，用移液槍輕輕吹打貼壁的iPS，室溫靜置，吸掉上清培養(yǎng)基，得到細胞團塊（不能將團塊吹散）后，將其轉移至沒有粘附性的培養(yǎng)皿中懸浮培養(yǎng)。待細胞團塊培養(yǎng)3 d后，更換新鮮的培養(yǎng)基（不含bFGF），同時加入終濃度為5 μmol/L的CKI-7和SB-431542的小分子化合物進行誘導分化。每隔2 d換液1次，iPS細胞團塊逐步形成球狀體EB。

2.貼壁培養(yǎng)：iPS細胞懸浮培養(yǎng)7 d后，EB向RPE細胞分化：待EB生長15 d后，收集EB團塊，將其按適當?shù)拿芏蠕伆逶趍artrigel膠預處理過的培養(yǎng)皿中進行貼壁培養(yǎng)。培養(yǎng)基換成iPS分化培養(yǎng)液，隔2 d換液1次，貼壁培養(yǎng)30d后，觀察細胞形態(tài)。EB貼壁培養(yǎng)分化1個月、2個月、3個月。

（四）免疫熒光觀察iPS-RPE細胞(分化1個月)中特異性蛋白的表達情況

將iPS-RPE細胞培養(yǎng)在玻片上，用預冷的PBS沖洗5min，4﹪多聚甲醛固定10min，PBS漂洗后，0.5﹪Triton 通透15min，1﹪BSA封閉30min，漂洗后加稀釋好的一抗（RPE651:100 millipore ；ZO-11:100 invitrogen ；LRAT 1:100 santa），于4℃過夜。PBS沖洗3次，每次5min，再滴加稀釋后的對應的二抗，室溫避光孵育1h。漂洗后加染料phalloidin對細胞骨架進行染色30min，PBS沖洗3次，每次5min，再加DAPI對細胞核進行染色，室溫作用5min，漂洗后用抗淬滅劑封片，熒光顯微鏡下觀察、拍照。

（五）Q-PCR檢測不同分化時間段iPS-RPE細胞中基因表達

按TRIzol方法提取分化細胞的總RNA，取各樣本2 μg總RNA，經逆轉錄制備cDNA。以gapdh為內參，Q-PCR分析在分化的不同時間點，RPE細胞特異性基因的表達變化。各基因的擴增引物見表 1。Q-PCR 擴增反應體系為 ：10μl 2×SYBR混合物，上下游引物各 100 pmol、cDNA 1μl，ddH2O補足至20μl；PCR反應條件，95℃預變性10min，95℃變性15 s，60℃退火60 s的條件下循環(huán)30次，最后72℃延伸5min，反應于ABI7500 PCR儀上完成?；虮磉_的相對定量方法為：以gapdh基因mRNA的表達為內參，以2-??CT法分析數(shù)據(jù)，用未分化的iPS細胞作為對照。

表1 Q-PCR擴增引物、片段以及退火溫度

（六）Western Blotting檢測iPS-RPE在不同分化階段蛋白表達以及mTOR信號通路上相關蛋白的表達

收集各個分化時間點上的蛋白樣品，裂解提取細胞總蛋白，采用BCA方法進行蛋白定量。每孔上樣30 μg，10﹪SDS-PAGE膠分離，電轉移至PVDF膜上，5﹪脫脂奶粉孵育60min后，加入相應一抗4℃孵育過夜，TBST洗膜后加入相對應的二抗（均為1:5000），室溫孵育2h后洗膜，ECL顯色，拍照。

（七）雷帕霉素處理分化一個月的iPS-RPE細胞，Western Blotting檢測RPE細胞的去分化狀態(tài)是否得到改善

將分化時間為1個月的iPS-RPE細胞作為實驗組，分別加入終濃度為100 nmol/L雷帕霉素（實驗組）以及100 nmol/L DMSO(對照組)，培養(yǎng)6 d后，收集各組的蛋白樣品，Western Blotting檢測各組的iPS-RPE細胞的特異性蛋白表達，方法同前。

三、統(tǒng)計學分析方法

采用SPSS 11.0統(tǒng)計學軟件分析，Q-PCR檢測iPS-RPE細胞不同分化時間點上基因mRNA水平表達結果比較采用單因素方差分析（One-Way ANOVA），以P≤0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

一、iPS細胞克隆以及EB形成，并向RPE細胞分化的形態(tài)變化

iPS在MEF細胞上培養(yǎng)3 d后生長成為卵圓形或者圓形克隆，克隆邊界明顯（圖1a）。后懸浮培養(yǎng)7 d后，形成擬胚體EB，EB團塊出現(xiàn)黑色色素（圖1b），后將EB貼壁培養(yǎng)，使iPS誘導分化為iPS-RPE細胞（圖1c）。

二、IF檢測iPS-RPE細胞定向分化1個月時細胞內特異性蛋白的表達

本研究通過細胞免疫熒光技術，檢測了在分化1個月時，iPS-RPE細胞內RPE65、ZO-1、Lrat蛋白的表達情況，這些蛋白是RPE細胞分化到一定階段才表達出現(xiàn)的。通過熒光顯微鏡觀察，發(fā)現(xiàn)在分化1個月的iPS-RPE細胞中，RPE65、ZO-1、Lrat蛋白都有了一定量的表達，說明了細胞已經具有了RPE的特性（圖2）。

三、Q-PCR檢測iPS-RPE細胞不同分化時間點上基因mRNA水平表達情況

發(fā)現(xiàn)隨著分化時間的延長（1個月、2個月、3個月），以未分化的iPS細胞作為對照，iPS細胞特異性基因（oct4、nanog、sox2）表達顯著下降，oct4在分化1個月、2個月、3個月時的表達量分別為0.02±0.006、0.08±0.01、0.28±0.06(P=0.000) ；nanog在分化1個月、2個月、3個月時的表達量分別為 0.05±0.009(P=0.000)，0.23±0.035(P=0.000)，0.53±0.26(P=0.002)，sox2在分化 1個月、2個月、3個月時的表達量分別為0.08±0.03、0.26±0.057、0.30±0.16(P=0.000)。而 RPE 細胞的一些特異性基因RPE65在分化3個月時的表達量20.3±4.9(P=0.000)，Best1在分化3個月時的表達量為 11.78±1.57(P=0.000），表達量均顯著提高，同時RPE細胞的成熟性標記物MerTK、CK18基因隨著分化時間的延長，表達量顯著提高，MerTK在分化3個月時的表達量為15.53±1.33(P=0.000),CK18分化3個月時的表達量為9.67±1.44(P=0.000)。由此可見，iPSRPE細胞隨分化時間日趨成熟（圖3）。

圖1 光學顯微鏡下觀察iPS-RPE細胞分化過程(×400)

圖2 熒光顯微鏡下觀察ips-RPE細胞內特異性蛋白（RPE65、ZO-1以及LRAT）的表達情況((×400))

圖3 ips-RPE細胞在不同分化時間段細胞內特異性基因表達變化

四、Western Blotting檢測不同分化時間點上iPS-RPE細胞特異性蛋白的表達以及mTOR信號通路上相關蛋白表達

與iPS細胞在未分化狀態(tài)比較，RPE細胞特異性的蛋白 Lrat、BEST1、ZO-1、MerTK、MITF在分化時間為2個月、3個月時，表達量顯著提高，其中Lrat、BEST1、ZO-1蛋白是成熟RPE細胞中特異性表達的。C-MYC蛋白的表達一般與細胞的生長狀態(tài)有關，在高度分化的細胞中其表達是下降的，本實驗中，C-MYC蛋白隨分化時間的延長顯著降低（圖4）。同時，檢測mTOR信號通路上的相關蛋白磷酸化水平的變化，發(fā)現(xiàn)p-MTOR、p-P70S6、p-S6顯著降低，在分化3個月的時候，下降得最明顯（圖5），這表明在分化過程中mTOR信號通路是被抑制的。同時檢測終濃度為400 nmol/L雷帕霉素對分化1個月的iPS-RPE細胞的相關蛋白的表達的影響，實驗組與對照組比較，catenin蛋白顯著上升，而BEST1、ck18、MerTK蛋白也有提高，但沒有統(tǒng)計學意義(圖6)，表明雷帕霉素通過抑制mTOR信號通路，提高了RPE細胞分化過程中部分特異性蛋白的表達，加速了RPE細胞分化的進程。

圖4 iPS-RPE細胞在不同分化時間段細胞內特異性蛋白的表達變化

圖5 iPS-RPE細胞在不同分化時間段mTOR信號通路相關蛋白的表達變化

圖6 雷帕霉素對分化一個月的iPS-RPE細胞內特異性蛋白的表達影響

討 論

視網膜退行性疾病簡稱視網膜變性，包括遺傳性視網膜疾病和多因素視網膜變性疾病，是由于視網膜色素上皮（RPE）細胞和視網膜感光細胞變性導致視功能下降的一組疾病。iPS細胞將成為細胞移植的一個重要來源。研究表明，由iPS誘導來的RPE細胞具備原代RPE細胞的重要分子標記，此外，iPS細胞來源于患者自身，iPS-RPE細胞同患者具有相同的基因型，因而可提供個性化的治療平臺[7]。然而，iPS-RPE細胞與自然RPE細胞相比，某些重要特征標記蛋白表達嚴重降低（如RPE65、BEST1蛋白），使得iPS-RPE細胞移植來治療視網膜變性仍然存在著重要瓶頸[8-9]。

哺乳動物雷帕霉素靶蛋白[10-12]mTOR是一種絲氨酸與蘇氨酸蛋白激酶，在細胞生長、分化、增殖、遷移和存活上扮演重要角色。上皮細胞具有快速持續(xù)更新的特點，mTOR信號通路在上皮細胞的增殖和分化過程中發(fā)揮重要調節(jié)作用。筆者先前的研究表明[5]，應用雷帕霉素抑制mTOR基因在所有動物模型中顯著減緩RPE去分化過程并提高了光感受器細胞的數(shù)量及功能，抑制mTOR之后，其下游的STAT3和Mitf等轉錄因子的表達也會下降，從而暗示了mTOR通路調控RPE細胞分化的分子途徑。本研究在iPS-RPE細胞分化的不同時間點，通過Q-PCR和Western Blotting的方法檢測iPS-RPE細胞中特異性基因mRNA和蛋白水平的表達變化。筆者發(fā)現(xiàn)隨著分化時間的延長（分化3個月），RPE細胞的一些特異性基因和蛋白（BEST1、catenin、MerTK蛋白）的表達水平顯著提高。MerTK是RPE細胞吞噬功能的重要調控蛋白，BEST1是成熟RPE細胞的特異性標記，在越分化成熟的RPE細胞中，其表達量呈現(xiàn)上升趨勢[13-14]。同時檢測了各分化時間點上，mTOR信號通路相關蛋白的磷酸化水平，結果發(fā)現(xiàn)在RPE細胞分化了3個月時，p-mtor、p-p70s6、p-s6蛋白都顯著下降，這表明在分化越成熟的iPS-RPE細胞中，mTOR信號通路的活性就越低。由此可見mTOR信號通路在體外的iPS-RPE細胞分化調控過程中起著重要作用。

同時，本課題組先前通過一系列AMD的小鼠模型發(fā)現(xiàn)[5],應用雷帕霉素抑制mTOR基因在所有動物模型中,顯著減緩了RPE去分化過程并提高了光感受器細胞的數(shù)量功能。由于雷帕霉素在上述動物模型中提高了RPE65、LRAT、RLBP1等RPE重要功能蛋白的表達，而這些蛋白的突變又是許多遺傳性視網膜變性疾病的癥狀。因此筆者還應用雷帕霉素抑制iPS-RPE細胞中mTOR的通路來進行反證。結果發(fā)現(xiàn)實驗組（加 rapa）與對照組（加DMSO）比較，catenin蛋白表達量顯著提高，但是BEST1、ck18、MerTK蛋白沒有顯著性地提高。分析原因有可能是實驗中的雷帕霉素的濃度以及作用時間還有待進一步地摸索。雷帕霉素的處理極有可能加速iPS細胞向RPE細胞分化的進程，并最終提高了iPS-RPE細胞的自然屬性。

本研究建立了體外培養(yǎng)高等分化、功能高效的iPS-RPE細胞的方法，初步探索了mTOR信號通路在iPS-RPE細胞分化過程中的調控機制，為iPS-RPE細胞移植來治療視網膜變性提供了一定的科學依據(jù)。mTOR信號通路究竟是通過哪些下游分子調控體外的iPS-RPE細胞分化過程還有待進一步的探究。

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