李旭

摘要：細(xì)胞標(biāo)本取材和制片方法在病理診斷過程中占有重要位置。簡要介紹了印片法、穿刺法、沉淀法等活細(xì)胞標(biāo)本的制備方法。

關(guān)鍵詞：細(xì)胞標(biāo)本；取材；制片

中圖分類號：S854.4+3 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：B 文章編號：1007-273X（2014）09-0079-03

隨著疾病的發(fā)生、發(fā)展，病理標(biāo)本在疾病的診斷過程中越來越重要。病理標(biāo)本的檢查應(yīng)包括大體和顯微鏡下觀察兩個方面，而正確的診斷往往取決于準(zhǔn)確的顯微鏡下觀察，因此制片質(zhì)量的好壞將直接影響診斷結(jié)果的準(zhǔn)確性，甚至?xí)礤e誤的結(jié)果。一張好的切片與取材和固定都有密切的關(guān)系。對于免疫組織化學(xué)方法所需材料的取材，不僅要求組織細(xì)胞的形態(tài)完整保存，而且要最大程度的保存組織或細(xì)胞成分的抗原性。

1 印片法

印片法的優(yōu)點是簡便、快速、經(jīng)濟(jì)、準(zhǔn)確，特別是前三方面超過任何一種冰凍切片及快速石蠟切片法。它不需要特殊設(shè)備，凡病理室均可開展。特別適用于縣以下沒有冰凍切片設(shè)備和條件的病理室。印片法的速度特快，僅數(shù)分鐘即可出結(jié)果。在準(zhǔn)確性方面與一般冰凍切片相同。印片中的細(xì)胞形態(tài)比之在較厚的冰凍切片中所觀察到的細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)更為清晰可辨，細(xì)胞畸形遠(yuǎn)較冰凍切片顯著。

馮毓正等[1]曾遇到兩例乳腺硬癌，冰凍切片觀察難以與硬化性乳腺病鑒別，而是結(jié)合印片中發(fā)現(xiàn)惡性細(xì)胞才確診為硬癌。根據(jù)乳腺標(biāo)本的肉眼觀察結(jié)合印片中有無惡性細(xì)胞對某些乳腺病變也能做出初步的診斷。一般說來，印片法是一種病理診斷的輔助方法。無論石蠟切片或冰凍切片輔之以印片，互補(bǔ)短缺，對于進(jìn)一步提高病理診斷的準(zhǔn)確性均有極大的幫助。馮毓正等[1]認(rèn)為印片法不僅只是冰凍及石蠟切片的輔助診斷方法，它可以代替冰凍切片對乳腺腫塊進(jìn)行快速診斷。

鄺國乾等[2]采用印片法檢測AgNOR可結(jié)合印片細(xì)胞學(xué)檢查，使診斷鼻咽癌的敏感性、特異性、實用性等都有提高。因此，印片法優(yōu)于切片法。本方法作為診斷鼻咽癌，具有操作簡單、經(jīng)濟(jì)、實用、準(zhǔn)確、可靠、重復(fù)性好，易于普及推廣。

崔海等[3]在研究認(rèn)為使用印片法可提高外科醫(yī)師術(shù)中對胃癌漿膜浸潤或浸出情況的判斷準(zhǔn)確率，減少肉眼判斷上的誤判或漏判，而且方法簡便、快速。需要指出的是，在做印片取材時，應(yīng)小心輕柔操作，更不能用刮片的方法，以免人為引起癌細(xì)胞的擴(kuò)散轉(zhuǎn)移。

2 穿刺法

目前臨床上常用的穿刺方式有兩種：繩梯式和紐扣式穿刺方式。紐扣式穿刺方式穿刺點固定，穿刺區(qū)域小，易使血管周圍形成疤痕和動脈瘤，未穿刺的血管和組織形成塌陷，影響血流量。但是由于紐扣式穿刺方式疼痛度低，患者對于它的依從性較高。而繩梯式穿刺方式，雖然有紐扣式穿刺方式無法超越的優(yōu)越性一血管受力均勻、對血管壁的損傷小、不易引起動脈瘤的發(fā)生，但因其每次穿刺需要更換新的穿刺點、疼痛度高而往往不被患者所接受。目前，廣泛應(yīng)用的穿刺法大多數(shù)是改良過的。

2.1 改良穿刺法的臨床應(yīng)用

自體動靜脈內(nèi)瘺是終末期腎病患者進(jìn)行維持性血液透析最常用的血管通路，是患者賴以生存的“生命線”。如何選用最佳的穿刺方法，減輕透析患者反復(fù)穿刺帶來的疼痛，減少并發(fā)癥的發(fā)生，保護(hù)好動靜脈內(nèi)瘺管，延長其使用壽命，是廣大醫(yī)護(hù)人員值得研究和探討的問題。李春艷等[4]研究了針尖斜面向下的穿刺方法，對于減輕穿刺疼痛也有一定的效果。動靜脈內(nèi)瘺穿刺廣泛應(yīng)用的常規(guī)法是針尖斜面朝上進(jìn)行穿刺，沈嫻，等[5]采用改良法，即針尖斜面向右旋轉(zhuǎn)45°，同時增大進(jìn)針角度，減輕了患者穿刺時的疼痛，減少了穿點滲血次數(shù)及壓迫止血時間，效果滿意。對于患者而言，使用改良穿刺法后疼痛度減輕的效果越明顯。疼痛度一旦減輕，患者對于穿刺方式的選擇依從性大大提高，從而達(dá)到避免并發(fā)癥的發(fā)生、有效保護(hù)動靜脈內(nèi)瘺管的目的。

經(jīng)外周中心靜脈置管（PICC） 是用于為患者提供中期到長期的靜脈輸液治療而留置的中心靜脈導(dǎo)管，經(jīng)外周靜脈穿刺插管，使其末端位于上腔靜脈的下1/3處或上腔靜脈與右心房交界處的深靜脈導(dǎo)管置入術(shù)[6]。PICC在臨床應(yīng)用中仍不可避免地發(fā)生各種并發(fā)癥，其中導(dǎo)管頭端的異位不僅影響PICC的正常使用，甚至可以引起各種并發(fā)癥，嚴(yán)重時需拔除后二次置管，從而增加了患者的痛苦和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。臨床上PICC的異位多發(fā)生于頸內(nèi)靜脈、鎖骨下靜脈、腋靜脈等部位，而導(dǎo)管異位至頸內(nèi)靜脈最為常見，發(fā)生率3%～37%[7]。頸內(nèi)靜脈是頸部最粗大的靜脈，且其管腔經(jīng)常處于開放的狀態(tài)[8]，也為導(dǎo)管誤入提供了解剖上的基礎(chǔ)。傳統(tǒng)的穿刺法是讓患者抬頭，將頭靠近穿刺側(cè)的肩部。其目的是為了使鎖骨下靜脈與頸內(nèi)、外靜脈之間形成一銳角，從而阻止導(dǎo)管進(jìn)入頸靜脈[9]。傳統(tǒng)穿刺法患者在穿刺過程中因為擔(dān)心錯過配合的時間而一直處于緊張焦慮狀態(tài)；配合時患者需要抬頭，抬頭使頸部肌肉緊張，舒適度降低加重了焦慮的情緒；在配合過程中患者始終擔(dān)心自己配合的動作是否正確從而產(chǎn)生過重的心理負(fù)擔(dān)，導(dǎo)致血管痙攣造成送管困難，降低了穿刺的成功率； 由于患者采取的體位不正確，也增加了導(dǎo)管異位的發(fā)生率； 另外，傳統(tǒng)穿刺法由于需要患者的配合，對于老年、危重、體弱以及配合度差的患者也容易發(fā)生頸內(nèi)導(dǎo)管異位。運(yùn)用傳統(tǒng)穿刺法的異位發(fā)生率為17%，許劍蕾[10]為了減輕患者的痛苦，保證導(dǎo)管的順利置入，改良穿刺法全程由護(hù)士擔(dān)當(dāng)配合者，護(hù)士接受過專業(yè)醫(yī)學(xué)知識的培訓(xùn)并了解整個穿刺的過程。護(hù)士按壓鎖骨上窩近胸鎖關(guān)節(jié)處，使頸內(nèi)靜脈受壓變癟，從而避免導(dǎo)管誤入頸內(nèi)靜脈； 改良穿刺法患者不需要做任何配合動作，同時配合護(hù)士在穿刺過程中不斷地與患者交流使其處于放松狀態(tài)，降低了患者的焦慮程度，增加了舒適度，使全身肌肉和血管放松，便于導(dǎo)管的送入，增加了穿刺的成功率。改良穿刺法配合護(hù)士在按壓時可以感覺到導(dǎo)管誤入到頸內(nèi)靜脈，及時讓操作者進(jìn)行調(diào)整從而降低頸內(nèi)導(dǎo)管異位的發(fā)生率。

2.2 扣眼穿刺法研究進(jìn)展

1977年波蘭學(xué)者Twardowski首次對1例血管長度受限的患者采取固定穿刺點穿刺，并稱之為固定點穿刺法。1984年Kronung將此法用于居家透析患者并更名為扣眼穿刺法。20世紀(jì)80年代起扣眼穿刺法在歐洲非常流行，并被美國腎臟病臨床實踐指南推薦為自體內(nèi)瘺的首選穿刺方法[11]?？垩鄞┐谭ǖ奶攸c：第1步是隧道的形成，穿刺時要求每次都通過同一個皮膚穿刺點和血管穿刺點進(jìn)針。第2步，隧道形成后要改用鈍針穿刺，鈍針是指針尖及邊緣不鋒利、沒有切割作用的內(nèi)瘺穿刺針。如果沒有形成隧道，鈍針就無法到達(dá)血管腔，而隧道形成后還用銳針，則容易出現(xiàn)穿刺點出血[12]?？垩鄯ㄅc傳統(tǒng)方法相比明顯降低了血管瘤和血腫的發(fā)生率[13，14]，適用于新舊內(nèi)瘺，容易穿刺，減少護(hù)士的操作時間，且患者可以自己穿刺[15，16]。

3 沉淀法

一般情況下，腦脊液、漿膜腔液中細(xì)胞數(shù)量很少，需進(jìn)行細(xì)胞收集后才能作細(xì)胞學(xué)檢查。教科書和一些操作手冊中，往往只介紹離心沉淀法收集細(xì)胞，其優(yōu)點是操作簡便、收獲細(xì)胞多，但該法有明顯的缺陷，由于標(biāo)本中蛋白質(zhì)含量過低等因素影響，加上離心力的作用，細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)易被破壞，尤其是一些具有診斷意義的細(xì)胞如腫瘤細(xì)胞等，更易被破壞，從而影響細(xì)胞學(xué)檢查結(jié)果。

利用細(xì)胞自然沉降作用，同時使用濾紙將水分吸出，加速細(xì)胞的沉降，收集細(xì)胞于玻片上后進(jìn)行細(xì)胞學(xué)檢查。此方法不影響細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)，可作各種染色以進(jìn)行細(xì)胞學(xué)檢查。不僅粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)完整，其他細(xì)胞如間皮細(xì)胞、各種腫瘤細(xì)胞、淋巴樣細(xì)胞、單核樣細(xì)胞、室管膜細(xì)胞等也都結(jié)構(gòu)清晰，基本上與血片、骨髓片中的細(xì)胞清晰度一致。標(biāo)本不宜久置，收取標(biāo)本后應(yīng)馬上進(jìn)行收集細(xì)胞的操作，否則細(xì)胞易變形。自然干燥時間太長也會導(dǎo)致細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的改變，可用電吹風(fēng)吹干。該法缺點是操作稍費(fèi)時，消耗的標(biāo)本不能作其他項目檢查。但克服了離心沉淀法的明顯不足，能保持細(xì)胞形態(tài)、結(jié)構(gòu)的本來面目，有利于明確細(xì)胞學(xué)診斷。

將細(xì)胞沉淀法應(yīng)用于良惡性腹水鑒別，效果良好。與常規(guī)離心沉淀法相比，獲取的細(xì)胞量明顯增多，細(xì)胞形態(tài)清晰完整，可與血片及骨盈片相比擬。能辨認(rèn)惡性細(xì)胞的特征，而且所需的標(biāo)本量極少，在積液很大及腹水中細(xì)胞含量少的情況下，更具有其優(yōu)越性。

既往診斷小兒惡性血液病主要靠中樞神經(jīng)系統(tǒng)癥狀、體征、CSF三項檢查（壓力、白細(xì)胞計數(shù)、蛋白定量）及試管離心沉淀涂片找腫瘤細(xì)胞。用玻片離心沉淀法進(jìn)行CSF細(xì)胞學(xué)檢查，最初用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)白血病的檢查。后擴(kuò)大到所有惡性血液病，體會到這是一種簡便、快速、較敏感的方法，在無臨床癥狀、常規(guī)三項及試管離心沉淀細(xì)胞學(xué)都正常時就可找到腫瘤細(xì)胞。

4 活細(xì)胞標(biāo)本的制備

活細(xì)胞標(biāo)本的制備多用于科研，用于常規(guī)病理診斷的較少。標(biāo)本主要來源于建株的培養(yǎng)細(xì)胞、短期培養(yǎng)細(xì)胞和外周血等。細(xì)胞可直接培養(yǎng)在蓋玻片上，固定后即可進(jìn)行染色觀察或進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色或掃描電鏡標(biāo)本制備。也可培養(yǎng)于培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)板內(nèi)，制成細(xì)胞懸液，收集一定的細(xì)胞還可進(jìn)行涂片?？梢越?jīng)離心后進(jìn)行透射電鏡標(biāo)本制備。

5 小結(jié)

大量報道表明，病理切片已成為診斷疾病的重要手段。并且細(xì)胞標(biāo)本的取材和制備方法在病理切片診斷中起著至關(guān)重要的作用。目前，上述四種方法雖然在不同領(lǐng)域中成功應(yīng)用，但仍然有一些局限性。因此，對細(xì)胞標(biāo)本取材和制片方法的的研究還有待更進(jìn)一步深化。

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