何杰

（ 中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院淡水漁業(yè)研究中心，農(nóng)業(yè)部淡水漁業(yè)和種質(zhì)資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇無(wú)錫214081）

孫興馳，隋東海

（南京農(nóng)業(yè)大學(xué)無(wú)錫漁業(yè)學(xué)院，江蘇 無(wú)錫214081）

淡水石斑魚（Cichlasoma managuense）隸屬鱸形目（Perciformes）鱺魚科（Cichlaidae）麗體魚屬（Cichlasoma），原產(chǎn)于中美洲，屬名貴魚類，1988年引入臺(tái)灣，1996年從臺(tái)灣引入大陸，成為淡水養(yǎng)殖的一個(gè)新品種［1］。目前，淡水石斑魚在重金屬毒性試驗(yàn)［2－3］、含肉率和肌肉營(yíng)養(yǎng)成分分析［4］、血細(xì)胞發(fā)生的觀察［5］、人工繁殖［6］、養(yǎng)殖［7－8］及病害防治［9］等方面已有一些研究，但其胚胎發(fā)育尚未見報(bào)道，而且麗體魚屬中也未見有胚胎發(fā)育方面的報(bào)道，但鱺魚科中尼羅羅非魚（Oreochrimis nilotica）［10－12］、莫桑比克羅非魚（Oreochrimis mossambca）［13］、盤麗魚（Symphysodon discus ）［14］、神仙魚（Pterophyllums carale）［15］的胚胎發(fā)育均有報(bào)道。本研究探討了淡水石斑魚胚胎發(fā)育的特征，以為魚苗的繁殖培育、品種改良提供基礎(chǔ)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 親魚的來(lái)源及培育

2010年6月從福建漳州購(gòu)入一批淡水石斑魚水花，在淡水漁業(yè)研究中心宜興實(shí)驗(yàn)基地養(yǎng)殖，2012年5月從越冬池中選擇個(gè)頭較大、身體強(qiáng)壯的雌雄魚各100尾，雌雄分開在溫室內(nèi)進(jìn)行強(qiáng)化培育。

1.2 親魚的挑選及人工催產(chǎn)

在7月初，挑選腹部發(fā)白、膨大明顯、顏色較淡的雌魚和體色鮮艷、身體強(qiáng)壯的雄魚，單尾重300～400g。在溫室內(nèi)進(jìn)行人工繁殖，20：00時(shí)注射催產(chǎn)素，雌魚每千克體重注射腦垂體1.5～3mg＋HCG 800～1000IU；雄魚劑量減半。注射后的雌、雄親魚用網(wǎng)箱分開放，池內(nèi)充氣增氧，DO為8mg／L左右，水溫28℃。清晨5：00時(shí)，將4尾雌魚、6尾雄魚放入同一只網(wǎng)箱，讓其自然交配。此時(shí)，留人靜候觀察，發(fā)現(xiàn)雌魚產(chǎn)卵受精時(shí)開始計(jì)時(shí)，進(jìn)行胚胎發(fā)育觀察。淡水石斑受精卵呈粘性，成片附著在網(wǎng)箱的網(wǎng)片上，剛產(chǎn)出為白色，遇水不久變?yōu)楣鉂傻乃?。結(jié)果交配的3只網(wǎng)箱，均有產(chǎn)卵。

1.3 樣本取樣和觀察

在水面下向網(wǎng)箱內(nèi)輕折附有受精卵的網(wǎng)片時(shí)有許多卵粒脫落，用潔凈培養(yǎng)皿取得脫落卵粒，然后在Olympus生物顯微鏡下觀察胚胎發(fā)育，并連接電腦放大成像。輕輕晃動(dòng)培養(yǎng)皿，立體觀察，詳細(xì)記錄不同時(shí)間的發(fā)育特征，同時(shí)進(jìn)行顯微攝影。觀察環(huán)境水溫（25.7±0.3）℃，每2h換水1次以保持胚胎正常發(fā)育。

2 結(jié)果與分析

在水溫（25.7±0.3）℃的環(huán)境中，淡水石斑魚的胚胎發(fā)育從受精卵開始至早期魚苗，歷時(shí)達(dá)56h，其中的35個(gè)階段顯著特征詳見表1。其胚胎發(fā)育過(guò)程可劃分為8個(gè)時(shí)期：胚盤形成期、卵裂期、囊胚期、原腸胚期、神經(jīng)胚期、器官形成期、出膜期、卵黃期。

表1 淡水石斑魚胚胎發(fā)育期及其特征

2.1 胚盤形成期

淡水石斑魚受精卵為橢圓形，短軸（1.19±0.11）mm，長(zhǎng)軸（1.51±0.13）mm，半透明，卵黃囊占據(jù)絕大部分體積，可見卵黃顆粒，動(dòng)物極淺紅色（圖1－1）。受精幾分鐘后，動(dòng)物極顏色逐漸變深同時(shí)隆起形成胚盤（圖1－2），至32min后，胚盤高度不再變化并積累營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)為卵裂作好準(zhǔn)備（圖1－3）。

2.2 卵裂期

受精后41min，卵裂開始發(fā)生，僅在動(dòng)物極的胚盤正中央出現(xiàn)直線狀淡色溝，并逐漸加深，胚盤一分為二（圖1－4），然后兩側(cè)分別收縮并隆起，至1h9min時(shí)，形成2個(gè)大小均一饅頭狀細(xì)胞，完成第1次卵裂（圖1－5）；第2～4卵裂與第1次分裂方向垂直。至1h20min完成第2次分裂，形成形狀大小一致的4個(gè)分裂球進(jìn)入4細(xì)胞期（圖1－6）；分裂球的中部逐漸形成縊痕，至1h47min完成第3次分裂，形成8個(gè)形狀大小基本一致的分裂球進(jìn)入8細(xì)胞期（圖1－7）；第4次出現(xiàn)不同步分裂，有的細(xì)胞已分開，有的還連接在一起，形狀大小也產(chǎn)生差異，至2h2min完成第4次分裂進(jìn)入16細(xì)胞期（圖1－8）；至2h19min完成第5次分裂，進(jìn)入32細(xì)胞期，細(xì)胞分裂呈不規(guī)則兩層，細(xì)胞大小也不盡相同（圖1－9）；至2h48min細(xì)胞又完成第6次分裂，細(xì)胞顯著減小，進(jìn)入64細(xì)胞期（圖1－10）；細(xì)胞越分越細(xì)，位于中央部分細(xì)胞分裂較快，長(zhǎng)方形細(xì)胞團(tuán)變成半球形，至3h14min進(jìn)入多細(xì)胞期（圖1－11）；細(xì)胞分裂至3h49min時(shí)，細(xì)胞密集但仍可見單個(gè)細(xì)胞，隨后分裂細(xì)胞團(tuán)四周收縮，高度逐漸增加，進(jìn)入桑葚期（圖1－12）。

2.3 囊胚期

受精后4h55min進(jìn)入囊胚期，細(xì)胞分裂更細(xì)，難以見到單個(gè)細(xì)胞，層數(shù)不斷增加疊起，最終呈僧帽狀的高囊胚期（圖1－13）；接著僧帽狀邊沿向下鋪展，囊胚細(xì)胞向四周延伸，囊胚高度逐漸降低，至5h57min類似早期胚盤（四周與卵黃交界處有亮環(huán)而與胚盤相異），進(jìn)入平囊胚期（圖1－14）。

2.4 原腸胚期

受精后7h16min進(jìn)入原腸胚早期，囊胚細(xì)胞開始從動(dòng)物極下包植物極，可見囊胚腔和早期胚環(huán)（圖1－15），下包至1／5處時(shí)胚環(huán)顯著，囊胚腔縮?。▓D1－16）；至8h23min下包至1／2處，形成原腸胚中期，可見胚盾，胚盾始于動(dòng)物極止于胚環(huán)（圖1－17）；在繼續(xù)下包過(guò)程中，胚環(huán)形成的縊痕逐漸加深，胚盾顯著增粗并與胚環(huán)一起下移并延伸（圖1－18），至9h48min下包至2／3處，胚盾顏色開始轉(zhuǎn)淡，下包過(guò)程中卵黃囊被擠而部分凸出胚環(huán)外，進(jìn)入原腸胚后期（圖1－19）；至10h50min下包至4／5，進(jìn)入原腸胚末期，卵黃囊小部分被擠而突出形成泡狀（圖1－20）。

2.5 神經(jīng)胚期

受精卵發(fā)育至11h47min時(shí)出現(xiàn)神經(jīng)胚，胚體頭部增高，出現(xiàn)腦泡，初現(xiàn)胚體輪廓，卵黃囊即將被包完，部分卵黃凸出似脫痣狀卵黃栓（圖1－21）；發(fā)育至11h52min，胚孔即將封閉，呈火山狀，胚體頭前端有細(xì)管連接。胚體索狀，向外凸出卵膜外成脊，向內(nèi)擠壓卵黃囊成溝（圖1－22）；至13h19min，神經(jīng)胚頭端抬起，出現(xiàn)體節(jié)，黑色素開始大量出現(xiàn)，體節(jié)延伸到植物極底端（圖1－23）。

2.6 器官形成期

2.6.1 泡形成期

受精后16h23min，尾部出現(xiàn)透明小泡，介于卵膜與卵黃囊之間，體節(jié)較粗壯，視芽（視泡前身）可見（圖1－24）；至21h11min，胚體扭動(dòng)，胚尾扭轉(zhuǎn)，掙脫膜的束縛，在卵膜與卵黃囊之間露出游離空間（圖1－25），進(jìn)入尾芽期；至23h9min，胚體頭部?jī)蓚?cè)出現(xiàn)隆起形成泡狀，進(jìn)入視泡期（圖1－26）；至27h43min，視泡后出現(xiàn)較小泡狀物為聽泡，此時(shí)胚體頭前端有一小管連接，可見管內(nèi)流動(dòng)淡紅色液體（圖1－27）。至30h36min出現(xiàn)腦泡，胚體頭部初具魚苗頭部輪廓，卵黃囊上開始出現(xiàn)黑色素顆粒（圖1－28）。

2.6.2 心臟期

受精后34h29min為心臟前期，出現(xiàn)透明狀管泡狀物即心芽，胚體頭前端管狀物粗大，管內(nèi)液體流動(dòng)速度很快不易察覺，動(dòng)物極下的卵黃過(guò)分吸收具明顯缺刻（圖1－29、圖1－30），胚體頭部進(jìn)一步發(fā)育體積增大近1倍（圖1－30）；至38h37min，可見圓環(huán)形晶體輪廓（圖1－31），晶體環(huán)由不同的弧形小片組成；至38h56min為心臟中期，胚體頭前端管膨大呈囊狀，鑲嵌于卵黃囊上，可見有液體從卵黃囊四周流向胚體頭部（圖1－32，1－33）；至43h26min，胚體異常活躍有力，胚體長(zhǎng)度為此時(shí)卵徑周長(zhǎng)的3／4，在卵黃囊與卵膜之間間歇性擺動(dòng)4～5秒扭動(dòng)1次，卵黃囊被擠壓呈不同形狀（圖1－34）；至47h 39min為心臟后期，心臟跳動(dòng)有力，心率為38，胚體頭前端囊狀管液體流呈紅色（圖1－35）。

2.6.3 血液循環(huán)期

受精后48h53min進(jìn)入血液循環(huán)前期，囊狀管向卵膜一端分出4分支小管，為血液流出方向，可見小管內(nèi)有快速流動(dòng)的血液（圖1－36、1－37）；至49h58min為血液循環(huán)后期，可見囊狀管向卵黃囊一端有4支粗管，為血液流入方向，小管內(nèi)血液顏色較鮮艷，心率增加至53（圖1－38、1－39）。

2.7 孵化出膜

受精后52h24min，胚體運(yùn)動(dòng)擠壓卵黃囊，囊狀管被埋入卵黃囊內(nèi)，尾尖處卵膜首先瞬間爆裂，內(nèi)容物和卵黃苗被彈出（圖1－40）。至56h53min，為卵黃苗前期，魚苗呈彎曲狀，身體前部附著在卵黃囊上（圖1－41）；至77h46min，為卵黃苗后期，魚苗身體平直透明，游動(dòng)有力，卵黃囊顯著縮?。▓D1－42）。魚苗孵出后會(huì)擠在一起尾部朝同一方向不斷擺動(dòng)，形成微環(huán)循水體，此后進(jìn)入親魚護(hù)崽階段。

3 討論

淡水石斑魚屬分批產(chǎn)卵熱帶魚類，在繁殖季節(jié)很難判斷雌魚體內(nèi)卵子發(fā)育的成熟情況，繁殖前雌雄分開進(jìn)行強(qiáng)化培育十分必要，否則人工繁殖較難獲得成功。孵化水溫對(duì)魚苗繁殖具有重要意義，從48種魚類平均溫度和發(fā)育時(shí)間來(lái)看，平均溫度增高，發(fā)育時(shí)間縮短［16］，如冷水性魚類山女鱒（Oncorhynchus masou masou）低于4℃比8℃時(shí)的孵化時(shí)間要長(zhǎng)30d［17］，淡水石斑魚在水溫26～29℃時(shí)，48h可孵出仔魚［1］。本研究采用孵化水溫近26℃，孵化時(shí)間為56h，孵化水溫還有提升的空間。

淡水石斑魚胚胎發(fā)育從第4次分裂起，分裂相細(xì)胞排列趨向紊亂，不如泥鰍（Misgurnus anguillicaudatus）［18］、胭脂魚（Myxocyprinus asiaticus）［16］等魚類分裂細(xì)胞排裂整齊。受精卵外觀和發(fā)育與同科的盤麗魚胚胎發(fā)育較為近似［14］，與同科的羅非魚相比，后者受精卵為卵圓形，動(dòng)物極較尖，淡黃色不會(huì)遇水變得透明，發(fā)育過(guò)程中的血管系統(tǒng)也不如淡水石斑魚發(fā)達(dá)［10－12］。

淡水石斑魚胚胎發(fā)育形成了較為復(fù)雜的胚胎血液環(huán)循系統(tǒng)，其卵黃囊較軟，胚環(huán)的下移和胚體的活動(dòng)都能輕易改變其形狀，這些特征與運(yùn)動(dòng)相關(guān)因此需氧量也相對(duì)較高，所以淡水石斑魚胚胎發(fā)育耗氧較高，所以有親魚護(hù)卵習(xí)性，用鰭扇動(dòng)水流，從而增加氧氣，否則受精卵會(huì)發(fā)白，不久即死亡。

在心臟形成中、后期，胚體頭部端管膨大成囊狀，內(nèi)部流動(dòng)著無(wú)色液體也轉(zhuǎn)化為淡血色至鮮紅色，囊狀物類似心臟，但無(wú)搏動(dòng)現(xiàn)象，末起到心臟搏動(dòng)提供動(dòng)力作用，后來(lái)其發(fā)育去向不明，其原因還需要做進(jìn)一步研究。同時(shí)在心臟中、后期和出膜前期，胚體也異?；钴S，對(duì)環(huán)境條件的變化也比較敏感，通過(guò)觀察發(fā)現(xiàn)，此階段如從25.7℃降至18℃，出膜后的魚苗出現(xiàn)水泡胸，不久死亡。幼苗破膜而出同時(shí)伴有大量的廢物質(zhì)釋放，水質(zhì)易惡化，所以在受精卵在出膜階段，適宜的水溫和豐富的溶氧有利于幼苗成活和正常發(fā)育。

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