陳 敏，陳 鵬，葉 輝，季清娥，黎劍平

(1.云南大學(xué)跨境生態(tài)與生態(tài)安全實驗室，昆明 650091;2.云南省林業(yè)科學(xué)院，昆明 650201;3.西南林業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，昆明 650224;4.福建農(nóng)林大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，福州 350002;5.西南林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，昆明 650224)

桔小實蠅Bactrocera dorsalis (Hendel)，隸屬雙翅目 Diptera、實蠅科 Tephritidae、果實蠅屬Bactrocera。桔小實蠅寄主廣泛，可危害40 余科植物的300 余種瓜果;繁殖能力強(qiáng)，每雌產(chǎn)卵最高可達(dá)上千枚;危害嚴(yán)重，可取食芒果、柑桔等具有重要經(jīng)濟(jì)價值的熱帶亞熱帶瓜果，在防控不當(dāng)情況下可導(dǎo)致大量減產(chǎn)，造成重大經(jīng)濟(jì)損失(Smith，1989;李紅旭和葉輝，2000;Clarke et al.，2005;黃素青和韓日疇，2005)。一直以來，桔小實蠅被世界各國作為主要瓜果害蟲或列為重要檢疫蟲害(張潤杰和侯柏華，2005)

桔小實蠅繁殖生物學(xué)是開展桔小實蠅監(jiān)測防控的知識基礎(chǔ)，是闡釋桔小實蠅繁殖行為的主要依據(jù)。桔小實蠅雌成蟲行為及相關(guān)繁殖活動受卵巢發(fā)育進(jìn)度調(diào)控，在卵巢發(fā)育成熟前主要表現(xiàn)為搜尋食物和補充營養(yǎng)，卵巢成熟后轉(zhuǎn)入搜尋繁殖寄主，進(jìn)行產(chǎn)卵繁殖(Siderhurst and Jang，2006;2010)。卵巢發(fā)育狀況決定了桔小實蠅以取食為主抑或產(chǎn)卵為主的行為特征(Avarre et al.，2007)。

實蠅類昆蟲的卵巢發(fā)育進(jìn)度可以通過卵巢的形態(tài)結(jié)構(gòu)特征加以反映，卵巢形態(tài)特征也由此被作為直觀判別卵巢發(fā)育進(jìn)度的客觀依據(jù)(Kendra et al.，2006)。作為桔小實蠅繁殖生物學(xué)研究的一部分，本研究將揭示桔小實蠅卵巢形態(tài)結(jié)構(gòu)及其發(fā)育特征，闡釋桔小實蠅卵巢發(fā)育與其形態(tài)結(jié)構(gòu)聯(lián)動變化的內(nèi)在關(guān)聯(lián)，并從桔小實蠅預(yù)測監(jiān)控出發(fā)，探索對桔小實蠅卵巢發(fā)育進(jìn)程加以特征分級。本研究將為認(rèn)識桔小實蠅卵巢形態(tài)結(jié)構(gòu)及其發(fā)育特征提供了新的知識，為利用桔小實蠅卵巢特征開展桔小實蠅高效監(jiān)測預(yù)報防控提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試蟲源

本研究在云南大學(xué)跨境生態(tài)與生態(tài)安全實驗室進(jìn)行。供試桔小實蠅源于福建農(nóng)林大學(xué)益蟲研究所，在本實驗室已經(jīng)兩代繁殖。

1.2 試蟲飼養(yǎng)

飼養(yǎng)桔小實蠅的培養(yǎng)箱為LRH-250-GS(廣東省醫(yī)療器械廠和廣東省環(huán)保儀器廠合作生產(chǎn))，實驗條件設(shè)置為26℃溫度，L ∶D=12 h∶12 h光照時間，60%相對濕度。供試用桔小實蠅雌成蟲均為同日羽化，放入培養(yǎng)箱中養(yǎng)蟲籠(35 cm× 30 cm× 30 cm)內(nèi)，飼以糖水(1 ∶3)和酵母液(1 ∶3)。糖水和酵母液浸于棉球中，置于養(yǎng)蟲籠中培養(yǎng)皿內(nèi)，每隔12 小時更換一次。桔小實蠅產(chǎn)卵期間，在養(yǎng)蟲籠放置帶皮香蕉供桔小實蠅產(chǎn)卵。

1.3 卵巢觀察

從雌性成蟲羽化之日起，逐日取雌成蟲20 頭進(jìn)行卵巢解剖，觀察記錄卵巢形態(tài)特征及發(fā)育進(jìn)度。卵巢解剖在體視顯微鏡(PXS-2040)下進(jìn)行。卵巢解剖步驟是，先在潔凈載玻片凹處滴一滴Ringer's 生理鹽水，用解剖剪取下桔小實蠅腹部置載玻片凹處，用解剖針去除腹部背板和腹板，用鑷子取出桔小實蠅卵巢，剔除卵巢周圍的脂肪等，用Ringer's 生理鹽水清洗卵巢1-2 次。利用AUTO-MO1VFAGE 景深共聚焦重構(gòu)分析系統(tǒng)獲取卵巢形態(tài)特征照片，記錄卵巢長寬、卵巢小管長寬和數(shù)量、卵粒長寬和數(shù)目等相關(guān)參數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 桔小實蠅雌性生殖系統(tǒng)結(jié)構(gòu)

桔小實蠅的雌性生殖器官主要由卵巢、輸卵管及附腺和受精囊等組成(圖1)。卵巢有兩組，每組卵巢包裹于透明卵巢膜內(nèi)，整體上形似橢圓狀，羽化初期為淡黃色，后期呈乳白色。每組卵巢含28個卵巢管。在發(fā)育成熟的卵巢管中，其端部可見無色的卵原細(xì)胞，及經(jīng)過分裂后產(chǎn)生的卵母細(xì)胞和營養(yǎng)細(xì)胞，在卵巢管基部常見一枚成熟卵。卵巢基部與側(cè)輸卵管相接，兩側(cè)輸卵管再與中輸卵管匯合(圖1)。受精囊呈圓球狀，通過細(xì)長的受精囊管與中輸卵管連結(jié)(圖1)。雌性生殖器官含附腺1 對，為無色透明囊狀，基部與中輸卵管相連(圖1)。

2.2 卵巢發(fā)育特征

逐日觀察發(fā)現(xiàn)，卵巢在雌成蟲羽化第1 d 較小，呈淡黃色球狀，隨時間推移逐漸增大，至第7 d增大明顯，呈乳白色橢圓狀，羽化第10 d 左右卵巢體積達(dá)到最大，約為1.78 mm×1.50 mm。進(jìn)入產(chǎn)卵末期，卵巢開始逐漸變小，最小時約為0.94 mm×0.85 mm。

圖1 桔小實蠅雌性生殖器官示意Fig.1 Ovaries of Bactrocera dorsalis female

新羽化雌成蟲卵巢內(nèi)似絮狀物，無卵巢管，第4 d 后可見少量卵巢管，呈乳白色。卵巢管分化發(fā)育從兩組卵巢相向一側(cè)開始，隨時間推移卵巢管逐漸增多，在羽化后第10 d 卵巢內(nèi)各卵巢管全部發(fā)育成熟，每組卵巢內(nèi)卵巢管數(shù)量為28 根。

隨卵巢發(fā)育進(jìn)程，各卵巢管也逐漸增長，成熟卵巢管長度約為1.50 mm，直徑約為0.20 mm。進(jìn)入產(chǎn)卵末期，卵巢管數(shù)量逐漸減少，長度逐漸縮短。在產(chǎn)卵末期，卵巢管漸次消解，卵巢相應(yīng)萎縮。

雌成蟲羽化后第4 d，先期形成的卵巢管內(nèi)可見卵粒，其呈乳白色。觀察發(fā)現(xiàn)，卵的發(fā)育與卵巢管的發(fā)育大體同步，卵母細(xì)胞和漸成熟卵粒隨卵巢管發(fā)育而逐漸顯現(xiàn)。卵巢管發(fā)育成熟后，其內(nèi)均具有一枚發(fā)育近成熟的卵。觀察還發(fā)現(xiàn)，后期形成的卵巢管較先期形成的卵巢管在發(fā)育進(jìn)程上要快得多。羽化第10 d 后，各卵巢管內(nèi)均可見1枚近成熟卵和2-3 枚待成熟卵，卵巢內(nèi)總計可有56 枚近成熟卵。卵巢管內(nèi)卵粒大小為1.05 mm×0.20 mm。桔小實蠅開始產(chǎn)卵時，卵巢內(nèi)所有卵巢管均基本發(fā)育成熟。

2.3 卵巢分級

卵巢分級是根據(jù)卵巢發(fā)育進(jìn)度基于卵巢形態(tài)特征對卵巢發(fā)育進(jìn)行的一種劃分方式，以便掌握和辨識卵巢發(fā)育進(jìn)度，并根據(jù)卵巢發(fā)育進(jìn)度開展相關(guān)科學(xué)研究和實蠅種群預(yù)測 (李汝鐸等，1987)。根據(jù)桔小實蠅卵巢發(fā)育過程中卵巢的形狀、大小、顏色、卵巢小管的形成、卵粒的有無等特征，本研究將卵巢發(fā)育階段分為5 級，即發(fā)育初期(Ⅰ級)、卵黃沉積期(Ⅱ級)、成熟待產(chǎn)期(Ⅲ級)、產(chǎn)卵盛期(Ⅳ級)和產(chǎn)卵末期(Ⅴ級)。

Ⅰ級定為卵巢發(fā)育初期，主要特征是卵巢體積大小為0.53 mm×0.51 mm 左右，卵巢內(nèi)呈乳白色絮狀，卵巢表面附著大量白色端絲。卵巢管未分化。

Ⅱ級為卵黃沉積期，在該時期卵巢體積明顯增大，略為1.26 mm×1.11mm 左右，呈淡黃色半透明狀。卵巢管開始分化，每組卵巢內(nèi)可見4-6根卵巢管，其呈淡黃色或轉(zhuǎn)為乳白色，長度約1.24 mm 。卵巢內(nèi)可見4-6 枚乳白色近成熟卵粒。

Ⅲ級為成熟待產(chǎn)期，識別特征是卵巢體積達(dá)到最大，為1.78 mm×1.50 mm 左右，呈乳白色橢圓球狀;卵室內(nèi)充滿乳白色近成熟卵粒，排列整齊。

Ⅳ級為產(chǎn)卵盛期，主要表現(xiàn)為卵巢體積較小，大小1.46 mm×1.04 mm 左右，呈乳白色橢球狀;卵巢內(nèi)可見8-10 粒乳白色成熟卵粒。

Ⅴ級為產(chǎn)卵末期，主要特征是卵巢體積小，大小0.94 mm×0.85 mm 左右，呈淡黃色球狀;卵巢表面附著大量白色端絲;卵巢管消失;卵巢內(nèi)已無白色卵粒。

3 結(jié)論與討論

卵巢是實蠅產(chǎn)卵繁殖的重要器官，本研究結(jié)果表明:桔小實蠅卵巢由兩組卵巢管組成，每組卵巢含卵巢管28 根。新羽化桔小實蠅卵巢處于發(fā)育初期，無卵巢管。羽化后第4 d，卵巢管開始顯現(xiàn)，卵巢管數(shù)量增加，至第10 d 左右，卵巢發(fā)育成熟。進(jìn)入產(chǎn)卵末期，卵巢管逐漸消解，卵巢變小萎縮。桔小實蠅卵巢發(fā)育進(jìn)程分為5個發(fā)育等級，即發(fā)育初期(Ⅰ級)、卵黃沉積期(Ⅱ級)、成熟待產(chǎn)期(Ⅲ級)、產(chǎn)卵盛期(Ⅳ級)和產(chǎn)卵末期(Ⅴ級)。

在實蠅的繁殖生物學(xué)研究中，卵巢管的結(jié)構(gòu)及數(shù)量與實蠅的繁殖行為及繁殖力密切關(guān)聯(lián)(Wayne et al.，1997)。桔小實蠅繁殖能力強(qiáng)、產(chǎn)卵量大，每雌平均產(chǎn)卵1200-1500 枚，最高可產(chǎn)卵1800 枚 (Ye，2001;謝琦和張潤杰，2005)。本研究揭示，桔小實蠅卵巢分為兩組，每組卵巢含卵巢管28個(圖1)。在桔小實蠅性發(fā)育成熟期，同一卵巢管內(nèi)可見有1 枚成熟及2-3 枚待成熟卵。從卵巢管結(jié)構(gòu)和數(shù)量推論，桔小實蠅在正常情況下可一次性產(chǎn)卵56 枚以上，一生產(chǎn)卵至少可達(dá)224 枚。如果桔小實蠅每雌可產(chǎn)卵1000 余枚，則每卵巢管平均可孕育近20 枚卵。新羽化桔小實蠅需取食發(fā)育直到性成熟后才開始產(chǎn)卵繁殖(Siderhurst and Jang，2010)。本研究基于卵巢器官解剖觀察發(fā)現(xiàn)，新羽化桔小實蠅卵巢僅為一雛形，需10 d 左右才發(fā)育成熟。在此期間，卵巢發(fā)育經(jīng)歷了卵巢管形成、卵母細(xì)胞和營養(yǎng)細(xì)胞發(fā)育、卵形成發(fā)育和成熟等過程。此外，隨桔小實蠅產(chǎn)卵結(jié)束，卵巢管將隨之消解，卵巢也逐漸萎縮(圖2)。本研究從組織發(fā)生學(xué)上，闡釋了桔小實蠅卵巢生長發(fā)育的主要特征和基本規(guī)律，揭示了新羽化桔小實蠅在產(chǎn)卵前期表現(xiàn)出積極食物搜尋行為的內(nèi)在原因(圖2)。

圖2 桔小實蠅卵巢發(fā)育分級圖Fig.2 Stages of ovarian development in Bactrocera dorsalis female

桔小實蠅卵巢管分化及發(fā)育進(jìn)度因其所在卵巢中的位置而異。同時，在卵巢管的形成過程中，卵的發(fā)育也隨之進(jìn)行(圖2)。該現(xiàn)象在其它昆蟲中也有發(fā)現(xiàn)(葉輝，1996)。研究還發(fā)現(xiàn)，分化晚的卵巢管在發(fā)育進(jìn)度上較分化早的要快，同時，盡管先期分化發(fā)育的卵巢管及所孕育的卵看似已經(jīng)發(fā)育成熟，但桔小實蠅仍僅在所有卵巢管發(fā)育成熟后才開始產(chǎn)卵。桔小實蠅卵巢及卵發(fā)育的這一特征在過去文獻(xiàn)報道中尚不多見，它解釋了桔小實蠅集團(tuán)產(chǎn)卵的物質(zhì)基礎(chǔ)(袁盛勇等，2003)，但其適應(yīng)性進(jìn)化的邏輯基礎(chǔ)及內(nèi)在的調(diào)控機(jī)制仍不清楚。

實蠅性成熟進(jìn)度因溫度不同而表現(xiàn)出明顯差異(Liu and Ye，2009;余麗萍和徐南昌，2012)。番石榴實蠅產(chǎn)卵前期在24℃溫度下為38.75 d，在30℃溫度下為23.25 d，在33℃溫度下為20.50 d(Liu and Ye，2009)。瓜實蠅在20℃溫度產(chǎn)卵前期下為36.43 d，在25℃溫度下為23.06 d，在30℃溫度下則為15.90 d (韋淑丹等，2011)。桔小實蠅在12℃溫度產(chǎn)卵前期為48 d，在22℃溫度產(chǎn)卵前期為18d，在28℃溫度下為10 d (余麗萍和徐南昌，2012)。本研究中，桔小實蠅在26℃溫度下的產(chǎn)卵前期為10 d。上述說明，隨環(huán)境溫度變化，桔小實蠅卵巢發(fā)育進(jìn)度將隨之發(fā)生相應(yīng)改變。

實蠅性成熟期還與其所獲得的營養(yǎng)有關(guān)。蛋白質(zhì)是影響實蠅生殖系統(tǒng)發(fā)育的重要營養(yǎng)源，糖是維持生命基本活動的重要營養(yǎng)源 (王波等，2012)。Carey et al.(1998)認(rèn)為，實蠅取食蛋白更容易釋放荷爾蒙有助于提高交配成功率，當(dāng)實蠅由取食糖向取食蛋白轉(zhuǎn)變時，其行為則由覓食為主轉(zhuǎn)到以產(chǎn)卵為主。王波等(2012)報道，桔小實蠅在僅飼以糖的情況下，性發(fā)育受阻，不能正常產(chǎn)卵。在本實驗26℃溫度下飼以糖水和酵母液，新羽化桔小實蠅經(jīng)10 d 可達(dá)到性成熟。

本研究基于卵巢形態(tài)學(xué)特征對桔小實蠅卵巢發(fā)育進(jìn)度進(jìn)行了分級，旨在從卵巢形態(tài)特征上反映卵巢的發(fā)育進(jìn)度，為桔小實蠅科學(xué)防控提供依據(jù)。通常類似的分級往往分為4 級(Chou et al.，2012)。本研究觀察表明，桔小實蠅在產(chǎn)卵結(jié)束之后仍能存活一段時間，其卵巢顯著萎縮，故將其列為第5 級，以便完整反映卵巢從最初形成到最終萎縮的全過程。

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