董凡，孫萬邦，劉學(xué)東（.珠海健帆生物科技股份有限公司，廣東 珠海 59000；.遵義醫(yī)學(xué)院，貴州 遵義 563003）

國(guó)外學(xué)者早在1979年前就開始研究使用小牛胸腺DNA作為配基制備免疫吸附劑[1-7]，國(guó)內(nèi)學(xué)者在1985年使用小牛胸腺DNA作為配基制備免疫吸附劑研究取得了突破性進(jìn)展[8-15]，南開大學(xué)在大量國(guó)外研究的基礎(chǔ)上自主創(chuàng)新，成功研制出DNA免疫吸附柱，實(shí)現(xiàn)了高科技產(chǎn)品產(chǎn)業(yè)化的轉(zhuǎn)變，并于20世紀(jì)80年代獲得國(guó)家批文，1988年進(jìn)入臨床使用，顯示其是一種療效高、血液相容性良好、治療難治性免疫疾病的新方法[16-24]。其中最重要的功能基團(tuán)小牛胸腺DNA，作為核酸分子屬于低免疫原性的大分子物質(zhì)，針對(duì)該物質(zhì)的免疫原性研究國(guó)內(nèi)鮮見報(bào)道，其作為血液灌流產(chǎn)品在臨床應(yīng)用時(shí)是否會(huì)產(chǎn)生免疫原性至今尚未見報(bào)道。本研究針對(duì)該產(chǎn)品的使用方式采用常用的免疫原性研究方法[25-30]，初步探討DNA免疫吸附柱配基的免疫原性。

1 材料與方法

1.1 供試品的制備

健帆伊美諾免疫吸附柱（由珠海健帆生物科技股份有限公司生產(chǎn)），按照以下方法制備受試液：① 根據(jù)產(chǎn)品配載量（0.3～0.5 mg/L樹脂）計(jì)算一個(gè)柱體中配載的DNA量約為100 mg，按正常成人體重60 kg計(jì)算，相當(dāng)于1.67 mg/kg，按照《醫(yī)用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)》[27]人與動(dòng)物之間藥物劑量的換算方法，得出每只兔的總用量約為8 mg，按照免疫程序分4次皮下注射1 mg/L，每次注射2 ml。1 mg/ml DNA溶液配制成100 ml，滅菌瓶分裝4份密封低溫保存，作為DNA高劑量組注射用液。② 考慮產(chǎn)品在臨床使用過程中可能脫落的DNA有機(jī)會(huì)進(jìn)入人體是在體外循環(huán)灌流治療的2小時(shí)內(nèi)，同時(shí)考慮人與動(dòng)物間藥物劑量的換算方法和兔皮下注射的容積要求，將存放最長(zhǎng)效期的產(chǎn)品按臨床應(yīng)用程序預(yù)沖后，以治療時(shí)流速200 ml/min，用200 ml生理鹽水循環(huán)沖洗2小時(shí)后回收液體，按照動(dòng)物與人的等效劑量換算方法，得出每只兔的總用量約為14 ml，按照免疫程序分4次注射，每次約3 ml。回收的液體用滅菌瓶分裝4份密封低溫保存。用于DNA低劑量組和DNA低劑量加佐劑組注射用。③ 生理鹽水作為對(duì)照組注射用液。

1.2 主要試劑

兔用抗雙鏈DNA抗體檢測(cè)試劑盒；四甲基偶氮唑鹽（MTT）細(xì)胞培養(yǎng)液及細(xì)胞培養(yǎng)板。

1.3 免疫原分組及處理

選擇健康兔24只，體重2.0～2.5 kg，雌雄不限，按隨機(jī)數(shù)字表法分為4組，每組6只。各組每次每只兔注射劑量：① 高劑量組2 ml DNA溶液。② 低劑量組3 ml DNA溶液。③ 低劑量加佐劑組3 ml生理鹽水與3 ml佐劑混合乳化。④ 空白對(duì)照組4 ml生理鹽水。4組均選擇兔頸后及兩側(cè)后肢大腿外側(cè)3個(gè)部位多點(diǎn)注射；共注射4次，每次間隔1周。

本實(shí)驗(yàn)中動(dòng)物處置方法符合動(dòng)物倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)。

1.4 檢測(cè)指標(biāo)及方法

① 于末次注射后7天由心臟取血或頸動(dòng)脈放血采血，用雙向瓊脂擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)及酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）檢測(cè)血清抗體效價(jià)，操作按試劑盒說明書進(jìn)行。② 取DNA實(shí)驗(yàn)組和正常對(duì)照組兔肝、腎組織，行蘇木素-伊紅（HE）染色，光鏡下觀察組織病理學(xué)變化。③ 取脾臟，分離淋巴細(xì)胞。以雙鏈DNA為實(shí)驗(yàn)組，非特異性免疫刺激劑刀豆蛋白（ConA）作為陽性對(duì)照組，以細(xì)胞培養(yǎng)液作為陰性對(duì)照組，與免疫兔外周血淋巴細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)，用MTT法觀察脾淋巴細(xì)胞增殖情況，在波長(zhǎng)450 nm處檢測(cè)其吸光度（A）值。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用F檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 血清抗體效價(jià)檢測(cè)

ELISA檢測(cè)結(jié)果顯示，雙鏈DNA無免疫原性，不能刺激兔產(chǎn)生相應(yīng)抗體（F=1.183，P=0.341；圖1）。雙向瓊脂擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，雙鏈DNA不能刺激兔免疫系統(tǒng)產(chǎn)生相應(yīng)抗體（圖2）。

圖1 ELISA檢測(cè)血清抗體效價(jià)

圖2 雙向瓊脂擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)檢測(cè)血清抗體效價(jià)

2.2 MTT法檢測(cè)脾臟淋巴細(xì)胞增殖數(shù)（表1）

陽性對(duì)照組脾臟淋巴細(xì)胞增殖數(shù)較陰性對(duì)照組顯著增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），DNA實(shí)驗(yàn)組與陰性對(duì)照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。3組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=1.183，P=0.336），表明雙鏈DNA不能刺激兔淋巴細(xì)胞發(fā)生增殖。

表1 MTT法檢測(cè)脾臟淋巴細(xì)胞增殖數(shù)（±s）

表1 MTT法檢測(cè)脾臟淋巴細(xì)胞增殖數(shù)（±s）

注：與陰性對(duì)照組比較，aP＜0.01

組別 樣本數(shù) 淋巴細(xì)胞增殖數(shù)（A值）陰性對(duì)照組 30 0.241±0.040陽性對(duì)照組 30 0.850±0.070 a DNA實(shí)驗(yàn)組 30 0.576±0.078

2.3 免疫兔肝、腎組織病理學(xué)觀察

2.3.1 正常對(duì)照組

肝小葉結(jié)構(gòu)尚存，肝細(xì)胞有輕度水腫，胞質(zhì)疏松，肝竇狹窄，間質(zhì)血管充血。腎臟結(jié)構(gòu)正常，腎小球毛細(xì)血管擴(kuò)張，球內(nèi)可見較多紅細(xì)胞。

2.3.2 DNA試驗(yàn)組

肝小葉結(jié)構(gòu)清晰可見，肝細(xì)胞索和肝竇易區(qū)分，結(jié)構(gòu)正常（圖3a），肝匯管區(qū)見淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)（圖3b），肝細(xì)胞輕到中度濁腫（圖3c），肝匯管區(qū)見淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)（圖3d）。腎小球充血，腎小管正常（圖 3e～3f）。

3 討 論

針對(duì)配基DNA的免疫原性研究是基于對(duì)DNA免疫吸附柱的臨床使用安全性角度出發(fā)，該產(chǎn)品的工作原理是靠抗原抗體結(jié)合來清除DNA抗體，同時(shí)載體（碳化樹脂）的非特異性吸附能力對(duì)體內(nèi)的一些大分子物質(zhì)也可清除。理論上DNA這類核酸分子屬于無免疫原性物質(zhì)，但因其來源于小牛胸腺，提取過程需保證其純度。經(jīng)典的DNA提取方法由于不同的提取方法原理、使用的試劑、操作時(shí)間、難度不同，使其對(duì)DNA分子的破壞程度不同，可能造成所提取的DNA的分子質(zhì)量分布寬度不同[28]，因此，本研究方法設(shè)計(jì)時(shí)參考了胸腺肽、核酸類注射劑等藥物的研究方法[25-26，29]。

本研究根據(jù)抗體檢測(cè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示無抗體產(chǎn)生，因此分析腎基底膜等部位也不會(huì)有免疫復(fù)合物沉積。組織病理學(xué)觀察也證實(shí)，DNA實(shí)驗(yàn)組兔肝、腎等器官無明顯病理學(xué)改變。

圖3 DNA實(shí)驗(yàn)組肝臟（3a～3b）和腎臟（3e～3f）組織病理學(xué)改變（HE 高倍放大）

采用小牛胸腺DNA作為配基制備的免疫吸附柱也經(jīng)過了大量的臨床使用，體外研究實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)其可選擇性地清除抗DNA抗體，且沒有檢測(cè)到DNA脫落[2，4，9]；部分學(xué)者還進(jìn)行了重癥銀屑癬和支氣管哮喘的臨床研究，療效顯著[30-31]，具有選擇性吸附、療效高、安全的特點(diǎn)，為系統(tǒng)性紅斑狼瘡等難治性疾病的治療提供了新的方法。