黃耀凌，徐 倩，胡海燕，王亦琳，孫 雷，徐士新

(中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京100081)

多西環(huán)素(Doxycycline)為四環(huán)素類(lèi)抗生素，具有高效、長(zhǎng)效、廣譜等優(yōu)點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于獸醫(yī)臨床［1］?，F(xiàn)國(guó)內(nèi)外有較多關(guān)于多西環(huán)素制劑在豬、火雞、羊等動(dòng)物體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)研究報(bào)道［2-4］，但這些制劑消除半衰期較快，峰濃度相對(duì)較低。因此，本項(xiàng)目采用金屬離子絡(luò)合的方法，制備了緩釋的鹽酸多西環(huán)素注射液，以延長(zhǎng)多西環(huán)素在動(dòng)物體內(nèi)的消除半衰期［5］。本研究旨在探討自制鹽酸多西環(huán)素注射液在豬體內(nèi)的藥物動(dòng)力學(xué)規(guī)律，并通過(guò)藥物劑量對(duì)時(shí)間-效應(yīng)的關(guān)系(藥代動(dòng)力學(xué)(PK)/藥效學(xué)(PD)參數(shù))，為制定合理的臨床用藥方案提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥品和試劑 20%鹽酸多西環(huán)素注射液(規(guī)格:5 mL/瓶)，批號(hào)為101021，自制，經(jīng)測(cè)定含量為標(biāo)示量的101.0%;鹽酸多西環(huán)素對(duì)照品，含量為98.0%，批號(hào) 435239/1，BioChemika公司;乙腈、甲醇、乙酸乙酯、甲酸，色譜純;氫氧化鈉、Na2EDTA、Na2HPO4·12H2O、檸檬酸，分析純。

1.2 儀器 超高效液相色譜儀:ACQUITY UPLC，美國(guó)Waters公司;組織勻漿機(jī):日本NISSEI公司;低溫高速離心機(jī):德國(guó)Heldolph公司;渦旋混合儀:MS2德國(guó) IKA公司;微量分析天平:AE240型，METTLER公司;氮吹儀:美國(guó)Organomation Associates公司;可微調(diào)加樣器:德國(guó)Eppendorf公司;超純水儀:美國(guó) Millipore公司;SPE柱:HLB 3cc/60mg，美國(guó)Waters公司。

1.3 試驗(yàn)動(dòng)物 三元雜交健康豬10頭，雌雄各半，體重為15～50 kg，購(gòu)自北京金牧陽(yáng)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物養(yǎng)殖有限公司。試驗(yàn)前7 d，自由采食飲水，飼喂不加任何抗菌藥物的全價(jià)配合飼料。試驗(yàn)前后各組飼養(yǎng)條件相同。

1.4 給藥及血樣采集 豬仰臥保定，頸部肌內(nèi)注射藥物，給藥劑量按多西環(huán)素計(jì)均為10 mg/kg。前腔靜脈采血，給藥前采空白血樣約5 mL。給藥后，分別于 10、20、30、45 min 及 1、2、4、6、8、12、24、36、48、60、72 h采血。每次采血約6mL，置于肝素化的離心管中，3 000 r/min離心10 min，取血漿樣品于-20℃冰箱保存，待測(cè)。

1.5 樣品檢測(cè)

1.5.1 血漿樣品處理 取1mL待測(cè)血漿于50 mL離心管中，加入9 mL 0.1 mol/L Mcllvaine-Na2EDTA緩沖液，旋渦混勻1 min，15000 r/min高速離心5 min，取上清液于另一離心管備用。HLB固相萃取小柱，依次用甲醇、水各5 mL預(yù)洗。取上述上清液過(guò)柱，依次用水、5%甲醇水溶液各5 mL淋洗，減壓抽干，用甲醇-乙酸乙酯溶液(1+9，V/V)3 mL洗脫，洗脫液用氮?dú)獯蹈?溫度低于40℃)。用20%乙腈水0.5 mL溶解殘留物，過(guò)0.22 μm微孔濾膜后供Waters超高效液相色譜儀測(cè)定。

1.5.2 色譜條件 色譜柱:BEH C18(50 mm×2.1 mm，1.7 μm);流動(dòng)相:0.3%的甲酸乙腈溶液-0.3%的甲酸水溶液(18+82，V/V);流速:0.6 mL/min;柱溫:20℃;樣品溫度:15℃;進(jìn)樣量:5 μL。

1.6 數(shù)據(jù)分析 采用藥代動(dòng)力學(xué)軟件WinNonlin6.3對(duì)血藥濃度-時(shí)間數(shù)據(jù)處理，計(jì)算藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 血漿多西環(huán)素標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)制備 取空白血漿樣品添加鹽酸多西環(huán)素標(biāo)準(zhǔn)溶液使添加濃度為25、50、100、250、1000、2000、4000 μg/L(以多西環(huán)素計(jì)，如下同)，經(jīng)前處理后，供超高效液相色譜儀測(cè)定。將結(jié)果進(jìn)行相關(guān)與回歸分析，得到線(xiàn)性回歸方程為:Y＝18.189X-472.07，相關(guān)系數(shù)為0.9998。

2.2 檢測(cè)限和定量限 按照《獸用化學(xué)藥物臨床藥代動(dòng)力學(xué)試驗(yàn)指導(dǎo)原則》的要求，對(duì)添加濃度為12.5 μg/L的樣品，經(jīng)提取后進(jìn)行測(cè)定，LOD大于3倍信噪比，為方法的檢測(cè)限;對(duì)添加濃度為25 μg/L的樣品，經(jīng)提取后進(jìn)行測(cè)定，LOQ大于10倍信噪比，且準(zhǔn)確度和精密度符合殘留檢測(cè)方法的要求，因此25 μg/L的添加濃度為方法的定量限。

2.3 回收率、準(zhǔn)確度與精密度 取空白血漿1.0 mL，添加多西環(huán)素標(biāo)準(zhǔn)溶液使血漿中鹽酸多西環(huán)素的濃度分別為 25、250、2000 μg/L三個(gè)不同濃度，各濃度取5個(gè)樣品進(jìn)行平行試驗(yàn)，重復(fù)3次，樣品經(jīng)處理后進(jìn)超高效液相色譜測(cè)定，計(jì)算樣品的濃度、回收率、批內(nèi)、批間變異系數(shù)。結(jié)果如表1所示，樣品在25～2000 μg/L添加濃度范圍內(nèi)，回收率在85% ～105%之間，批內(nèi)變異系數(shù)為1.8% ～10%，批間變異系數(shù)為2.4% ～10%，符合方法學(xué)要求，可用于血藥濃度檢測(cè)。

表1 豬血漿中添加鹽酸多西環(huán)素的回收率與精密度表(n＝5)

2.4 血藥濃度數(shù)據(jù)與藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù) 每頭豬血藥濃度-時(shí)間數(shù)據(jù)見(jiàn)表2，血藥時(shí)間曲線(xiàn)見(jiàn)圖1。藥動(dòng)學(xué)數(shù)據(jù)表明部分豬血漿中藥物濃度在給藥后，峰濃度之前，有迅速上升，甚至初始血藥濃度高于峰濃度的突釋(雙峰)情況，不符合典型的房室模型，因此采用非房室模型分析血藥濃度-時(shí)間數(shù)據(jù)。藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)見(jiàn)表3，結(jié)果顯示，藥物在豬體內(nèi)的 t1/2為(31.3 ±9.2)h，Tmax為(0.80 ±0.7)h，Cmax為(4132 ±2475)μg/L，AUC 為(88378 ±88095)(μg/L)·h，MRT為(20.5±2.5)h?？瞻籽獫{、空白添加血漿樣品和給藥后的血漿樣品色譜圖分別見(jiàn)圖2-圖4，顯示多西環(huán)素的保留時(shí)間約為2.3 min，其峰形良好。

表2 鹽酸多西環(huán)素注射液給藥后1#～10#豬各時(shí)間點(diǎn)的血藥濃度 (μg/L)

圖1 豬肌內(nèi)注射鹽酸多西環(huán)素注射液的血藥濃度-時(shí)間曲線(xiàn)圖

2.5 PK/PD參數(shù)選擇給藥方案 根據(jù)文獻(xiàn)資料，多西環(huán)素對(duì)敏感菌的MIC接近0.25 mg/L［6-10］，對(duì)豬肺炎支原體(四個(gè)菌株)的MIC小于0.12 mg/L［11］。血藥濃度-時(shí)間對(duì)數(shù)藥動(dòng)曲線(xiàn)圖中，以多西環(huán)素對(duì)大多敏感菌MIC(250 μg/L)作橫線(xiàn)與曲線(xiàn)相交，顯示給藥后24小時(shí)血藥濃度均高于MIC。表明藥物對(duì)豬常見(jiàn)病原菌有良好的抑制作用。多西環(huán)素為時(shí)間依賴(lài)性藥物［12］，采用 PK/PD參數(shù) T＞MIC選擇給藥方案［13-14］。一般，當(dāng)%T＞MIC在40% ～50%［15-17］時(shí)，藥物發(fā)揮有效療效。根據(jù)MIC數(shù)據(jù)和試驗(yàn)中血藥濃度數(shù)據(jù)，T＞MIC約為24 h，AUC0-24/MIC比值在50～130(表3)范圍，表明鹽酸多西環(huán)素注射液以10 mg/kg劑量肌內(nèi)注射，兩天給藥一次為宜。

圖2 空白豬血漿色譜圖

圖3 空白豬血漿添加鹽酸多西環(huán)素250μg/L濃度點(diǎn)的色譜圖

圖4 給藥后豬血漿樣品色譜圖

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3 討論與小結(jié)

3.1 藥動(dòng)學(xué)特征 在藥動(dòng)學(xué)數(shù)據(jù)處理時(shí)，采用了非房室模型，這是由于部分試驗(yàn)動(dòng)物在給藥之后，出現(xiàn)了血藥濃度突釋(雙峰)現(xiàn)象。這可能是因?yàn)樽灾飘a(chǎn)品采用螯合反應(yīng)將多西環(huán)素與金屬離子絡(luò)合，但在產(chǎn)品制備過(guò)程中，仍有部分多西環(huán)素未完全與金屬離子絡(luò)合，在給藥后，游離部分的多西環(huán)素迅速進(jìn)入血液循環(huán)。另外，動(dòng)物個(gè)體差異等因素也造成對(duì)藥物吸收的不均等，因此表現(xiàn)出給藥后，峰濃度之前出現(xiàn)的血藥濃度迅速上升。而血藥濃度迅速上升并保持在較高濃度，發(fā)揮了快速抗菌作用，從而克服了緩釋制劑給藥后緩慢釋放不能有效快速發(fā)揮抑菌或殺菌效果的缺點(diǎn)。

楊海峰［18］報(bào)道，普通多西環(huán)素注射液給豬10 mg/kg劑量肌內(nèi)注射，t1/2β為 5.21 h 和 Cmax為2.31 mg/L;何家康［19］報(bào)道，豬以 10 mg/kg 劑量肌內(nèi)注射鹽酸多西環(huán)素注射液，MRT為15.18 h，Cmax為2.0 mg/L。與其他長(zhǎng)效或緩釋多西環(huán)素制劑相比，以同等劑量豬肌內(nèi)注射，楊海峰［18］報(bào)道的長(zhǎng)效多西緩釋注射液，t1/2β為11.07 h和Cmax為1.24 mg/L;何家康［19］的緩釋鹽酸多西環(huán)素注射液，MRT為22.25 h，Cmax為 3.32 mg/L;班付國(guó)［20］報(bào)道的長(zhǎng)效緩釋多西環(huán)素注射液，t1/2β為 9.63 h和 Cmax為1.69 mg/L。而本項(xiàng)目研制的鹽酸多西環(huán)素注射液，Tmax為 0.8 h，Cmax為 4132 μg/L，t1/2為 31.3 h，MRT為20.5 h。與上述的多西環(huán)素注射液相比，自制產(chǎn)品MRT更長(zhǎng)，表明具有良好的長(zhǎng)效作用。這其中原因與自制產(chǎn)品在制備過(guò)程中采用適宜的有機(jī)溶媒，以及藥物與金屬離子形成絡(luò)合物，使在體內(nèi)延緩了藥物的釋放有關(guān)。

3.2 給藥方案選擇 近年來(lái)，不少研究者通過(guò)藥代動(dòng)力學(xué)和藥效學(xué)之間的關(guān)系來(lái)評(píng)價(jià)獸藥對(duì)病原微生物的作用［13-16］。目前，被用來(lái)評(píng)價(jià)獸用抗菌藥對(duì)微生物發(fā)揮有效療效的PK/PD參數(shù)有Cmax/MIC，AUC/MIC 和%T＞MIC。其中，參數(shù) Cmax/MIC或AUC/MIC多用于濃度依賴(lài)性藥物的評(píng)價(jià);參數(shù)%T＞MIC或AUC/MIC用于時(shí)間依賴(lài)性藥物的評(píng)價(jià)，AUC/MIC主要用于中度和高度PAE時(shí)間依賴(lài)性藥物的評(píng)價(jià)［13-17］。一 般，當(dāng)%T＞MIC占 40% ～50%［15-17］或 Cmax/MIC 比例為8～10 時(shí)［21］，藥物發(fā)揮有效療效。而AUC/MIC比值在不同藥物表現(xiàn)并不相同，雖然研究表明，氟喹諾酮類(lèi)藥物在AUC/MIC在100～125范圍時(shí)，可以取得較為理想的療效，但還沒(méi)有證據(jù)可以將這個(gè)比值應(yīng)用到其他抗菌藥物［13］。

2007 年，Burgess發(fā)現(xiàn)四環(huán)素類(lèi)藥物在AUC/MIC＞25時(shí)，治療效果≥95%［9］。2013 年的報(bào)道也證明，當(dāng)多西環(huán)素AUC/MIC＞25時(shí)，治療效果≥90%［10］。又據(jù)報(bào)道，多西環(huán)素對(duì)敏感病原菌的 MIC 為0.05 ～0.20 μg/mL［8-11］。Schreiner在對(duì)人的試驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)當(dāng)MIC≤0.2 μg/mL時(shí)，患者治愈率接近95%［22］。Maaland試驗(yàn)認(rèn)為，多西環(huán)素的敏感折點(diǎn)為0.125 mg/L［10］。因此在進(jìn)行該制劑PK/PD參數(shù)計(jì)算時(shí)，MIC設(shè)定為0.25 μg/mL。

由于多西環(huán)素為中度時(shí)間依賴(lài)性藥物，因此PK/PD參數(shù)%T＞MIC和AUC/MIC可以作為評(píng)價(jià)其療效的指標(biāo)。根據(jù)MIC(0.25 μg/mL)，比較試驗(yàn)的藥時(shí)數(shù)據(jù)，超過(guò)MIC的時(shí)間(T＞MIC)約為24 h。根據(jù)%T＞MIC占40% ～50%時(shí)，藥物可發(fā)揮有效的療效，因此確定該制劑給藥間隔可為兩天一次。而根據(jù)表3結(jié)果，多西環(huán)素AUC/MIC比值＞50，說(shuō)明多西環(huán)素以10 mg/kg劑量給藥有較好的治療效果。因此，確定自制的鹽酸多西環(huán)素注射液推薦給藥方案為10 mg/kg劑量肌內(nèi)注射，兩天給藥一次為宜。

本項(xiàng)目研制的鹽酸多西環(huán)素注射液在豬體內(nèi)具有吸收快，血藥濃度較高，消除時(shí)間長(zhǎng)的特點(diǎn)，而且以10 mg/kg肌內(nèi)給藥的PK/PD參數(shù)%T＞MIC和AUC/MIC比值滿(mǎn)足治療要求。這說(shuō)明，該注射液適用于豬的臨床疾病治療。

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