張 輝，崔煥忠，楊 歡，馬思慧，吳天成，蘭海楠，鄭 鑫

（吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，長(zhǎng)春130118）

分泌型 IgA（Secretory immunoglobulin A，SIgA）作為粘膜免疫的主要效應(yīng)因子，在啟動(dòng)免疫學(xué)生物活性，清除病原，保護(hù)機(jī)體抗感染等方面發(fā)揮重要作用［1］。SIgA含量高低與機(jī)體的粘膜免疫狀況以及癌癥等疾病密切相關(guān)［2-3］，檢測(cè)SIgA含量不僅可以監(jiān)測(cè)機(jī)體粘膜免疫狀態(tài)，還可有助于疾病診斷。分泌片（secretory component，SC）是構(gòu)成SIgA分子的組成部分［4］，可以通過(guò)檢測(cè)SC來(lái)測(cè)定SIgA的含量。SC在初乳中以游離和結(jié)合兩種存在形式存在［5］，本研究以初乳為材料，分離純化游離SC，并制備了抗SC的多克隆抗體，為檢測(cè)SIgA免疫學(xué)檢測(cè)方法的建立奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料 Sephadex G-200凝膠（上?；瘜W(xué)試劑廠）；DEAE纖維素（DE52）及透析袋（Whatman公司）；Anti SC McAb（美國(guó) Sigma公司）；蛋白定量試劑盒（北京康為世紀(jì)生物科技有限公司）；低分子量蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)（寶生物大連有限公司）；豬初乳采自長(zhǎng)春市某豬場(chǎng)；雄性健康新西蘭大耳白兔（長(zhǎng)春市生物制品所）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 初乳中SIgA及分泌片的初步提取 參照胡正強(qiáng)等方法［6］，取 100 mL 豬初乳，4 ℃ 5000 r／min 離心30 min，吸取脂肪層與沉淀之間的液體約80 mL，加入疊氮鈉至終濃度為0.1%，用1 mol／L HCl調(diào)pH至4.0，4500 r／min 離心30 min，棄去沉淀，收集上清液，用 2 mol／L Tris 調(diào) pH 至7.3，4500 r／min 離心30 min，將上清液過(guò)0.45 μm濾器，獲得初乳提取物。

1.2.2 SephadexG-200分子篩凝膠層析法分離初乳提取物 稱取適量的SephadexG-200，用生理鹽水充分膨脹，煮沸，按常規(guī)方法裝柱，用生理鹽水平衡至上樣。將初乳提取物用生理鹽水透析過(guò)夜后，加于柱上，利用自動(dòng)分步收集器收集洗脫液，每管5 mL，用分光光度計(jì)測(cè)定洗脫液OD280nm值，根據(jù)OD280nm值繪制曲線，分別收集不同洗脫峰，第一峰液體主要為IgG和SIgA的混合物，第二峰液體含有SC［7］。

1.2.3 DEAE 52離子交換層析分離第一峰洗脫液將收集的第一峰洗脫液混合在一起，用50%PEG6000濃縮后，用 0.01 mol／L的 PB 液（pH7.4）4℃平衡過(guò)夜，中間更換透析液數(shù)次，蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白濃度。將DEAE 52以堿-酸-堿處理活化后，按照常規(guī)方法裝柱，用0.01 mol／L的PB液（pH7.4）平衡柱子，至流出液體的pH值與流入液體的pH值相等時(shí)，開(kāi)始上樣，待樣品進(jìn)入交換劑中，用少量緩沖液沖洗柱壁，然后用0.01 mol／L的PB液（pH7.4）進(jìn)行洗脫，利用自動(dòng)分步收集器收集洗脫液，每管5 mL，洗脫蛋白峰為IgG，至無(wú)蛋白洗脫下來(lái)時(shí)，改用0.1 mol／L的PB液（pH6.8）進(jìn)行洗脫，收集洗脫液，即為純化的 SIgA［8］。

1.2.4 硫酸銨鹽析法分離純化第二峰洗脫液中的SC將收集的第二峰洗脫液合并到一起，緩慢加入飽和硫酸銨溶液至終濃度為33%，室溫下靜置1 h，3000 r／min離心 20 min，棄去沉淀（為 IgG），將上清液裝入透析袋，用蒸餾水4℃透析，期間更換蒸餾水?dāng)?shù)次［9-10］。再用PEG6000濃縮，測(cè)定其蛋白濃度。

1.2.5 SDS-PAGE分析純化蛋白的分子量及純度配制12%的分離膠，將樣品與等量的2倍上樣緩沖液混勻，煮沸5 min，加樣。積層膠電壓為80 V，當(dāng)電泳至濃縮膠和分離膠界面，再升壓至120 V，當(dāng)溴酚藍(lán)距凝膠邊緣1 cm處停止電泳，用考馬斯亮藍(lán)G250進(jìn)行染色，觀察純化的SIgA及SC的分子量，利用凝膠薄層掃描分析蛋白純度。

1.2.6 瓊脂雙向免疫擴(kuò)散鑒定純化蛋白 稱取一定量的瓊脂粉，以1%的比例加入生理鹽水，充分融化后倒入平皿中，冷卻后打孔，取10 μL Anti SC McAb加入中央孔，外周分別加入分離純化的SIgA和SC液體［11］，放入濕盒中，置于37℃培養(yǎng)箱中，24 h后觀察結(jié)果。

1.2.7 抗SC多克隆抗體的制備 取1 mg純化的SC，與等體積的弗氏完全佐劑充分乳化后，背部脊柱兩側(cè)、皮下分5點(diǎn)接種兔子，共接種3只；二免，兩周后取1.5 mg純化的SC與等體積弗氏不完全佐劑乳化，以相同的免疫方式接種兔子；三免，間隔兩周后取2 mg純化的SC蛋白與等體積弗氏不完全佐劑乳化后，以同樣免疫方式接種兔子；加強(qiáng)免疫，三免二周后耳靜脈注射不加佐劑純化的SC蛋白進(jìn)行加強(qiáng)免疫。加強(qiáng)免疫7 d后，耳靜脈采血1 mL，37 ℃靜置1 h，4 ℃靜置2 h 后，3500 r／min 離心10 min，吸取血清，以分離純化的SIgA為檢測(cè)抗原，采用瓊脂雙向免疫擴(kuò)散檢測(cè)血清抗體效價(jià)，達(dá)到要求后，心臟采血，收集血清，分裝后于-20℃冷凍保存。

2 結(jié)果

2.1 初乳提取物進(jìn)行SephadexG-200凝膠層析將初乳提取物過(guò)SephadexG-200篩凝膠層析，根據(jù)洗脫液OD280nm值繪制曲線，第一峰（收集洗脫液第11～36管）為SIgA（含IgG）和第二峰（收集洗脫液第39～44管）為 SC（圖1）。

2.2 第一峰液體過(guò)DEAE 52離子交換層析柱將第一峰液體濃縮后，測(cè)定其蛋白濃度為0.82 mg／mL，取20 mL蛋白液過(guò)DEAE 52離子交換層析柱。用0.01 mol／L的 PB液（pH7.4）洗脫后，再用0.1 mol／L的PB液（pH6.8）洗脫。根據(jù)洗脫液OD280nm值繪制曲線（圖2），第一峰（收集洗脫液第1～40管）為 IgG，第二峰（收集洗脫液第41～65管）為 SIgA。

圖2 第一峰液體過(guò)DEAE 52柱曲線

2.3 SDS-PAGE分析純化蛋白的分子量及純度 分離純化蛋白進(jìn)行SDS-PAGE，結(jié)果表明純化的SIgA呈現(xiàn)SC、重鏈和輕鏈三條帶，SC的大小約為70 ku，重鏈位于66.4和44.3 ku之間約為50 ku，輕鏈位于29.0 ku和20.1 ku之間約為25 ku。分離的SC的分子量約為70 ku（圖3），與報(bào)道的大小相近。凝膠薄層掃描分析SIgA和分泌片純度分別為90%和89%。

圖3 提取SIgA和SC的SDS-PAGE結(jié)果

2.4 純化蛋白的鑒定 利用瓊脂雙向免疫擴(kuò)散鑒定分離純化蛋白，結(jié)果表明純化的SIgA和SC分別與Anti SC McAb發(fā)生了特異性反應(yīng)（圖4）。

圖4 純化蛋白的鑒定結(jié)果

2.5 抗SC多克隆抗體的制備 以純化的SC為免疫抗原，以純化的SIgA為檢測(cè)抗原，制備抗SC多抗隆抗體，瓊脂雙向免疫擴(kuò)散測(cè)定血清抗體的效價(jià)為1 ∶32。

3 討論

豬初乳來(lái)源相對(duì)廣泛，富含大量的SIgA和SC，且含雜蛋白較少［12］，有利于蛋白的分離純化。本實(shí)驗(yàn)選取豬初乳作為SC的提取材料。在豬初乳粗提過(guò)程中參照了胡正強(qiáng)等分離純化方法，首先去除乳中的酪蛋白及脂肪等雜質(zhì)［13-14］，然后根據(jù)分離蛋白分子量不同，進(jìn)行分子篩凝膠層析，將免疫球蛋白與SC分離開(kāi)，最后根據(jù)免疫球蛋白的等電點(diǎn)不同，采用離子交換層析進(jìn)行分離［15］，提取的SIgA純度較高，為90%，表明該種方法用于純化SIgA的效果較好，本研究獲得的SIgA可用于多抗制備的檢測(cè)抗原。

通過(guò)凝膠層析分離的SC洗脫液中含有少量的IgG，采用33%硫酸銨鹽析后，可以將IgG去除，獲得SC的純度為89%，高純度免疫抗原的獲得對(duì)于制備特異性多抗非常重要。陳斌利用制備了抗SC單克隆抗體［16］，單抗制備成本較高，操作繁瑣，而多抗制備相對(duì)省事省力。

SIgA與血清IgA在免疫學(xué)功能上有著顯著區(qū)別［17］，如何建立有效的方法將SIgA和IgA鑒別開(kāi)，是準(zhǔn)確檢測(cè)SIgA的關(guān)鍵。血清IgA與SIgA的結(jié)構(gòu)差別在于血清 IgA沒(méi)有 SC結(jié)構(gòu)［18］，由于 SC是SIgA的特異成分，因而可以應(yīng)用抗SC特異性抗體檢測(cè)SIgA。本研究以分離純化的SC為免疫抗原，制備了效價(jià)較高的抗SC的多克隆抗體，以期建立特異的檢測(cè)粘膜組織中SIgA免疫組織化學(xué)方法，為下一步開(kāi)展粘膜免疫激活劑對(duì)粘膜組織中SIgA分泌的影響奠定物質(zhì)基礎(chǔ)。

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