黃龍花，夏鳳娜，邵滿超，張一帆，陳多揚，胡惠萍＊＊

(1.廣東省微生物研究所，廣東省菌種保藏與應用重點實驗室，廣東省微生物應用新技術公共實驗室，

廣東省華南應用微生物重點實驗室，廣東 廣州 510070;2.廣東粵微食用菌技術有限公司，廣東 廣州 510070)

真姬菇Hypsizygus marmoreus(PK)Sing.屬于擔子菌亞門、傘菌目、白蘑科、玉蕈屬[1]，又名斑玉蕈、蟹味菇、玉蕈、假松茸、靈芝菇等，是北溫帶一種品質優(yōu)良的食用菌[2]。真姬菇營養(yǎng)價值較高，是1種具有良好保健功能的食用菌，其子實體熱水和有機溶劑 (甲醇和乙醇等)提取物，具有清除體內自由基、降血壓、提高免疫力和延緩衰老等功效[3]。在日本有“香在松口蘑，味在玉蕈”之稱。由于我國真姬菇品種名稱使用不規(guī)范，造成同種異名、同名異種現(xiàn)象較多，給真姬菇品種交流和產(chǎn)品出口帶來不便[4]。因此建立一套準確可靠、穩(wěn)定性好的真姬菇菌株分類鑒定方法迫在眉睫。

本研究將ERIC－PCR指紋圖譜分析和ITS序列分析相結合，對2個不同企業(yè)提供的真姬菇子實體進行同源性研究，為快速準確鑒定真姬菇品種提供參考。其中利用ERIC－PCR技術對真姬菇進行同源性分析在國內外尚屬首次。

1 材料與方法

1.1 材料

2個供試真姬菇子實體樣品，由廣東省食用菌行業(yè)協(xié)會會員單位提供，具體見表1。

表1 供試菇品

1.2 子實體前處理

對獲得的子實體進行實地拍照記錄，并將新鮮子實體在恒溫鼓風干燥箱中50℃烘干，保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 子實體基因組DNA的提取

子實體總DNA的提取純化按黃龍花等[5]的方法進行。

1.4 PCR擴增

1.4.1 ERIC－PCR

采用ERIC－PCR通用引物ERIC2和ERICR(ERIC2:5'－ATG TAA GCT CCT GGG GAT TCA C－3';ERICR:5'－AAG TAA GTG ACT GGG GTG AGC G－3')進行PCR擴增，引物由上海生工合成，擴增在Biometra PCR儀上進行。反應體系為2 ×PCR Taqmix 12.5 μL，DNA 模板 (濃度適中)2.5 μL，ddH2O 6 μL，引物 (10 μmol·L－1)各 2 μL，總體積 25 μL。反應條件為95℃反應5 min;94℃反應1 min，40℃～60℃(溫度梯度)反應1 min，72℃反應2 min，30個循環(huán);72℃反應8 min。

1.4.2 ITS－PCR

采用真菌核糖體基因間隔區(qū)通用引物 ITS1和 ITS4[6](ITS1:TCC GTA GGT GAA CCT GCG G;ITS4:TCC TCC GCT TAT TGA TA TGC)進行PCR擴增，引物由Sangon公司合成，擴增在Biometra PCR儀上進行。反應體系為2×PCR Taqmix 25 μL，DNA 模板 (濃度適中)5 μL，ddH2O 12 μL，引物(10 μmol·L－1)各 4 μL，總體積 50 μL。反應條件為 94℃反應5 min;94℃反應1 min，55℃反應1 min，72℃反應1 min，30個循環(huán);72℃反應10 min。

1.5 電泳成像及測序

對ERIC－PCR及ITS－PCR產(chǎn)物進行1.0%的瓊脂糖凝膠電泳，在UVP凝膠成像系統(tǒng) (GE公司)下成像保存。ITS－PCR產(chǎn)物回收純化后，以擴增引物為測序引物進行雙向測序拼接，由華大基因完成。

1.6 圖譜分析及序列比對分析

對電泳指紋圖譜進行分析 (樣品多的情況下，需要用UVIband等軟件構建系統(tǒng)進化樹，進行進化關系分析);對測得堿基序列，應用Clustal X進行序列完全比對分析 (樣品多的情況下，需要進一步用MEGA等軟件構建系統(tǒng)進化樹，進行進化關系分析)。

2 結果與分析

A公司靈芝菇子實體、B公司真姬菇子實體特征見圖1、圖2。

由圖1、圖2可以看出，2種鮮菇子實體外觀差異極小，難以區(qū)分 (色差由拍照引起)。觀察發(fā)現(xiàn)，A公司靈芝菇整體較為矮胖，纖維感較強，因而提取DNA時，干燥子實體較難磨碎。對照1和對照2是由同一菌種分離出的不同菌株，結果見圖3。

從圖3可以看出，退火溫度為45℃和48℃時，條帶多態(tài)性更為豐富，說明這些菌種的ERIC－PCR最佳退火溫度為(45±5)℃，其中對照1和對照2的指紋圖譜極相近，為同一品系的菌種 (圖4進一步驗證);而A公司靈芝菇和B公司真姬菇的指紋圖譜則差異比較大，應該不是同一品系 (圖4進一步驗證)。為探索最適退火溫度，進一步進行40℃～55℃退火溫度的梯度PCR，結果見圖4。

由圖4可以看出，對照1和對照2在同一退火溫度下的ERIC－PCR指紋圖譜一致，應為同一品種，其子實體應栽培自同一品種的同一品系;而A公司靈芝菇和B公司真姬菇在同一退火溫度下的ERIC－PCR指紋圖譜差異明顯，可能為不同品種或者同一品種的不同品系。真姬菇ITS序列完全比對圖見圖5。

由圖5可以看出，測序所得的A公司靈芝菇和B公司真姬菇的ITS序列長度均為661 bp，對661個堿基進行完全比對，結果發(fā)現(xiàn)它們存在3個堿基差異，其中有1個落在ITS1上;2個在ITS2上。將序列在NCBI的GenBank上作Blast，發(fā)現(xiàn)2個序列和GenBank上的已知真姬菇 (Hypsizigus marmoreus)序列相似性均達99%，所以2個均為真姬菇，但應來自不同品系。

3 結論

ERIC－PCR指紋圖譜分析和ITS序列分析相結合，對A公司靈芝菇和B公司真姬菇2組外觀相近的菇品子實體進行同源性研究。結果發(fā)現(xiàn)，A公司靈芝菇和B公司真姬菇的ERIC－PCR指紋圖譜存在較大的多態(tài)性差異，它們應屬于不同菌株 (品系)，甚至不同品種;ITS序列測定結果顯示它們僅存在3個堿基差異，應屬于同一品種。因此2種分子方法結合分析表明，這兩個子實體樣品均屬于真姬菇 (Hypsizigus marmoreus)品種，來自同一個品種的不同亞種/菌株 (品系)，它們擁有各自獨立知識產(chǎn)權。

[1]黃年來.中國大型真菌原色圖鑒[M].北京:中國農(nóng)業(yè)出版社，1998.

[2]楊新美.食用菌栽培學[M].北京:農(nóng)業(yè)出版社，1986.

[3]孫培龍，魏紅福，楊開，等.真姬菇研究進展 [J].食品科技，2005，26(9):54－57.

[4]王波.幾種食用菌品種名稱訂正 [J].中國食用菌，2006，25(5):27－28.

[5]黃龍花，吳清平，楊小兵，等.基于ITS序列分析探討我國栽培風尾菇的分類地位 [J].食用菌學報，2009，16(2):30－35.

[6]White TJ，Bruns T，Lee S.Analysis of phylogenetic relationships by amplification and direct sequencing of ribosomal RNA genes[C].//Innis MA.Ed.PCR Protocols:A guide to methods and applications.New York:Academic，1990:15－22.