李 平 蘇海虹 關(guān)萬(wàn)春

(1. 汕頭大學(xué)海洋生物研究所, 汕頭 515063; 2. 溫州醫(yī)科大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院海洋科學(xué)系, 溫州 325035)

海洋為我們提供了豐富的生物資源, 通過(guò)生物泵從大氣中吸收了大量二氧化碳, 從而減緩了溫室效應(yīng)。但是隨著現(xiàn)代化石燃料的大量使用, 大氣中二氧化碳總量不斷增加。已有數(shù)據(jù)顯示, 高濃度的二氧化碳不斷溶入海水中, 最終將導(dǎo)致表層海水的pH下降, 改變海水化學(xué)性質(zhì), 引起海水酸化[1,2], 改變海水碳酸鹽系統(tǒng), pCO2、H+和濃度增加,濃度下降。海水中不同類(lèi)型無(wú)機(jī)碳(CO2、、)濃度的比例及總?cè)芙鉄o(wú)機(jī)碳濃度發(fā)生變化, 從而造成CaCO3的飽和度下降, 進(jìn)而影響海洋生態(tài)系統(tǒng)。2005年, 詹姆斯·內(nèi)休斯描繪出“海洋酸化”潛在的威脅, 他通過(guò)研究發(fā)現(xiàn), 距今5500萬(wàn)年前, 海洋里曾經(jīng)出現(xiàn)過(guò)一次生物滅絕事件。罪魁禍?zhǔn)拙褪侨芙獾胶Ｋ械腃O2, 估計(jì)總量達(dá)到45000億噸, 此后海洋至少用了約10萬(wàn)年時(shí)間才恢復(fù)正常得以度過(guò)難關(guān)[2]?，F(xiàn)有的大量科學(xué)證據(jù)表明, 人類(lèi)現(xiàn)在一年中產(chǎn)生釋放的碳量約為71億噸, 其中25%— 30% (約20億噸)被海洋吸收, 33億噸在大氣中積累。據(jù)政府間氣候變化專門(mén)委員會(huì)(IPCC) 預(yù)測(cè), 到2100年, 海水pH平均值將因此下降約0.3—0.4, 至7.9或7.8。到那時(shí), 海水酸度將比工業(yè)革命開(kāi)始時(shí)約大100%—150%[3]。

CO2濃度變化對(duì)藻體生長(zhǎng)的影響表現(xiàn)出極大的種間差異性。Gao, et al.報(bào)道CO2濃度升高可以促進(jìn)紅藻條斑紫菜(Porphyra yezoensis)和紅藻江蘺(Gracilaria chilensis)的生長(zhǎng)[4,5], 但是對(duì)綠藻石莼(Ulva lactuca)的生長(zhǎng)則沒(méi)有影響[6,7]。Mercado, et al.的研究也表明 CO2濃度升高抑制了紅藻紫菜屬(P.leucostica和P. linearis)的生長(zhǎng)[8]。而最新的研究結(jié)果表明 CO2濃度升高還對(duì)珊瑚藻類(lèi)(Corallina sessilis)的生長(zhǎng)產(chǎn)生抑制[9]。高 CO2濃度還可以降低江蘺屬(Gracilaria sp.)和細(xì)基江蘺(G. tenuistipitata)葉綠素a和藻膽蛋白的含量[10]。不僅如此, Mercado, et al.還報(bào)道了CO2濃度升高引起紫菜(P. leucostica)葉綠素a、藻膽蛋白含量下降以及二者比值的增加[11]。而全球環(huán)境變化的另一個(gè)因素: 陽(yáng)光紫外輻射的增強(qiáng), 同樣可以影響藻體的生長(zhǎng)和光合生理過(guò)程, 如UVR使龍須菜(G. lemaneiformis)的相對(duì)生長(zhǎng)速率從4.3 %/d降低為 2.7 %/d[12], 并且降低了無(wú)柄珊瑚藻(C. sessilis)光化學(xué)效率[11]。諸多研究表明, 高 CO2和UVR對(duì)藻類(lèi)確有影響。為了更進(jìn)一步了解其影響,本實(shí)驗(yàn)選擇了具鈣化功能的叉節(jié)藻(Amphiroa sp.)和不具鈣化功能的剛毛藻(Cladophora sp.)為研究對(duì)象,探討高 CO2對(duì)其生長(zhǎng)和光化學(xué)效率的影響, 并分析高CO2和UVR的耦合效應(yīng)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

叉節(jié)藻和剛毛藻于2011年9月份采集于浙江省溫州市洞頭養(yǎng)殖區(qū)魚(yú)排周邊。將采集的藻體用海水洗凈, 去除附在表面的雜藻與沙蠶、勾蝦等動(dòng)物。每種藻體各取等量的兩份, 置于體積為 4 L的玻璃培養(yǎng)器中, 標(biāo)為 LC和 HC, 采用過(guò)濾海水, 在溫度為 25℃, 光強(qiáng)為 70 μmol/(m2·s), 光周期為 12L︰12D, 通氣量為36 L/h條件下室內(nèi)培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí),從培養(yǎng)器中取出藻體, 用吸水紙吸干表面水分, 稱量鮮重(FW, fresh weight), n=3。

1.2 酸化調(diào)節(jié)

正?？諝? CO2濃度約為380 μmol/mol (0.65 mg/m3),水體 pH 約為 8.2; 高 CO2水平: CO2濃度約為1000 μmol/mol(1.80 mg/m3), 水體 pH 約為 7.8。將每種藻分成兩組, 一組標(biāo)為L(zhǎng)C(即Low Carbon), 直接用氣泵抽取室外的空氣即可。另一組標(biāo)為 HC(即High Carbon), 將40 L的氣囊充滿純CO2, 然后控制放氣量為4 L/h, 每隔4h放一次氣, 再用氣泵抽取室內(nèi)的空氣。經(jīng)監(jiān)測(cè)發(fā)現(xiàn), 培養(yǎng)液pH為7.8—7.9, 推算此時(shí)室內(nèi) CO2濃度約為 1000 μmol/mol (1.80 mg/m3)。采用PHS-25CW pH計(jì)(上海產(chǎn))每天8:00、12:00和20:00檢測(cè)水體pH。

1.3 紫外輻射光源以及紫外輻射處理

太陽(yáng)輻射的監(jiān)測(cè)采用太陽(yáng)輻射模擬器(德國(guó)產(chǎn))。該光譜輻射儀可監(jiān)測(cè)UVR (280—400 nm) 波段的輻射強(qiáng)度與輻射量。可見(jiàn)光輻射通量為150 W/m2,紫外線輻射通量為39 W/m2。

于2011年12月1日, 將培養(yǎng)了73d的藻體分別分裝于石英管(直徑59 mm , 長(zhǎng)度350 mm)中, 置于流水水槽, 溫度控制在25℃, 水面距藻體的深度為3 cm。通過(guò)使用紫外濾膜使藻細(xì)胞接受不同的太陽(yáng)輻射處理: (1) PAR+UVA+UVB (PAB處理, 295—700 nm) , 石英管Ultraphan Film 295 (德國(guó)產(chǎn)) 包裹;(2) PAR (P處理, 395—700 nm) , 石英管用Ultraphan Film 395 (德國(guó)產(chǎn)) 包裹。將藻體置于太陽(yáng)輻射模擬器下, 持續(xù)照射60min 后, 立即測(cè)定藻體的光化學(xué)效率, 太陽(yáng)輻射模擬器輻射強(qiáng)度為: 可見(jiàn)光(PAR)為150 W/m2, 紫外輻射A(UV-A)為37 W/m2: , 紫外輻射B(UV-B)為1.2 W/m2。

1.4 光化學(xué)效率的測(cè)定及UVR抑制率的計(jì)算

采用調(diào)制葉綠素?zé)晒獬上裣到y(tǒng)M系列Imaging-PAM(德國(guó)產(chǎn))測(cè)定光化學(xué)效率的變化。

有效光化學(xué)效率(Effective quantum yield) Yield(Y′)= Fv′/ Fm′, 其中Fm′: 在光適應(yīng)狀態(tài)下的最大熒光值; Fv′: 任意光適應(yīng)狀態(tài)下的最大可變熒光值。Fv′ =Fm′–Ft, 其中Ft: 適光狀態(tài)下的初始熒光值。UVR 的抑制率(%) = 100 ×(PPAR–PPAB) / PPAR, 其中PPAR: 可見(jiàn)光(P)條件下的有效光化學(xué)效率; PPAB: PAB 處理?xiàng)l件下的有效光化學(xué)效率。

1.5 高CO2(海水酸化)對(duì)紫外輻射抑制率的調(diào)節(jié)率

InhLC: 非酸化(LC)紫外輻射抑制率; InhHC: 酸化(HC)紫外輻射抑制率

1.6 統(tǒng)計(jì)分析

采用One-way ANOVA對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析, 顯著水平設(shè)為P<0.5。

2 結(jié)果

從2011年9月9日至2011年11月29日, 藻體持續(xù)在空調(diào)控溫的溫室內(nèi)培養(yǎng)。在73d的培養(yǎng)過(guò)程中, 溫度基本可以維持在25℃左右。依據(jù)pH調(diào)控方法的描述, 對(duì)藻體進(jìn)行培養(yǎng), 并檢測(cè)培養(yǎng)液pH。結(jié)果發(fā)現(xiàn),LC條件下叉節(jié)藻培養(yǎng)的pHLC約為8.0左右, HC條件下(pHHC)約為7.7左右(圖 1A), △pHLC-HC基本保持在0.1—0.4波動(dòng)(圖 1B); 而剛毛藻LC條件下的培養(yǎng)液pHLC為8.2左右, pHHC為7.9左右(圖1C), △pHLC-HC基本保持在0.2—0.5波動(dòng)(圖 1D)。兩種藻培養(yǎng)液中pH的差異, 體現(xiàn)了種間差異。

經(jīng)高CO2培養(yǎng)73d后, 兩種藻的響應(yīng)出現(xiàn)了顯著差異。高濃度CO2(1000 μmol/mol)抑制了叉節(jié)藻的生長(zhǎng), 與通空氣培養(yǎng)的藻體相比(鮮重增加了4.06%),其鮮重下降了40.01%。但高濃度CO2對(duì)剛毛藻是有利的, 其鮮重增加了40.08%, 增長(zhǎng)率是通入正常空氣培養(yǎng)的1.8倍(正常條件下鮮重增加了22.25%)(圖2)。

圖 1 叉節(jié)藻 (A) 和剛毛藻(C)培養(yǎng)液pH變化圖; 叉節(jié)藻 (B)和剛毛藻(D)HC和LC培養(yǎng)液的△pHFig. 1 The pH change of culture medium with Amphiroa sp. (A) and Cladophora sp.(C); △pH difference of culture medium with Amphiroa sp. (B) and Cladophora sp. (D) between HC and LC

圖 2 不同CO2濃度培養(yǎng)73d后叉節(jié)藻(A)和剛毛藻(B)鮮重Fig. 2 The fresh weight of Amphiroa sp. (A) and Cladophora sp.(B) at different CO2 concentrations for a 73-day culture

經(jīng)調(diào)制葉綠素?zé)晒獬上裣到y(tǒng)檢測(cè), 在可見(jiàn)光(PAR)照射條件下照射 1h, 高 CO2對(duì)藻體有效光化學(xué)效率的影響不顯著, 即HC和LC之間沒(méi)有明顯差異(P>0.05), 且不存在種間差異(圖 3)。然而當(dāng)藻體接受紫外輻射處理后(PAB), HC對(duì)兩種藻體的影響出現(xiàn)了明顯的差異, 具有鈣化能力的叉節(jié)藻對(duì)紫外輻射敏感性顯著增加(P<0.05), 其有效光化學(xué)效率(0.169)比LC的低了42.56%(圖3E), 且UVR 對(duì)HC條件下叉節(jié)藻的抑制率為51.76%, 是LC條件下的4.5倍(正?？諝馑较聻?1.51%)。然而高濃度CO2培養(yǎng)的剛毛藻, 其有效光化學(xué)效率并沒(méi)有受到影響,與LC之間沒(méi)有顯著差異(圖3F), 且HC和LC之間的紫外輻射抑制率約相差不大(圖4A), 約為25%左右。

因此, 針對(duì)具有鈣化能力的叉節(jié)藻來(lái)說(shuō), 海水酸化加劇了藻體對(duì)紫外輻射的敏感性, 紫外輻射的抑制率增加了 77.76%, 然而剛毛藻僅僅增加了17.02%(圖 4B)。

3 討論

圖3 為了探討不同藻體對(duì)不同光輻射處理(60min)的響應(yīng), 在 P(395—700 nm)和 PAB(295—700 nm)輻射處理下的光化學(xué)效率Fig. 3 The experiment investigated the different response of solar UVR. The effective quantum yield, exposed to solar radiation for 60min under P (395—700 nm) and PAB (295—700 nm) treatments

大量的研究結(jié)果表明, 大氣 CO2濃度升高會(huì)對(duì)海洋生物的鈣化過(guò)程產(chǎn)生一定的影響[12—19]。這是因?yàn)楹Ｋ?pH的變化會(huì)改變水體中 CaCO3的飽和度,進(jìn)而影響鈣化生物, 如已有報(bào)道指出由 CO2濃度升高導(dǎo)致的濃度降低會(huì)使鈣化藻類(lèi)的鈣化速率降低, 從而抑制生長(zhǎng)[20]。本實(shí)驗(yàn)選擇的叉節(jié)藻為具有鈣化功能的紅藻, 當(dāng)海水pH由8.2下降到7.8左右,藻體的生長(zhǎng)明顯下降了40.01%, 這是因?yàn)樵谒峄臈l件下, 藻體通過(guò)鈣化過(guò)程形成的碳酸鈣結(jié)構(gòu)加速溶解, 而藻體為了保證自身的正常生長(zhǎng)和生理代謝活動(dòng), 從而將體內(nèi)能量重新分配, 以犧牲生長(zhǎng)來(lái)保證藻體的鈣化程度(圖2)。有最新的研究也表明CO2濃度升高對(duì)珊瑚藻類(lèi)(C. sessilis)的生長(zhǎng)產(chǎn)生抑制[9]。但不具有鈣化能力的剛毛藻(綠藻), 當(dāng)處于pH為7.8的酸化環(huán)境時(shí), 由于水體中CO2分壓(pCO2)增加542 μmol/mol[21]),藻體光合作用可利用的碳源增加2.19倍, 從而節(jié)省了藻體利用水體中 HCO3-時(shí)所消耗的ATP, 因此, 與非酸化培養(yǎng)的藻體相比較, 酸化使得剛毛藻的生長(zhǎng)提高了40.08%。Hein,et al.[22]的研究結(jié)果也表明,當(dāng)大氣中CO2濃度升高到855 μmol/mol時(shí), 水體CO2分壓為463 μmol/mol, 海洋初級(jí)生產(chǎn)力可相應(yīng)提高大約15%左右。正常海水中溶解的CO2濃度僅占總DIC的1%[23], 大約為(5—25) μmol/L, 該濃度低于細(xì)胞內(nèi)Rubisco酶對(duì)底物CO2的Km(20—70 μmol/L)[24]。所以, 當(dāng)綠藻在酸化條件下生長(zhǎng)時(shí), 水體中可利用CO2濃度可達(dá)到40 μmol/L(pH=7.8), 因此生長(zhǎng)增加。而對(duì)于具有鈣化功能的珊瑚藻來(lái)說(shuō), 雖然酸化條件下其光合底物CO2也增加了, 光合作用加快, 但由于其鈣化程度受到酸化的影響(鈣質(zhì)隨著水體碳酸鈣飽和度的下降而溶解), 受到脅迫作用,因此, 將胞內(nèi)能量重新分配,以犧牲生長(zhǎng)來(lái)維持自身的正常生理活動(dòng)。

在較強(qiáng)的可見(jiàn)光條件下(輻射通量為150 W/m2),兩種藻體的光化學(xué)效率都受到明顯抑制作用, 這是因?yàn)閮煞N藻在室內(nèi) 14 W/m2[70 μmol/(m2·s)]光強(qiáng)條件下培養(yǎng) 73d, 適應(yīng)了低光環(huán)境, 因此當(dāng)轉(zhuǎn)移到高光強(qiáng)下(輻射通量為 150 W/m2), 強(qiáng)光導(dǎo)致藻體產(chǎn)生活性氧, 對(duì)細(xì)胞類(lèi)囊體膜和光系統(tǒng)造成損傷[25], 從而叉節(jié)藻光化學(xué)效率分別下降 28.9%(LC), 29.4%(HC)(圖3E); 剛毛藻則下降29.77%(LC), 33.57%(HC)(圖3F), 表現(xiàn)為抑制。當(dāng)藻體同時(shí)接受可見(jiàn)光和UVR(280—400 nm)后, 光化學(xué)效率進(jìn)一步損傷加劇, 抑制更加明顯, 前者分別為43.5%(LC), 29.5%(HC)(圖4E), 后者分別為35.77%(LC), 33.57%(HC)(圖3F)。這是因?yàn)閁VR可以造成光系統(tǒng)II(PS II)中的D1蛋白失活, 因?yàn)樗?00 nm處有明顯的吸收峰而很容易受UVR的影響。所以UVR如果對(duì)活性位點(diǎn)中氨基酸殘基、芳香族氨基酸或二硫鍵造成損傷, 就會(huì)引起蛋白質(zhì)或酶的失活[26], 從而加劇了光系統(tǒng) II(PSII) D1蛋白損傷程度, 光化學(xué)效率下降。

圖4 叉節(jié)藻和剛毛藻的紫外輻射抑制率(A)及海水酸化對(duì)紫外輻射抑制率的調(diào)節(jié)率(B)Fig. 4 The inhibition of Amphiroa sp. and Cladophora sp. (A) and the variation of ocean acidification to the inhibition of UVR(B)

經(jīng)酸化培養(yǎng) 73d后, 與非酸化培養(yǎng)的藻體進(jìn)行對(duì)比, 叉節(jié)藻和剛毛藻對(duì)UVR的敏感性都增加, 前者升高了77.76%, 而后者升高了17.02%(圖4B)。這說(shuō)明海水酸化加劇了紫外輻射對(duì)藻體的負(fù)面效應(yīng)。隨著海水酸化越來(lái)越嚴(yán)重, 叉節(jié)藻的鈣化程度也越來(lái)越低, 其光合作用受到 UVR的影響也越來(lái)越明顯。這是因?yàn)閁VR可以對(duì)光系統(tǒng)、酶和DNA等造成損傷, 為了修復(fù)這些損傷, 藻體需要更多的能量,而這就導(dǎo)致了生長(zhǎng)速率的降低。鈣化作用的發(fā)生一般認(rèn)為依賴于光合作用提供的能量。高CO2濃度使得海水中CaCO3飽和度降低, UVR則可以對(duì)光系統(tǒng)造成損傷, 在二者的耦合作用下藻體的鈣化受到較大的抑制[11], 碳酸鈣減少, 相當(dāng)于藻體的保護(hù)層減少, 因此受到的損傷加大; 而剛毛藻不具鈣化作用,無(wú)碳酸鈣, 受到的損傷也加劇。但兩種藻體的調(diào)節(jié)率不同, 這體現(xiàn)了藻體對(duì)海水酸化和UVR響應(yīng)的種間差異性。