朱軍，孫麗，，李曉瑾，*，趙麗，石書兵

(1.新疆中藥民族藥研究所，新疆 烏魯木齊 830002；

阜康阿魏內(nèi)生真菌的組成及分布△

朱軍1，孫麗1，2，李曉瑾1，2*，趙麗3，石書兵2

(1.新疆中藥民族藥研究所，新疆 烏魯木齊 830002；

2.新疆農(nóng)業(yè)大學 農(nóng)學院，新疆 烏魯木齊 830052；

3.新疆醫(yī)科大學 中醫(yī)學院，新疆 烏魯木齊 830011)

目的探索阜康阿魏植物內(nèi)生真菌的組成及分布，為進一步深入研究其作用機理及應(yīng)用價值提供理論依據(jù)。方法采用微生物學研究方法與技術(shù)，對阜康阿魏的不同生長期、不同部位中的內(nèi)生真菌進行了分離，并利用形態(tài)和分子生物學方法對其鑒定。通過分離頻率、Shannon-Wiener多樣性指數(shù)和系統(tǒng)發(fā)育樹等分析阜康阿魏內(nèi)生真菌的組成、分布及多樣性。結(jié)果本研究共分離得到內(nèi)生真菌59株，分別歸屬于20個分類單元，其中，Pleosporalessp.，短枝霉屬和葉點霉屬為優(yōu)勢菌群，分別占總菌株數(shù)量的11.86%、8.47%和8.47%。阜康阿魏1～2年根的多樣性指數(shù)最大，達到1.48。結(jié)論阜康阿魏在不同生長期及不同部位中的內(nèi)生真菌分布及組成存在差異，具有一定的年份及組織專一性。

阜康阿魏；內(nèi)生真菌；組成；分布

阜康阿魏FerulafukanensisK.M.Shen.系傘形科阿魏屬FeruleL.多年生一次結(jié)實植物，是維吾爾族、蒙古族、回族等少數(shù)民族的傳統(tǒng)民族藥，僅分布于新疆準格爾盆地通古特沙漠邊緣，屬國家三級瀕危藥用植物，收錄于歷版《中國藥典》，具有消積、化癥、散痞、殺蟲等功效，臨床上主要用于肉食積滯、淤血癥瘕、腹中痞塊、蟲積腹痛的治療[1]。近年來由于發(fā)現(xiàn)其具有植物雌激素活性成分和抗癌物質(zhì)而倍受人們關(guān)注[2-3]。

內(nèi)生真菌(endophytic fungi)是指那些在生活史中的某一階段生活于植物組織內(nèi)，對植物組織沒有引起明顯病害癥狀的真菌[4]。內(nèi)生真菌可產(chǎn)生植物生長激素，促進宿主植物對氮、磷等營養(yǎng)元素的吸收，通過與病原菌競爭營養(yǎng)和空間或直接產(chǎn)生拮抗物質(zhì)而抑制病原菌，從而促進植物生長[5]。本文研究阜康阿魏植物內(nèi)生真菌的組成及分布，為進一步深入研究其作用機理及應(yīng)用價值提供了理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 樣品 2012年5月采自新疆阜康市郊，分別為1～2年、3～4年、大于5年生長期和開花期的根、葉及花莖。經(jīng)李曉瑾研究員、王果平副研究員鑒定為阜康阿魏FerulafukanensisK.M.Shen。

1.1.2 培養(yǎng)基 麥麩液體(固體)培養(yǎng)基：麥麩30 g·L-1，煮30min，取汁，葡萄糖20 g·L-1，磷酸二氫鉀3 g·L-1，硫酸鎂1.5 g·L-1，瓊脂12 g·L-1，pH自然。PDA培養(yǎng)基[6]，在純化期使用時，待冷卻至60 ℃左右加入0.1%的鏈霉素；在純化待保藏使用時，不加鏈霉素。

1.2 方法

1.2.1 內(nèi)生真菌的分離、純化及保藏 分別取不同樣品，依次用75%乙醇1 min，3%次氯酸鈉8 min消毒，無菌水洗滌5次，瀝水；干后切成0.5 cm×0.5 cm，分別置于麥麩培養(yǎng)基上，每皿5～7塊，每樣品10皿，以無菌水涂布為對照，置于25 ℃暗培養(yǎng)。定時觀察，有菌絲長出后，挑取菌絲尖端轉(zhuǎn)入含有鏈霉素的PDA培養(yǎng)基中逐級純化，純化后內(nèi)生菌轉(zhuǎn)入不含鏈霉素的PDA培養(yǎng)基中。所獲內(nèi)生真菌一半置10%甘油中，-80 ℃保藏；一半轉(zhuǎn)入含PDA培養(yǎng)基的凍存管中，待菌絲長滿培養(yǎng)基表面時，4 ℃保藏。

1.2.2 內(nèi)生真菌的鑒定

(1)形態(tài)學鑒定

在干凈的載玻片上加1滴5% KOH溶液，用膠帶粘取菌落表面部分菌絲及孢子等，代替蓋玻片置于載玻片上，用濾紙吸干周圍多余的液體，制成玻片，在顯微鏡下觀察并記錄孢子形態(tài)、產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)和菌絲形態(tài)等。根據(jù)所觀察形態(tài)特征對分離獲得的內(nèi)生真菌進行鑒定[7-9]。

(2)分子鑒定

采用CTAB法提取所得內(nèi)生真菌的基因組DNA，并作為模板，以通用引物ITS1(5′-TCCGTAGG TGAACCTGCGG-3′)和ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGA TATGC-3′)對菌株進行ITS區(qū)域擴增。

PCR：①反應(yīng)體系(25μL體系)：PCR mix 12.5 μL，ITS1和ITS4各0.5 μL，模板DNA 2 μL，雙蒸水補足25 μL。②PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性3 min，94 ℃變性1 min，53 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，32個循環(huán)，72 ℃溫育7 min。③PCR產(chǎn)物的檢測：1%的瓊脂糖凝膠，1×TAE 電泳緩沖液電泳，樣量3 μL，120 V電泳20～30 min。置凝膠成像系統(tǒng)中觀察結(jié)果并拍照。

經(jīng)金唯智生物技術(shù)(北京)有限公司測序，提交GenBank數(shù)據(jù)庫，運用Blast搜索其同源序列，選擇與靶序列最相近的菌種序列作參考；在多序列對比軟件Clustal X 2.0中做同源性比較，并匹配排序；MEGA 4構(gòu)建鄰接(Neighbor-joining，NJ)樹，結(jié)合序列比對，分析系統(tǒng)發(fā)育，鑒定不產(chǎn)孢菌株。

1.2.3 統(tǒng)計分析方法 采用分離頻率(Isolation frequency，IF)比較和判斷優(yōu)勢菌群；Shannon-Wiener多樣性指數(shù)來分析內(nèi)生真菌的菌群多樣性。

2 結(jié)果

2.1 阜康阿魏內(nèi)生真菌的組成

在549個組織塊中共分離出內(nèi)生真菌59株，可分為20個屬(包括未鑒定出內(nèi)生真菌9株)。其中，在阜康阿魏葉中分離得到23株內(nèi)生真菌，分布于6個屬；在阜康阿魏根中分離得到35株內(nèi)生真菌，分布于16個屬中；在阜康阿魏花莖中僅分離到1株內(nèi)生真菌。所分離得到的內(nèi)生真菌中，Pleosporalessp.分離頻率最高，達到11.86%，且只分布于阜康阿魏1～2年根中。其次為短枝霉屬和葉點霉屬，分離頻率均為8.47%(表1)。

表1 阜康阿魏內(nèi)生真菌的分離頻率

2.2阜康阿魏內(nèi)生真菌的多樣性分析

多樣性指數(shù)結(jié)果表明：1～2年生長期的阜康阿魏根部多樣性指數(shù)最大，從中分離到了28株內(nèi)生真菌，分屬于14個屬，多樣性指數(shù)達到1.48；其次為阜康阿魏的葉片，分離到15株內(nèi)生真菌，分屬于4個屬，多樣性指數(shù)達到0.70；多樣性指數(shù)最小的是生長期>5年的阜康阿魏根及花莖，僅分離到1株內(nèi)生真菌，多樣性指數(shù)僅0.18(表2)。

表2 阜康阿魏內(nèi)生真菌的多樣性指數(shù)

2.3 系統(tǒng)發(fā)育分析

分離所得59株內(nèi)生真菌根據(jù)進化親緣關(guān)系可分為種群Ⅰ和種群Ⅱ，其中種群Ⅰ又可以進一步分為種群A和種群B。其中，種群B的自檢支持率為100%，而種群A的自檢支持率則較低，僅為41%。種群Ⅱ可以進一步分為種群C和種群D，自檢支持率分別為78%和100%(圖1)。

圖1 阜康阿魏內(nèi)生真菌的系統(tǒng)發(fā)育樹

3 討論

本研究從阜康阿魏中分離出59株內(nèi)生真菌，分為20個屬，其中根中分離出的內(nèi)生真菌數(shù)量及種類最多，其次為葉，莖中最少，不同生長期不同部位既含有各自特有的專一性菌群也含有共有的廣布菌群。造成這種現(xiàn)象的原因可能是組織結(jié)構(gòu)不同、含有的營養(yǎng)物質(zhì)不同，從而影響了內(nèi)生真菌的侵染和分布。

本實驗結(jié)果表明，阜康阿魏體內(nèi)蘊含著比較豐富的內(nèi)生真菌資源，且受組織、株齡和環(huán)境等因素的影響，表現(xiàn)出一定的組織及宿主差異性。通過對阜康阿魏內(nèi)生真菌組成及分布的研究可以更好的探討宿主植物與內(nèi)生真菌的關(guān)系，豐富現(xiàn)有的內(nèi)生真菌資源，為阿魏屬植物內(nèi)生真菌生物活性物質(zhì)篩選、開發(fā)阿魏屬藥用植物的人工栽培新途徑等工作提供了一定的理論和現(xiàn)實依據(jù)。

[1] 國家藥典委員會.中國藥典[S].一部.北京：中國醫(yī)藥出版社，2010：176.

[2] Lkeda K，Arao Y，Otsuka H，et al.Terpenoids Found in the Umbelliferae Family Act as Agonists/Antagonists for Erα and ERβ：Differential Transcription Activity between Ferutinine-liganded Erα and ERβ[J].Biochem Biophysi Res Commuicat，2002，291(2)：354-360.

[3] Shi-Yong R，Chong-Ock L，Song-Un C，et al.Anticancer Composition Comprising Sesquiterpenes Isolated from Resina Ferula[P].US,20040043083 A1，2004，4.

[4] Carlile WR，Papadopoulos AP.The effects of environment lobby on the selection and use of growing media[J].Acta Hort，1999，481：587-596.

[5] 胡鳳，程玉鵬，王振月，等.藥用植物內(nèi)生真菌研究現(xiàn)狀及其應(yīng)用前景[J].生物技術(shù)通訊，2008，19(5)：781-783.

[6] 沈萍.微生物學實驗[M].北京：高等教育出版社，2004：215.

[7] Alexopoulos CJ，Mims CW，Blackwell M.Introductory mycology[M].4th.ed.NewYork:John Wiley and Sons，1996：74-309.

[8] 裘維番.菌物學大全[M].北京：科學出版社，1998：59-300.

[9] Barnett HL，Hunter BB.Illustrated genera of imperfect fungi[M].4th ed.APS Press，St.Paul.，1998：1-218.

The Composition and Distribution of Endophytic Fungi Associated with Ferula fukanensis K.M.Shen

ZHU Jun1，SUN Li1，2，LI Xiao-jin1，2*，ZHAO Li2，SHI Shu-bing2

(1.XinJiangInstituteofChineseTraditionalMedicaandEthicalMateriaMedica，Urumqi830002，China;2.Collegeofagricultural，XinjiangAgriculturalUniversity，Urumqi830052，China;3.CollegeoftraditionalChinesemedicine，XinjiangMedicaUniversity，Urumqi830011，China)

Objective：In order to provide basic information for further study on mechanism and application of endophytic fungal ofFerulafukanensisK.M.Shen，the composition and distribution of endophytic fungi associated withF.fukanensiswere analyzed in the research.MethodsThe microbiology research methods and technology were used to isolate the endophytic fungi from different samples ofF.fukanensis，and this endophytic fungi were identified by ITSrDNA sequence analysis and morphology analysis.The Isolation frequency(IF)，Shannon-Wiener biodiversity index(H′)and Phylogenetic tree were used to analyze the composition，distribution and diversity of endophytic fungal community.ResultsA total of 59 strains endophytic fungi were isolated from theF.fukanensis，which were classified into 20 species.Among the 140 isolates，Pleosporalessp.，BrachycladiumpapaverisandPhyllostictawere the dominant generas，which can reach 11.86%，8.47% and 8.47% respectively.The Shannon-Wiener biodiversity index of 1-2 yearsF.fukanensiswas the highest，reached 1.48.ConclusionThere are notable differences between distribution and composition of the endophytic fungi isolated from different years and different parts ofF.fukanensis.

FerulafukanensisK.M.Shen；Endophytic fungi；Composition；Distribution

國家自然科學基金項目(81060265)；新疆維吾爾自治區(qū)自然基金(2011211B44)

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李曉瑾，研究員，研究方向：中藥學；Tel：(0991)2665614，E-mail：xjlxj@126.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2014.07.011

2014-03-04)