周倩倩，周明兵

浙江農(nóng)林大學(xué) 亞熱帶森林培育國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，浙江 臨安 311300

轉(zhuǎn)座子 (Transposable elements, TEs)是指在基因組上能從同一條染色體的一個位置轉(zhuǎn)移到另一個位置或者從一條染色體轉(zhuǎn)移到另一條染色體上的一段DNA序列，20世紀(jì)40年代美國遺傳學(xué)家 McClintock[1]首次在玉米中發(fā)現(xiàn)。此后科學(xué)家們發(fā)現(xiàn)了多種類型的轉(zhuǎn)座子，它們廣泛存在于細(xì)菌、酵母和高等動植物基因組中。轉(zhuǎn)座子依據(jù)轉(zhuǎn)座方式的不同分為DNA轉(zhuǎn)座子和反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子兩類。DNA轉(zhuǎn)座子以“剪切-粘貼”的方式轉(zhuǎn)座，其轉(zhuǎn)座只是位置的移動，并不增加拷貝數(shù)，典型的含有末端反向重復(fù)(Inverted terminal repeats, ITRs)和編碼轉(zhuǎn)座酶的基因，結(jié)構(gòu)較簡單[2]；而反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子則以“復(fù)制-粘貼”的方式轉(zhuǎn)座，通過 RNA 中間體來實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)座，在轉(zhuǎn)座過程中編碼反轉(zhuǎn)錄酶，每發(fā)生一次轉(zhuǎn)座，即可以增加一個拷貝，反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子結(jié)構(gòu)比較復(fù)雜，除了編碼基因外，還帶有增強(qiáng)子、啟動子等調(diào)控元件[3]。轉(zhuǎn)座子能夠通過它們的轉(zhuǎn)座來塑造物種的基因組[4-5]，例如促進(jìn)基因組失活、調(diào)節(jié)基因組的表達(dá)、誘導(dǎo)不正規(guī)的基因組重組、在物種形成和進(jìn)化的過程中影響基因組的大小。近年來，隨著對轉(zhuǎn)座子的研究，轉(zhuǎn)座子作為基因功能分析、轉(zhuǎn)基因、插入突變及突變體庫的構(gòu)建、基因治療等的工具，已經(jīng)在多種植物以及酵母Saccharomyces lysate、線蟲Caenorhabditis elegans、果蠅Drosophila melanogaster和部分脊椎動物中得到成功應(yīng)用[6-7]。

轉(zhuǎn)座子在進(jìn)化過程中以垂直遺傳為主，也可通過橫向遺傳的方式侵入其他物種基因組中，頻繁轉(zhuǎn)座，大量擴(kuò)增自身的拷貝數(shù)，從而在宿主基因組的長期進(jìn)化中保留下來。一個轉(zhuǎn)座子從侵入宿主基因組到在這個宿主基因組穩(wěn)定下來一般要經(jīng)歷4個階段：1) 外源轉(zhuǎn)座子的侵入；2) 高頻轉(zhuǎn)座以擴(kuò)增拷貝數(shù)；3) 通過物種雜交在群體里廣泛擴(kuò)散，大量轉(zhuǎn)座子積累點(diǎn)突變和插入/缺失突變喪失活性；4) 通過轉(zhuǎn)座子的隨機(jī)丟失，宿主基因組和轉(zhuǎn)座子達(dá)到生態(tài)平衡。處在第2) 階段的轉(zhuǎn)座子活性最強(qiáng)，基因組鑒定的轉(zhuǎn)座子大部分處在3) 或 4) 階段，積累了或多或少的突變，部分或全部喪失了轉(zhuǎn)座能力，成為低活性或非活性的轉(zhuǎn)座子“化石”[8-10]。但是突變發(fā)生是隨機(jī)的，利用大量克隆的轉(zhuǎn)座子，借助生物信息的技術(shù)和手段，可以檢測出突變發(fā)生的位點(diǎn)和類型，結(jié)合分子生物學(xué)的技術(shù)和手段，構(gòu)建和再現(xiàn)第2) 階段的高活性轉(zhuǎn)座子。高活性轉(zhuǎn)座子再通過人工優(yōu)化組合，構(gòu)建出自然不存在的超活性轉(zhuǎn)座子。

目前人工優(yōu)化轉(zhuǎn)座子主要應(yīng)用在 DNA轉(zhuǎn)座子上，通過蛋白質(zhì)工程的手段改造DNA轉(zhuǎn)座子的轉(zhuǎn)座酶，獲得高催化活性的轉(zhuǎn)座酶是人工構(gòu)建超高活性的轉(zhuǎn)座子的主要途徑。DNA轉(zhuǎn)座酶一般由2部分組成：N端的DNA 結(jié)合域 (DNA binding domain, DBD)，C端催化作用的功能區(qū) (Catalysis domain)。MLE (Mariner-like element, MLEs)轉(zhuǎn)座酶 (圖 1)編碼序列長度一般為 900?3 000 bp(動物轉(zhuǎn)座酶一般沒有內(nèi)含子，植物轉(zhuǎn)座酶一般含 2?4個內(nèi)含子)，由 DNA結(jié)合域和轉(zhuǎn)座催化域組成。DNA結(jié)合域負(fù)責(zé)識別和結(jié)合 TIRs，含有 1?2個螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋結(jié)構(gòu)域(Helix-turnhelix，HTH)。催化域有DD(34/37/39)D保守結(jié)構(gòu)域 (動物為 DD34/37D；植物為 DD39D，在陽離子 Mg2+或 Mn2+協(xié)助下，既能催化僅包括TIRs及側(cè)翼序列的短片段DNA轉(zhuǎn)座，也能催化攜帶有目的基因 (如抗性基因)長片段DNA的轉(zhuǎn)座[11]。

圖1 MLE轉(zhuǎn)座酶基因的結(jié)構(gòu)圖[11]Fig. 1 Domains of MLE transposase[11].

目前，運(yùn)用蛋白質(zhì)工程和生物信息學(xué)結(jié)合的方法已經(jīng)成功改造多種轉(zhuǎn)座酶，如 Sleeping Beauty轉(zhuǎn)座酶(SBase)、PiggyBac轉(zhuǎn)座酶(PBase)、Mos1轉(zhuǎn)座酶、Himar1轉(zhuǎn)座酶、Hsmar1轉(zhuǎn)座酶以及玉米中Activator轉(zhuǎn)座酶(AcTPase)、P轉(zhuǎn)座酶等，這里主要介紹上述幾種酶的人工構(gòu)建和改造。

1 活性轉(zhuǎn)座子的人工構(gòu)建

轉(zhuǎn)座子在生物體內(nèi)經(jīng)歷了漫長的進(jìn)化和突變，由于突變積累，大部分失去了轉(zhuǎn)座活性，需要人工構(gòu)建有活性的轉(zhuǎn)座子。一般采用生物信息學(xué)系統(tǒng)分析和蛋白質(zhì)工程相結(jié)合的方法來重新構(gòu)建活性的轉(zhuǎn)座酶，具體方法有：1) 同源重建：對相關(guān)的同源的轉(zhuǎn)座酶進(jìn)行同源比對分析，找到并分析它們的保守區(qū)域，從相關(guān)的轉(zhuǎn)座酶中導(dǎo)入小片段氨基酸，把相關(guān)轉(zhuǎn)座酶家族的保守氨基酸整合到這個轉(zhuǎn)座酶中；2) PCR定點(diǎn)誘變技術(shù)：用蛋白質(zhì)工程的手段定點(diǎn)突變選定的氨基酸區(qū)域和位點(diǎn)，以恢復(fù)轉(zhuǎn)座酶的催化活性。SB轉(zhuǎn)座子和 Hsmar1轉(zhuǎn)座子就是利用上述這兩種方法重新獲得活性[12-13]。

1997年Ivics等[12]用來自8個魚類品種中的12個失活的鮭魚亞科家族Tc1類轉(zhuǎn)座酶的序列，基于積累的系統(tǒng)發(fā)生數(shù)據(jù)，利用生物信息學(xué)的方法，經(jīng)過多重序列對比，找到了一個保守序列，并確定了保守區(qū)的蛋白序列以及DNA序列。激活轉(zhuǎn)座酶的具體步驟是，首先將兩個來源不同的片段互補(bǔ)拼接在一起，恢復(fù)一個完整的開放閱讀框 (SB1?SB3)，由于SB3多肽的序列有24個位置的氨基酸與保守序列不符，因而沒有轉(zhuǎn)座能力；隨后，通過PCR引入定點(diǎn)突變的方法一步步地改變編碼框的序列 (SB4?SB10)，直至與保守序列相符，最終完成編碼 340個氨基酸的SB10轉(zhuǎn)座酶的基因，使沉睡了1 000多萬年的轉(zhuǎn)座子再次被激活而具有轉(zhuǎn)座能力，因此被命名為“睡美人”。SB轉(zhuǎn)座子在包括人在內(nèi)的脊椎動物的組織中是有活性的，同時在魚、蛙、小鼠和大鼠中也具有活性，可以用作轉(zhuǎn)基因的載體和基因治療的工具[14-15]。

Hsmar1是一種古老的Mariner轉(zhuǎn)座子，在5 000萬年前進(jìn)入到靈長類基因譜系中。由于長期的突變積累，Hsmar1不能編碼有活性的轉(zhuǎn)座酶。2007年Miskey等[13]利用生物信息學(xué)的系統(tǒng)方法來重建古老的Hsmar1轉(zhuǎn)座酶基因，并命名為Hsmar1-Ra，改造方法類似于Sleeping Beauty轉(zhuǎn)座酶。具體步驟是，通過與傘樹亞科幾種轉(zhuǎn)座酶的氨基酸序列比較，把同源的轉(zhuǎn)座酶的保守區(qū)域的氨基酸整合到Hsmar1轉(zhuǎn)座酶基因中；同時依據(jù)從黑猩猩體內(nèi)獲得的同源的Hsmar1轉(zhuǎn)座酶基因，利用定點(diǎn)突變技術(shù)突變21個氨基酸得到轉(zhuǎn)座酶的共有序列；通過 TBLASTN尋找人類Hsmar1轉(zhuǎn)座酶類似的氨基酸序列，利用最大概率法重建古老的基因序列。將Hsmar1的轉(zhuǎn)座酶中非保守的氨基酸替換成 4個推測的保守的氨基酸 (C53R、P167S、L201V和 A219C)，在人Hela細(xì)胞、魚胚胎中進(jìn)行轉(zhuǎn)座試驗(yàn)，通過瓊脂糖凝膠發(fā)現(xiàn)了在人Hela細(xì)胞和魚胚胎中轉(zhuǎn)座的片段[16]，證明了人工構(gòu)建的 Hsmar1-Ra可以在包括人在內(nèi)的脊椎動物細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)座。

2 超活性轉(zhuǎn)座子的人工優(yōu)化

為了進(jìn)一步提高轉(zhuǎn)座子的轉(zhuǎn)座活性，科學(xué)家們優(yōu)化轉(zhuǎn)座酶的氨基酸組成，人工改造出自然界不存在的超活性的轉(zhuǎn)座子。主要方法有通過專一性位點(diǎn)突變獲得高活性的轉(zhuǎn)座酶突變體，利用PCR隨機(jī)突變技術(shù)構(gòu)建轉(zhuǎn)座酶突變體庫篩選出高催化能力的轉(zhuǎn)座酶。

2.1 專一性位點(diǎn)突變

專一性位點(diǎn)突變又稱特異性位點(diǎn)突變，主要運(yùn)用PCR技術(shù)產(chǎn)生突變。

Himar1是從黑角蠅屬中分離得到的Mariner類轉(zhuǎn)座子，是原核生物基因分析的主要工具之一。而且在人類的細(xì)胞中也有活性，但轉(zhuǎn)座效率較低。1999年 Lampe等[17]利用易錯PCR獲得Himar1的9個單位點(diǎn)突變體，突變區(qū)域集中在 HTH 結(jié)構(gòu)和催化作用功能區(qū)(DD34D)。有5個位點(diǎn)的突變能增加轉(zhuǎn)座酶的活性，其中3個位點(diǎn)的突變活性較高，H267R能使轉(zhuǎn)座酶的活性提高約10倍，Q131R和E137K分別使轉(zhuǎn)座酶的活性提高約4倍和20倍，把這兩個位點(diǎn)結(jié)合起來則轉(zhuǎn)座酶的活性提高約為野生型的50倍?；赒131R和E137K結(jié)合的轉(zhuǎn)座酶突變體可以作為基因治療的有效載體[18]。

Mos1 轉(zhuǎn)座子是從馬里塔尼亞果蠅D. mauritiana中發(fā)現(xiàn)的Mariner類天然活性轉(zhuǎn)座子，已經(jīng)開發(fā)成埃及伊蚊Aedes aegypti、利什曼蟲Leishmania major等動物的轉(zhuǎn)基因工具，為了提高M(jìn)os1轉(zhuǎn)座酶的活性，2009年Germon等[19]依據(jù)對Himar1突變體位點(diǎn)的研究，在Mos1上選擇同一位點(diǎn)或相近位點(diǎn)進(jìn)行單點(diǎn)突變。突變位點(diǎn)位于二聚作用功能區(qū)、轉(zhuǎn)角-螺旋-轉(zhuǎn)角區(qū)域、催化作用功能區(qū) (DD34D)，Mos1突變了12個位點(diǎn)，用大腸桿菌篩選系統(tǒng)共獲得5種高活性的突變類型 (F53Y、Q91R、E137K、T216A和Y237C)，分別將這5個突變位點(diǎn)進(jìn)行兩個及兩個以上的隨機(jī)組合，得到活性比野生型至少高20倍的7種組合突變，這些突變組合都包含T216A單點(diǎn)突變。對于 FET (F53Y-E137KT216A)這種突變類型，發(fā)現(xiàn)它的活性為野生型的 200–800倍，甚至更高，但是過高的轉(zhuǎn)座活性會產(chǎn)生細(xì)胞毒性，導(dǎo)致細(xì)胞死亡[19-20]。

PiggyBac轉(zhuǎn)座子是由粉紋夜蛾Trichoplusia ni基因組中分離的轉(zhuǎn)座子家族，在哺乳動物細(xì)胞中也能發(fā)生轉(zhuǎn)座。PiggyBac轉(zhuǎn)座子作為哺乳動物基因分析的工具，能精確切除而不產(chǎn)生足跡，不影響基因組的整合，廣泛應(yīng)用于插入誘變和基因治療[21]。依據(jù)進(jìn)化分析和先前序列的重建，替換專一性的位點(diǎn)M282V，其轉(zhuǎn)座切除活性提高到野生型的 2–7倍[22]。P轉(zhuǎn)座子從果蠅中分離得到的，已經(jīng)開發(fā)成果蠅的遺傳學(xué)分析工具和轉(zhuǎn)基因的載體[23]。P轉(zhuǎn)座酶包含10個同源的磷酸化位點(diǎn)，這10個位點(diǎn)中，有2個位點(diǎn)的取代對轉(zhuǎn)座酶的活性無影響，其中 7個位點(diǎn)的取代會降低轉(zhuǎn)座酶的活性，只有S129A產(chǎn)生超活性的轉(zhuǎn)座活動，轉(zhuǎn)座活性約是野生型的1.72 倍[24]。

Ac/Ds系統(tǒng)因其在眾多植物種類中都有轉(zhuǎn)座活性，且優(yōu)先插入編碼序列內(nèi)部或附近，或插入基因連鎖位點(diǎn)使其在植物遺傳分析中得到廣泛應(yīng)用[25]。為了提高 Ac/Ds系統(tǒng)轉(zhuǎn)座活性，2012年 Lazarow等[26]通過定點(diǎn)突變技術(shù)對AcTPase的氨基酸進(jìn)行優(yōu)化，選擇了 E249A、E336A、D459A和D545A (丙氨酸不攜帶有作用的側(cè)鏈)替換，單個位點(diǎn)的突變切除頻率是野生型的 3–5倍。兩個位點(diǎn)組合突變 E249A/E336A和 D459A/D545A突變頻率是野生型的約 11和 13倍，4個氨基酸殘基同時發(fā)生替代(即AcTPase4x)則可使 Ds切除活性在酵母細(xì)胞中增強(qiáng) 100倍，同時重新插入的頻率不變 (57%)，在擬南芥中催化 Ds的切除活性為野生型的6倍。

2.2 隨機(jī)突變獲得超活性轉(zhuǎn)座酶

通過對轉(zhuǎn)座酶的隨機(jī)突變，獲得轉(zhuǎn)座酶的突變體庫，也是獲得超活性轉(zhuǎn)座酶的重要途徑。

2009年 Mates等[15]將 SB轉(zhuǎn)座酶通過同源比對，共獲得了41個能提高轉(zhuǎn)座酶活性的氨基酸突變位點(diǎn)。用核酸酶把含有這41個氨基酸突變位點(diǎn)的突變體切成約300 bp大小的片段，然后再隨機(jī)切成30?70 bp的片段。用PCR技術(shù)隨機(jī)重組不重疊的片段，從而得到41突變位點(diǎn)隨機(jī)組合轉(zhuǎn)座酶突變體庫。通過篩選獲得的轉(zhuǎn)座酶活性提高至原來100倍以上的 SB100X轉(zhuǎn)座酶，SB100X轉(zhuǎn)座酶是 6個突變位點(diǎn)的組合(K14R、K33A、F115H、214DAVQ、M243H、T314N)。得到的SB100X轉(zhuǎn)座酶在人類的Hela細(xì)胞和其他脊椎動物的細(xì)胞中進(jìn)行了轉(zhuǎn)座實(shí)驗(yàn)。在人類的Hela細(xì)胞中SB100X的轉(zhuǎn)基因效率達(dá)到了35%，比野生型SB在動員染色體元件轉(zhuǎn)座效率高至120倍，SB100X比野生型SB產(chǎn)生多3–5倍的插入位點(diǎn)。SB100X轉(zhuǎn)座酶在斑馬魚 Barchydanio rerio胚胎中瞬時轉(zhuǎn)基因的效率達(dá)到了原來的 8倍[27]。轉(zhuǎn)座酶人工構(gòu)建及改造的詳細(xì)信息歸納在表1中。

3 插入特性的人工改造

通過人工重新構(gòu)建和優(yōu)化獲得了超活性的轉(zhuǎn)座酶，極大地提高了轉(zhuǎn)座子的轉(zhuǎn)座活性。但轉(zhuǎn)座子插入到基因的編碼區(qū)，會致使基因突變或基因表達(dá)模式的改變，產(chǎn)生細(xì)胞毒性。例如，SB100X在斑馬魚胚胎中檢測到了相比較原先的 8倍瞬時轉(zhuǎn)基因效率，但同時會形成有缺陷的胚胎，具有轉(zhuǎn)座插入毒性[27]，存在潛在的安全問題。因此，通過對轉(zhuǎn)座酶進(jìn)行改造和修飾，人為地調(diào)控轉(zhuǎn)座子插入到非基因區(qū)，不影響基因的表達(dá)是目前轉(zhuǎn)座子人工改造的另一個重要工作。

3.1 利用 C2H2(Cys2His2)鋅指蛋白定位轉(zhuǎn)座子的插入

C2H2 (Cys2His2)型的鋅指蛋白是一類真核生物轉(zhuǎn)錄因子重要結(jié)構(gòu)域，其主要作用是與DNA 結(jié)合，指導(dǎo)酶與模板的正確結(jié)合，活化RNA 聚合酶，以便有效地啟動轉(zhuǎn)錄[28]。利用C2H2型的鋅指蛋白與轉(zhuǎn)座酶融合，可以調(diào)控轉(zhuǎn)座子的插入位點(diǎn)。

六指鋅指-E2C是人工構(gòu)建，應(yīng)用廣泛的一個 C2H2 (Cys2His2)型的鋅指蛋白，可以與人類erbB-2基因(紅細(xì)胞白血病病毒癌基因同源物2，erythroblastic leukemia viral oncogene homolog 2)啟動子域的一個獨(dú)特的18 bp (GGGGCCGGA GCCGCAGTG)位點(diǎn)結(jié)合。鋅指域分別被融合到SB轉(zhuǎn)座酶的N端或者C端或者與SB轉(zhuǎn)座酶N端的57個氨基酸的螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋區(qū)域 (N57)，來定位 SB轉(zhuǎn)座子在人類基因組的插入。在人Hela細(xì)胞中，當(dāng)E2C融合到SB轉(zhuǎn)座酶N端，E2C鋅指蛋白引導(dǎo)SB轉(zhuǎn)座子插入到人類基因組erbB-2啟動子區(qū)域的E2C結(jié)合位點(diǎn)上游179 bp處，插入頻率為1.44%；當(dāng)E2C融合到SB轉(zhuǎn)座酶C端和N57區(qū)域，E2C鋅指蛋白引導(dǎo)SB轉(zhuǎn)座子插入到人類基因組 erbB-2啟動子區(qū)域的E2C結(jié)合位點(diǎn)上游 732 bp處，插入頻率為1.45%；但是在E2C結(jié)合位點(diǎn)周圍20 kb卻檢測不到任何的插入[29]。

表1 轉(zhuǎn)座酶人工構(gòu)建及改造Table 1 Artificial reconstruction and modification of transpsoases

鋅指結(jié)構(gòu)可能是進(jìn)行有針對性轉(zhuǎn)座插入的合適轉(zhuǎn)座引導(dǎo)物，但以E2C為基礎(chǔ)的轉(zhuǎn)座系統(tǒng)，其轉(zhuǎn)座效率較低，作為替代方案選擇人類的內(nèi)源性反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子LINE1作為潛在的SB定位目標(biāo)。LINE1在人類基因組中拷貝數(shù)高，富含AT，分布在基因貧乏的染色體區(qū)域。設(shè)計(jì)一個新的DNA結(jié)合域-鋅指蛋白B (Zinc finger B，ZF-B)，能識別LINE1反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子3'末端的18 bp序列(GCCATAAAAAATGATGAG)。當(dāng)ZF-B融合到SB100X轉(zhuǎn)座酶N端，ZF-B引導(dǎo)SB轉(zhuǎn)座子插入到人類的內(nèi)源性反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子LINE1中ZF-B結(jié)合位點(diǎn)周圍的400 bp區(qū)域，插入頻率為1.36%，是未融合的SB100X的轉(zhuǎn)座插入頻率的4倍；當(dāng)ZF-B融合到SB100X轉(zhuǎn)座酶的C端和N57區(qū)域，ZF-B引導(dǎo) SB轉(zhuǎn)座子插入到人類的內(nèi)源性反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子LINE1中ZF-B結(jié)合位點(diǎn)周圍的400 bp區(qū)域，插入頻率為0.82%，是未融合的SB100X的轉(zhuǎn)座插入頻率的2.4倍。在ZF-B結(jié)合位點(diǎn)周圍的20 kb區(qū)域，ZF-B融合到SB100X轉(zhuǎn)座酶N端或C端和N57區(qū)域的轉(zhuǎn)座插入頻率分別為10.69%和 10.05%[29]。

3.2 利用Gal4DBD轉(zhuǎn)座酶嵌合體定位轉(zhuǎn)座子的插入

Gal4是真核細(xì)胞普遍存在的轉(zhuǎn)錄激活因子，Gal4的DBD能識別基因啟動子的上游活性序列 (Upstream activating sequence，UAS)的17 bp長的一段序列，調(diào)控靶基因轉(zhuǎn)錄[30]?？茖W(xué)家們通過將轉(zhuǎn)座酶與 Gal4 DBD融合，利用GAL4 DBD與UAS序列定點(diǎn)結(jié)合來調(diào)控轉(zhuǎn)座子的插入。

2012年 Owens等[31]通過雙質(zhì)粒法分析了Gal4 DBD對PiggyBac轉(zhuǎn)座子插入位點(diǎn)的調(diào)控，受體質(zhì)粒含有氯霉素基因和一個含有 5個串聯(lián)的UAS位點(diǎn)，傳遞質(zhì)粒含有PB轉(zhuǎn)座酶。當(dāng)Gal4 DBD融合到PiggyBac轉(zhuǎn)座酶N端，有87%的N-Gal4 PB插入到UAS下游800 bp區(qū)域，其中有 47%的 N-Gal4 PB插入靠近 UAS上下游250bp區(qū)域，有39%的N-Gal4 PB插入U(xiǎn)AS位點(diǎn)250 bp上下游250 bp以內(nèi)。當(dāng)Gal4 DBD融合到PiggyBac轉(zhuǎn)座酶C端，有77%的C-PB Gal4的插入靠近UAS上下游800 bp的位點(diǎn)，其中有32% 的 C-Gal4PB插入在 UAS附近的 250 bp內(nèi)，而且 C-PB Gal4的插入位點(diǎn)表現(xiàn)出更加均勻的分布。無論N-Gal4 PB還是C-Gal4 PB蛋白都偏向于靠近UAS的位置插入。

3.3 利用病毒蛋白定位轉(zhuǎn)座子插入

基于腺病毒相關(guān)病毒(Adeno-associated virus, AAV)的基因治療的載體系統(tǒng)提供了作為基因運(yùn)載工具的許多有利條件[32]，該病毒顯示沒有致病性，能夠有效地轉(zhuǎn)化各種增殖和非增殖細(xì)胞[33]。AAV Report(Rep)蛋白對DNA的Rep識別序列(Report recognition sequences，RRSs)有特殊的結(jié)合活性，可以利用其特性來調(diào)控定位轉(zhuǎn)座子的插入。

Tol2轉(zhuǎn)座子是 hAT轉(zhuǎn)座子家族中的一員，首次在青鳉魚Oryzias latipes的基因組內(nèi)發(fā)現(xiàn)，已證實(shí)Tol2轉(zhuǎn)座子在斑馬魚、鼠、人等多種動物細(xì)胞中都具有轉(zhuǎn)座活性[34]。在人類細(xì)胞中的SB、PB和Tol2的整合位點(diǎn)分布圖表明，SB轉(zhuǎn)座位點(diǎn)隨機(jī)分布，PB和Tol2轉(zhuǎn)座位點(diǎn)不是隨機(jī)分布的，PB優(yōu)先整合到基因和轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)周圍的區(qū)域，而Tol2偏好整合到轉(zhuǎn)錄單位和轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)附近。2012年Ammar等[32]利用了AAV Rep蛋白特異性結(jié)合到RRS 的GAGC重復(fù)序列這一性質(zhì)，來定位PB和Tol2、SB這3個轉(zhuǎn)座子的整合。一個基于質(zhì)粒轉(zhuǎn)座實(shí)驗(yàn)顯示，Rep/ SB融和轉(zhuǎn)座酶的轉(zhuǎn)座插入到 RRS下游的 700 bp內(nèi)，占所有插入的30%，在目標(biāo)RRS附近插入頻率較野生型提高了 15倍。Rep/Tol2在 RRS附近的插入頻率是野生型的4倍。但是，Rep/PB轉(zhuǎn)座酶在RRS附近沒有明顯的轉(zhuǎn)座插入。轉(zhuǎn)座插入位點(diǎn)的人工改造詳細(xì)信息歸納在表2。

表2 轉(zhuǎn)座插入位點(diǎn)的人工改造Table 2 Artificial regulation of insertion sites based on transposase fusion

4 結(jié)語與展望

自 20世紀(jì) 40年代美國遺傳學(xué)家McClintock[1]首次在玉米中發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)座子 (Ac/Ds)以來，科學(xué)家們發(fā)現(xiàn)了多種類型的轉(zhuǎn)座子，它們廣泛存在于細(xì)菌、酵母和高等動植物基因組中[2-3]。轉(zhuǎn)座子是動植物基因組的重要組成部分，如在人基因組占45%[35]，在玉米Zea mays基因組中比例高達(dá) 85%以上[36]，在基因組進(jìn)化及生物多樣性形成過程中扮演著重要角色[13,37]。

隨著人們在分子水平上對轉(zhuǎn)座子結(jié)構(gòu)和功能認(rèn)識的不斷深入，一些來源植物的轉(zhuǎn)座子已被改造為轉(zhuǎn)座子標(biāo)簽，應(yīng)用于基因分析，如玉米的 Ac/Ds被應(yīng)用于多種植物如水稻 Oryza sativa[38]、大麥 Hordeum vulgare[39]、楊樹 Populus trichocarpa[40]等植物基因的克隆及突變體庫的構(gòu)建。一些來源動物的轉(zhuǎn)座子已被改造為基因轉(zhuǎn)化和基因治療的工具，如SB，可以在魚、小鼠和人等大多數(shù)脊椎動物的細(xì)胞將所攜帶的基因在動物體內(nèi)穩(wěn)定整合和長期表達(dá)[41]。這些使轉(zhuǎn)座子在基因治療及功能基因組學(xué)的研究等領(lǐng)域發(fā)揮重要的作用[42-43]?？傊?，近年來轉(zhuǎn)座子逐漸成為基因克隆、基因表達(dá)及其功能、生物多樣性及進(jìn)化研究的重要工具[6-7]。另一方面，由于隨機(jī)丟失和垂直失活效應(yīng)[8-10]，自然界基因組存在絕大部分轉(zhuǎn)座子喪失了轉(zhuǎn)座活性或轉(zhuǎn)座活性不高，通過生物信息學(xué)和蛋白質(zhì)工程方法改造和優(yōu)化轉(zhuǎn)座酶，提高其催化轉(zhuǎn)座的能力，人工調(diào)控轉(zhuǎn)座子的插入位點(diǎn)，更好地應(yīng)用于基因標(biāo)簽、基因轉(zhuǎn)化和基因治療是目前轉(zhuǎn)座子的開發(fā)和利用研究的主要方向。

本課題組一直致力于植物 Mariner類轉(zhuǎn)座子開發(fā)和利用。近幾年研究發(fā)現(xiàn)，Mariner類轉(zhuǎn)座子在植物基因組分布也非常廣泛[44]，具有結(jié)構(gòu)簡單、插入位點(diǎn)接近隨機(jī)和異源轉(zhuǎn)座率高等特點(diǎn)，在開發(fā)植物轉(zhuǎn)座標(biāo)簽方面表現(xiàn)出誘人的前景[45-46]。本課題組利用生物信息學(xué)和蛋白質(zhì)工程結(jié)合的方法來改造源竹類植物的 Mariner類轉(zhuǎn)座酶，目前在 63個竹種基因組克隆到 79個全長Mariner類轉(zhuǎn)座酶，發(fā)現(xiàn)它們結(jié)構(gòu)完整，序列保守，可能來源于進(jìn)化史上一次橫向傳遞(Horizontal transfer)事件，很可能具有轉(zhuǎn)座活性。取其中一個與79個全長Mariner類轉(zhuǎn)座酶的保守序列同源性最高的轉(zhuǎn)座酶，通過酵母轉(zhuǎn)座檢測系統(tǒng)發(fā)現(xiàn)該轉(zhuǎn)座酶的確可以催化轉(zhuǎn)座子跳躍[47-48]。利用定點(diǎn)突變技術(shù)對該轉(zhuǎn)座酶關(guān)鍵位點(diǎn)的非保守氨基酸殘基突變獲得相對于野生型 2–3倍高催化活性 (數(shù)據(jù)未發(fā)表)。利用來源竹子基因組高活性的 Mariner類轉(zhuǎn)座酶構(gòu)建植物首個 Mariner類轉(zhuǎn)座子標(biāo)簽系統(tǒng)的工作正在開展中。

[1]McClintock B. The origin and behavior of mutable loci in maize. Proc Natl Acad Sci USA, 1950,36(6): 3440–3455.

[2]Feschotte C, Pritham EJ. DNA Transposons and the evolution of eukaryotic genomes. Annu Rev Genet,2007, 41: 331–368.

[3]Schulman AH. Retrotransposon replication in plants. Curr Opin Virol, 2013, 3(6): 604–614.

[4]Morgante M, De PE, Radovic S. Transposable elements and the plant pan-genomes. Curr Opin Plant Biol, 2007, 10(2): 149–155.

[5]Rebollo R, Romanish MT, Mager DL.Transposable elements: an abundant and natural source of regulatory sequences for host genes.Annu Rev Genet, 2012, 16(46): 21–42.

[6]Ovcharenko OO, Rudas VA, Kuchuk MV. Plant transposable elements and their application in genetics and biotechnology. Tsitol Genet, 2006,40(4): 68–80.

[7]Feschotte C, Jiang N, Wessler SR. Plant transposable elements: Where genetics meets genomics. Nat Rev Genet, 2002, 3(5): 329–341.

[8]Miskey C, Izsvák Z, Kawakami K, et al. DNA transposons in vertebrate functional genomics. Cell Mol Life Sci, 2005, 62(6): 629–641.

[9]Lampe DJ, Walden KK, Robertson HM. Loss of transposase-DNA interaction may underlie the divergence of mariner family transposable elements and the ability of more than one mariner to occupy the same genome. Mol Biol Evol, 2001,18(6): 954–961.

[10]Gilbert C, Schaack S, Pace JK II, et al. A role for host-parasite interactions in the horizontal transfer of transposons across phyla. Nature, 2010,464(7293): 1347–1350.

[11]Benjamin B, Bigot Y, Corinne AG. Assembly of the Tc1 and mariner transposition initiation complexes depends on the origins of their transposase DNA binding domains. Genetica, 2007,130(2): 105–120.

[12]Ivics Z, Hackett PB, Plasterk RH, et al. Molecular reconstruction of Sleeping Beauty, a Tc1-like transposon from fish, and its transposition in human cells. Cell, 1997, 91(4): 501–510.

[13]Miskey C, Papp B, Mátés L, et al. The ancient mariner sails again: transposition of the human Hsmar1 element by a reconstructed transposase and activities of the SETMAR protein on transposon ends. Mol Cell Biol, 2007, 27(12): 4589–4600.

[14]Zayed H, Izsvak Z, Walisko O, et al. Development of hyperactive Sleeping Beauty transposon vectors by mutational analysis. Mol Ther, 2004, 9(2):292–304.

[15]Mates L, Chuah MK, Belay E, et al. Molecular evolution of a novel hyperactive Sleeping Beauty transposase enables robust stable gene transfer in vertebrates. Nat Genet, 2009, 41(6): 753–761.

[16]Claeys BC, Chalmers R. Transposition of the human Hsmar1 transposon: rate-limiting steps and the importance of the flanking TA dinucleotide in second strand cleavage. Nucleic Acids Res, 2010,38(1): 190–202.

[17]Lampe DJ, Akerley BJ, Rubin EJ, et al.Hyperactive transposase mutants of the Himar1 mariner transposon. Proc Natl Acad Sci USA,1999, 96(20): 11428–11433.

[18]Keravala A, Liu D, Lechman ER, et al. Hyperactive Himar1 transposase mediates transposition in cell culture and enhances gene expression in vivo. Hum Gene Ther, 2006, 17(10): 1006–1018.

[19]Germon S, Bouchet N, Casteret S, et al. Mariner Mos1 transposase optimization by rational mutagenesis. Genetica, 2009, 137(3): 265–276.

[20]Richardson JM, Dawson A, O'Hagan N, et al.Mechanism of Mos1 transposition: insights from structural analysis. EMBO J, 2006, 25(6):1324–1334.

[21]Ding S, Wu X, Li G, et al. Efficient transposition of the piggyBac (PB)transposon in mammalian cells and mice. Cell, 2005, 122(3): 473–483.

[22]Yusa K, Zhou L, Li MA, et al. A hyperactive piggyBac transposase for mammalian applications.Proc Natl Acad Sci USA, 2011, 108(4):1531–1536.

[23]Sonane M, Goyal R, Chowdhuri DK, et al.Enhanced efficiency of P-element mediated transgenesis in Drosophila: microinjection of DNA complexed with nanomaterial. Sci Rep, 2013,3(3408): 1–5.

[24]Beall EL, Mahoney MB, Rio DC. Identification and analysis of a hyperactive mutant form of Drosophila P-element transposase. Genetics, 2002,162(1): 217–227.

[25]Boon GH, Gong Z. Maize Ac/Ds transposon system leads to highly efficient germline transmission of transgenes in medaka (Oryzias latipes). Biochimie,2011, 93(10): 1858–1864.

[26]Lazarow K, Du ML, Weimer R, et al. A hyperactive transposase of the maize transposable element activator (Ac). Genetics, 2012, 191(3):747–756.

[27]Newman M, Lardelli M. A hyperactive sleeping beauty transposase enhances transgenesis in zebrafish embryos. BMC Res Notes, 2010, 3(1):282.

[28]Zhong Q, Zhao SH. The mechanism and application of zinc finger nucleases. HEREDITAS,2011, 33(2): 123–130 (in Chinese).鐘強(qiáng), 趙書紅. 鋅指蛋白核酸酶的作用原理及其應(yīng)用. 遺傳, 2011, 33(2): 123–130.

[29]Voigt K, Gogol DA, Miskey C, et al. Retargeting sleeping beauty transposon insertions by engineered zinc finger DNA-binding domains. Mol Ther, 2012, 20(10): 1852–1862.

[30]Li CF, Xia QY, Zhou ZY. Study of GAL4/UAS system in transgenic technology. Biotechnology，2006, 1(78): 78–81 (in Chinese).李春峰, 夏慶友, 周澤揚(yáng). GAL4/UAS系統(tǒng)在轉(zhuǎn)基因技術(shù)中的應(yīng)用研究進(jìn)展. 生物技術(shù), 2006,1(78):78–81.

[31]Owens JB, Urschitz J, Stoytchev I, et al. Chimeric piggyBac transposases for genomic targeting in human cells. Nucleic Acids Res, 2012, 40(14):6978–6991.

[32]Ammar I, Gogol DA, Miskey C, et al. Retargeting transposon insertions by the adeno-associated virus Rep protein. Nucleic Acids Res, 2012, 40(14):6693–6712.

[33]Grabundzija I, Irgang M, Mátés L, et al.Comparative analysis of transposable element vector systems in human cells. Mol Ther, 2010,18(6): 1200–1209.

[34]Urasaki A, Morvan G, Kawakami K. Functional dissection of the Tol2 transposable element identified the minimal cis-sequence and a highly repetitive sequence in the subterminal region essential for transposition. Genetics, 2006, 174(2):639–649.

[35]Cordaux R, Batzer MA. The impact of retrotransposons on human genome evolution. Nat Rev Genet, 2009, 10(10): 691–703.

[36]Schnable PS, Ware D, Fulton RS, et al. The B73 maize genome: complexity, diversity and dynamics. Science, 2009, 326(5956): 1112–1115.

[37]Venner S, Feschotte C, Biémont C. Dynamics of transposable elements: towards a community ecology of the genome. Trends Genet, 2009, 25(7):317–323.

[38]Qu S, Desai A, Wing R, et al. A versatile transposon-based activation tag vector system for functional genomics in cereals and other monocot plants. Plant Physiol, 2008, 146(1): 189–199.

[39]Ayliffe MA, Pallotta M, Langridge P, et al. A barley activation tagging system. Plant Mol Biol,2007, 64(3): 329–347.

[40]Fladung M, Polak O. Ac/Ds-transposon activation tagging in poplar: a powerful tool for gene discovery. BMC Genomics, 2012, 13(1): 61.

[41]Davis RP, Nemes C, Varga E, et al. Generation of induced pluripotent stem cells from human foetal fibroblasts using the Sleeping Beauty transposongene delivery system. Differentiation,2013, 86(1/2): 7–30.

[42]Vanden DT, Ivics Z, Izsvák Z, et al. Emerging potential of transposons for gene therapy and generation of induced pluripotent stem cells. Blood,2009, 114(8): 1461–1468.

[43]Ivics Z, Kaufman CD, Zayed H, et al. The Sleeping beauty transposable element: evolution, regulation and genetic applications. Curr Issues Mol Biol,2004, 6(1): 43–55.

[44]Feschotte C, Wessler SR. Mariner-like transposases are widespread and diverse in flowering plants.Proc Natl Acad Sci USA, 2002, 99(1): 280–285.

[45]Yang G, Weil CF, Wessler SR. A rice Tc1/Mariner-like element transposes in yeast. The Plant Cell, 2006, 18(10): 2469–2478.

[46]Yang G, Nagel DH, Feschotte C, et al. Tuned for transposition: molecular determinants underlying the hyperactivity of a Stowaway MITE. Science,2009, 325(5946): 1391–1394.

[47]Zhou MB, Lu JJ, Zhong H, et al. Distribution and polymorphism of mariner-like elements in the Bambusoideae subfamily. Plant Syst Evol, 2010,289: 1–11.

[48]Zhou MB, Zhong H, Tang DQ. Isolation and characterization of seventy-nine full-length mariner-like transposases in the Bambusoideae subfamily. J Plant Res, 2011, 124: 607–617.