饒犇+王亞平+李娜+周榮華+廖先清+劉芳+陳偉+張光陽+楊自文

摘要：為了得到巨大芽孢桿菌（Bacillus megaterium）發(fā)酵的最佳培養(yǎng)基，在單因子試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，應(yīng)用Plackett-Burman設(shè)計法對影響芽孢產(chǎn)量的基本培養(yǎng)基組分中的關(guān)鍵因子進(jìn)行了篩選，并進(jìn)一步采用響應(yīng)面分析法（RSM）對影響芽孢產(chǎn)量的關(guān)鍵因素最佳水平作了深入的研究。結(jié)果表明，影響巨大芽孢桿菌芽孢產(chǎn)量的關(guān)鍵因素是豆粕和淀粉的濃度。通過RSM的擬合和推算得到在豆粕和淀粉濃度分別為48.85和19.67 g/L時，此時模型預(yù)測發(fā)酵最佳產(chǎn)量為43.16×108 CFU/mL，驗(yàn)證值為42.2×108 CFU/mL，預(yù)測值與驗(yàn)證值之間吻合較好，比原始培養(yǎng)基提高了約10倍。

關(guān)鍵詞：巨大芽孢桿菌（Bacillus megaterium）；Plackett-Burman設(shè)計法；響應(yīng)面分析法（RSM）

中圖分類號：Q813.1 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2014）15-3539-03

Optimizing Fermentation Conditions of Bacillus megaterium

RAO Ben1，WANG Ya-ping2， LI Na3， ZHOU Rong-hua1，LIAO Xian-qing1，LIU Fang1，CHEN Wei1，ZHANG Guang-yang1，YANG Zi-wen1

（1.Biological Pesticide Engineering Research Center，Hubei Academy of Agricultural Sciences， Wuhan 430064，China；2.Key Lab of Industrial Biotechnology， Hubei University， Wuhan 430062，China；3. Department of Life Science and technology/Yunan Provincial Key lab of Crop Quality and Efficient Cultivation and Safety Control， Red River Insitute，Mengzi 661100，Yunan，China ）

Abstract： To obtain the optimal medium for producing Bacillus megaterium spore， statistical method was used to investigate the medium components for spore concentration and productivity by Bacillus megaterium. The Plackett-Burman design was used to evaluate the effects of six variables. The results showed that the optimal values of the two parameters determined by RSM were soya bean meal of 48.85 g/L and starch of 19.67 g/L. The spore production was predicted to be 43.16×108 CFU/mL， and the actual value was 42.2×108 CFU/mL. They were fitted well with 10 folds increase.

Key words： Bacillus megaterium； Plackett-Burman； response surface analysis methodology （RSM）

收稿日期：2013-11-05

基金項(xiàng)目：國家科技支撐計劃項(xiàng)目（2011BAD40B01）；湖北省農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新中心項(xiàng)目（2013NKYJJ21）

作者簡介：饒 犇（1983-），男，湖北孝感人，助理研究員，博士，主要從事發(fā)酵工程方面的研究，（電話）15623076968（電子信箱）

623253512@qq.com。

農(nóng)業(yè)生產(chǎn)長期過分依賴化學(xué)肥料和農(nóng)藥，已經(jīng)造成了農(nóng)田土質(zhì)和肥力下降，農(nóng)作物品質(zhì)降低，食品和地下水等環(huán)境污染也日趨嚴(yán)重。隨著生態(tài)農(nóng)業(yè)和綠色食品生產(chǎn)的興起和發(fā)展，加之我國大多數(shù)土壤中速效磷、鉀及其他一些養(yǎng)分的缺乏，微生物肥料作為生物技術(shù)發(fā)展和農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的一類重要肥源引起人們的重視。微生物肥料是指一類含有活微生物的特定制品，將它應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，能夠獲得特定的肥料供應(yīng)。

磷是植物三大營養(yǎng)元素之一，土壤含磷較多，能被植物直接利用的卻極少，絕大部分是以不溶性的無機(jī)磷或植物不能利用的有機(jī)磷形式存在。微生物通過產(chǎn)酸或產(chǎn)酶等作用可使這些無效形式的磷化物轉(zhuǎn)變?yōu)橹参锟衫玫酿B(yǎng)料。土壤中約半數(shù)的微生物可分解有機(jī)磷，其中應(yīng)用較多的是巨大芽孢桿菌[1-6]。

巨大芽孢桿菌可以用來生產(chǎn)解磷肥，具有很好的降解土壤中有機(jī)磷的功效，是生產(chǎn)生物有機(jī)肥的常用菌種，也是制作水體處理劑的常用菌種。為此，探索其培養(yǎng)條件和發(fā)酵工藝，可為工業(yè)化發(fā)酵生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。

本研究以實(shí)驗(yàn)室自行分離得到的巨大芽孢桿菌NRJD20121菌株為研究對象，對其培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件進(jìn)行Plackett-Burman試驗(yàn)，篩選出顯著的影響因子，然后通過響應(yīng)面試驗(yàn)組合設(shè)計，擬合出數(shù)學(xué)模型方程，從而找到最優(yōu)條件組合，并對其試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行評估，以期初步篩選出比較合適的培養(yǎng)基配方。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種 由實(shí)驗(yàn)室自行分離，經(jīng)鑒定為芽孢桿菌屬中的Bacillus megaterium，編號為NRJD20121。

1.1.2 培養(yǎng)基 固體培養(yǎng)基為LB培養(yǎng)基。種子培養(yǎng)基配方（g/L）：淀粉16，酵母抽提物4，K2HPO4 0.5，MgSO4 0.5；pH 7.0。發(fā)酵培養(yǎng)基配方（g/L）：淀粉15，豆粕25，KH2PO4 2，Na2HPO4 0.5，CaCO3 0.5，MgSO4 0.5，MnSO4 0.5。后期采用優(yōu)化后的配方。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 發(fā)酵培養(yǎng)條件 接種體積分?jǐn)?shù)為5%，發(fā)酵溫度為30 ℃，搖床轉(zhuǎn)速為200 r/min，發(fā)酵48 h。

1.2.2 Plackett-Burman試驗(yàn) 采用Minitab的Plackett-Burman兩水平法對培養(yǎng)基成分進(jìn)行考察，篩選影響生物量和芽孢產(chǎn)量的重要因素，確定最佳配方。以可溶性淀粉為碳源，以豆粕為氮源，設(shè)置豆粕濃度為X1、KH2PO4為X2、Na2HPO4為X3、淀粉為X4、CaCO3為X5、MgSO4為X6、MnSO4為X7（表1）。

1.2.3 最陡爬坡試驗(yàn) 根據(jù)Plackett-Burman試驗(yàn)得出的擬合方程安排最陡爬坡試驗(yàn)來確定因素取值中心點(diǎn)。擬合方程中各變量系數(shù)確定爬坡方向和變化步長，步長確定和試驗(yàn)條件相關(guān)。

1.2.4 中心組合設(shè)計和響應(yīng)面分析 對Plackett-Burman試驗(yàn)確定的因素，以最陡爬坡試驗(yàn)得到的中心點(diǎn)。根據(jù)中心組合設(shè)計結(jié)果來擬合數(shù)據(jù)，得到描述響應(yīng)值和自變量之間關(guān)系的二階模型，即：

Y=b0+biXj+bijXiXj+biiXi2+e

其中，Y是產(chǎn)物能力測量值，b0是b截距，bi是關(guān)鍵因素線性效果的系數(shù)，bii是關(guān)鍵因素的二次效應(yīng)的系數(shù)，bij是關(guān)鍵因素間交互作用的系數(shù)，Xi、Xj分別為各因子變量。

根據(jù)擬合的數(shù)學(xué)模型以及方差分析的結(jié)果，可以評價每個因子及其交互作用對過程的影響程度，利用響應(yīng)面圖和等高線圖直觀地描繪其結(jié)果，同時利用擬合的數(shù)學(xué)方程求解最優(yōu)的結(jié)果。

1.2.5 培養(yǎng)基優(yōu)化結(jié)果驗(yàn)證試驗(yàn) 用優(yōu)化后的培養(yǎng)基組分配制發(fā)酵培養(yǎng)基，以5%接種量接入裝液量為20 mL的500 mL三角瓶中，于30 ℃、200 r/min條件下培養(yǎng)30 h。發(fā)酵結(jié)束后測定發(fā)酵液中的芽孢量。

1.2.5 生物量和芽孢數(shù)測定 活菌數(shù)按常規(guī)平板計數(shù)法測定[7]，檢測芽孢數(shù)前，將菌液在80 ℃預(yù)處理20 min，再按照常規(guī)平板計數(shù)法測定[8，9]。

2 結(jié)果和討論

2.1 Plackett-Burman試驗(yàn)各因素參數(shù)的t-檢驗(yàn)分析結(jié)果

Plackett-Burman試驗(yàn)各因素參數(shù)的t-檢驗(yàn)分析結(jié)果見表2。由表2可知，淀粉和豆粕對巨大芽孢桿菌的生長和芽孢形成有顯著影響，可信度在95%以上。且兩者對芽孢形成的影響是正效應(yīng)。

2.2 最陡爬坡試驗(yàn)

最陡爬坡試驗(yàn)設(shè)計與結(jié)果見表3。由表3可得如下回歸方程：

Y=30.25+3.583 3X1+0.583 3X2-0.250 0X3+1.083 3X4-0.583 3X5+0.750 0X6-0.583 3X7

該方程擬合的R2=0.967 4，此多項(xiàng)式方程能很好地模擬和解釋Plackett-Burman的試驗(yàn)結(jié)果。

2.3 中心組合設(shè)計試驗(yàn)

根據(jù)Plackett-Burman試驗(yàn)可知，影響巨大芽孢桿菌芽孢產(chǎn)量的兩個重要因素分別是可溶性淀粉和豆粕。根據(jù)中心優(yōu)化組合方法，設(shè)計了2因素5水平的響應(yīng)面分析，試驗(yàn)設(shè)計見表4。由表4可知，開始時巨大芽孢桿菌芽孢產(chǎn)量隨著豆粕與淀粉濃度的升高而增加，在步移進(jìn)行至第三步時達(dá)到最高點(diǎn)，之后巨大芽孢桿菌芽孢產(chǎn)量開始下降。步移最高點(diǎn)時豆粕與淀粉的濃度分別為45 g/L和21 g/L，此點(diǎn)被用作下一步響應(yīng)面分析的中心點(diǎn)。

以可溶性淀粉和豆粕為自變量，以巨大芽孢桿菌的芽孢數(shù)為響應(yīng)值，根據(jù)分析結(jié)果得到的二次多項(xiàng)式回歸方程為：

Y=-676.546+9.442 65X1+49.778 7X2-0.079 74X12

-1.163 9X22-0.083 333X1X2

其中，Y為響應(yīng)值，X1為豆粕濃度，X2為淀粉濃度。

回歸方程各項(xiàng)方差分析表明，方程一次項(xiàng)和二次項(xiàng)X1和X2的P值均小于0.05，說明影響顯著。失擬項(xiàng)P=0.464>0.1，無失擬現(xiàn)象?；貧w方程的R2=0.997 4，調(diào)整值為0.995 5，說明回歸方程對試驗(yàn)結(jié)果具有較好的擬合能力。

利用Minitab軟件對回歸模型進(jìn)行響應(yīng)面分析，考察所擬合響應(yīng)面的形狀，得到各響應(yīng)面立體分析圖和相應(yīng)等高圖，見圖1和圖2。軟件分析可知該模型具有最大值，利用Minitab軟件響應(yīng)優(yōu)化器進(jìn)行計算可得，最大值處X1=48.85 g/L，X2=19.67 g/L，在此條件下理論預(yù)測得到的值為43.16×108 CFU/mL。

2.4 最佳培養(yǎng)基的驗(yàn)證

為了確定試驗(yàn)結(jié)果的可靠性，對上述優(yōu)化條件進(jìn)行了驗(yàn)證試驗(yàn)，共做了3組平行試驗(yàn)，結(jié)果測得巨大芽孢桿菌的芽孢數(shù)為42.2×108 CFU/mL，與預(yù)測值十分接近。

3 小結(jié)與討論

對巨大芽孢桿菌產(chǎn)芽孢培養(yǎng)基進(jìn)行了優(yōu)化研究，得到最佳培養(yǎng)基配方（g/mL）：淀粉19.67、豆粕48.85、KH2PO4 2、Na2HPO4 0.5、CaCO3 0.5、MgSO4 0.5、MnSO4 0.5，在此條件下，巨大芽孢桿菌生成芽孢的理論最高產(chǎn)量為43.16×108 CFU/mL，驗(yàn)證試驗(yàn)中最高值為42.2×108 CFU/mL，與理論預(yù)測相符，與優(yōu)化前相比產(chǎn)量提高了10倍。

參考文獻(xiàn)：

[1] 龍 蘇，李法峰，陳 明，等.固氮球形芽孢桿菌與巨大芽孢桿菌的混合增效作用[J].核農(nóng)學(xué)報，2000，14（6）：337-341.

[2] 連 賓.硅酸鹽細(xì)菌的解鉀作用研究[M].貴陽：貴州科技出版社，1998.

[3] 鐘傳青，黃為一.不同種類解磷微生物的溶磷效果及其磷酸酶活性的變化[J].土壤學(xué)報，2005，42（2）：285-293.

[4] SEN R， SWAMINATHAN T. Application of response surface methodology to evaluate the optimum environmental conditions for the enhanced production of surfactin[J]. Applied Microbiology and Biotechnology，1997，47（4）：358-363.

[5] SPINOSA M R， BRACCINI T， RICCA E， et al. On the fate of ingested Bacillus spores[J]. Research in Microbiology， 2000，151：361-368.

[6] 徐世榮，陳 驤，吳云鵬. 細(xì)菌芽孢形成機(jī)制在微生態(tài)制劑生產(chǎn)中的應(yīng)用。食品與生物技術(shù)學(xué)報，2007，26（4）：121-126.

[7] 周德慶.微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)手冊[M].上海：上海科學(xué)技術(shù)出版社，1986.

[8] 杜連祥.工業(yè)微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)[M].天津：天津科學(xué)技術(shù)出版社，1992.

[9] 沈 萍，范秀容，李廣武.微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)[M].北京：高等教育出版社，1999.

1.1.2 培養(yǎng)基 固體培養(yǎng)基為LB培養(yǎng)基。種子培養(yǎng)基配方（g/L）：淀粉16，酵母抽提物4，K2HPO4 0.5，MgSO4 0.5；pH 7.0。發(fā)酵培養(yǎng)基配方（g/L）：淀粉15，豆粕25，KH2PO4 2，Na2HPO4 0.5，CaCO3 0.5，MgSO4 0.5，MnSO4 0.5。后期采用優(yōu)化后的配方。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 發(fā)酵培養(yǎng)條件 接種體積分?jǐn)?shù)為5%，發(fā)酵溫度為30 ℃，搖床轉(zhuǎn)速為200 r/min，發(fā)酵48 h。

1.2.2 Plackett-Burman試驗(yàn) 采用Minitab的Plackett-Burman兩水平法對培養(yǎng)基成分進(jìn)行考察，篩選影響生物量和芽孢產(chǎn)量的重要因素，確定最佳配方。以可溶性淀粉為碳源，以豆粕為氮源，設(shè)置豆粕濃度為X1、KH2PO4為X2、Na2HPO4為X3、淀粉為X4、CaCO3為X5、MgSO4為X6、MnSO4為X7（表1）。

1.2.3 最陡爬坡試驗(yàn) 根據(jù)Plackett-Burman試驗(yàn)得出的擬合方程安排最陡爬坡試驗(yàn)來確定因素取值中心點(diǎn)。擬合方程中各變量系數(shù)確定爬坡方向和變化步長，步長確定和試驗(yàn)條件相關(guān)。

1.2.4 中心組合設(shè)計和響應(yīng)面分析 對Plackett-Burman試驗(yàn)確定的因素，以最陡爬坡試驗(yàn)得到的中心點(diǎn)。根據(jù)中心組合設(shè)計結(jié)果來擬合數(shù)據(jù)，得到描述響應(yīng)值和自變量之間關(guān)系的二階模型，即：

Y=b0+biXj+bijXiXj+biiXi2+e

其中，Y是產(chǎn)物能力測量值，b0是b截距，bi是關(guān)鍵因素線性效果的系數(shù)，bii是關(guān)鍵因素的二次效應(yīng)的系數(shù)，bij是關(guān)鍵因素間交互作用的系數(shù)，Xi、Xj分別為各因子變量。

根據(jù)擬合的數(shù)學(xué)模型以及方差分析的結(jié)果，可以評價每個因子及其交互作用對過程的影響程度，利用響應(yīng)面圖和等高線圖直觀地描繪其結(jié)果，同時利用擬合的數(shù)學(xué)方程求解最優(yōu)的結(jié)果。

1.2.5 培養(yǎng)基優(yōu)化結(jié)果驗(yàn)證試驗(yàn) 用優(yōu)化后的培養(yǎng)基組分配制發(fā)酵培養(yǎng)基，以5%接種量接入裝液量為20 mL的500 mL三角瓶中，于30 ℃、200 r/min條件下培養(yǎng)30 h。發(fā)酵結(jié)束后測定發(fā)酵液中的芽孢量。

1.2.5 生物量和芽孢數(shù)測定 活菌數(shù)按常規(guī)平板計數(shù)法測定[7]，檢測芽孢數(shù)前，將菌液在80 ℃預(yù)處理20 min，再按照常規(guī)平板計數(shù)法測定[8，9]。

2 結(jié)果和討論

2.1 Plackett-Burman試驗(yàn)各因素參數(shù)的t-檢驗(yàn)分析結(jié)果

Plackett-Burman試驗(yàn)各因素參數(shù)的t-檢驗(yàn)分析結(jié)果見表2。由表2可知，淀粉和豆粕對巨大芽孢桿菌的生長和芽孢形成有顯著影響，可信度在95%以上。且兩者對芽孢形成的影響是正效應(yīng)。

2.2 最陡爬坡試驗(yàn)

最陡爬坡試驗(yàn)設(shè)計與結(jié)果見表3。由表3可得如下回歸方程：

Y=30.25+3.583 3X1+0.583 3X2-0.250 0X3+1.083 3X4-0.583 3X5+0.750 0X6-0.583 3X7

該方程擬合的R2=0.967 4，此多項(xiàng)式方程能很好地模擬和解釋Plackett-Burman的試驗(yàn)結(jié)果。

2.3 中心組合設(shè)計試驗(yàn)

根據(jù)Plackett-Burman試驗(yàn)可知，影響巨大芽孢桿菌芽孢產(chǎn)量的兩個重要因素分別是可溶性淀粉和豆粕。根據(jù)中心優(yōu)化組合方法，設(shè)計了2因素5水平的響應(yīng)面分析，試驗(yàn)設(shè)計見表4。由表4可知，開始時巨大芽孢桿菌芽孢產(chǎn)量隨著豆粕與淀粉濃度的升高而增加，在步移進(jìn)行至第三步時達(dá)到最高點(diǎn)，之后巨大芽孢桿菌芽孢產(chǎn)量開始下降。步移最高點(diǎn)時豆粕與淀粉的濃度分別為45 g/L和21 g/L，此點(diǎn)被用作下一步響應(yīng)面分析的中心點(diǎn)。

以可溶性淀粉和豆粕為自變量，以巨大芽孢桿菌的芽孢數(shù)為響應(yīng)值，根據(jù)分析結(jié)果得到的二次多項(xiàng)式回歸方程為：

Y=-676.546+9.442 65X1+49.778 7X2-0.079 74X12

-1.163 9X22-0.083 333X1X2

其中，Y為響應(yīng)值，X1為豆粕濃度，X2為淀粉濃度。

回歸方程各項(xiàng)方差分析表明，方程一次項(xiàng)和二次項(xiàng)X1和X2的P值均小于0.05，說明影響顯著。失擬項(xiàng)P=0.464>0.1，無失擬現(xiàn)象?；貧w方程的R2=0.997 4，調(diào)整值為0.995 5，說明回歸方程對試驗(yàn)結(jié)果具有較好的擬合能力。

利用Minitab軟件對回歸模型進(jìn)行響應(yīng)面分析，考察所擬合響應(yīng)面的形狀，得到各響應(yīng)面立體分析圖和相應(yīng)等高圖，見圖1和圖2。軟件分析可知該模型具有最大值，利用Minitab軟件響應(yīng)優(yōu)化器進(jìn)行計算可得，最大值處X1=48.85 g/L，X2=19.67 g/L，在此條件下理論預(yù)測得到的值為43.16×108 CFU/mL。

2.4 最佳培養(yǎng)基的驗(yàn)證

為了確定試驗(yàn)結(jié)果的可靠性，對上述優(yōu)化條件進(jìn)行了驗(yàn)證試驗(yàn)，共做了3組平行試驗(yàn)，結(jié)果測得巨大芽孢桿菌的芽孢數(shù)為42.2×108 CFU/mL，與預(yù)測值十分接近。

3 小結(jié)與討論

對巨大芽孢桿菌產(chǎn)芽孢培養(yǎng)基進(jìn)行了優(yōu)化研究，得到最佳培養(yǎng)基配方（g/mL）：淀粉19.67、豆粕48.85、KH2PO4 2、Na2HPO4 0.5、CaCO3 0.5、MgSO4 0.5、MnSO4 0.5，在此條件下，巨大芽孢桿菌生成芽孢的理論最高產(chǎn)量為43.16×108 CFU/mL，驗(yàn)證試驗(yàn)中最高值為42.2×108 CFU/mL，與理論預(yù)測相符，與優(yōu)化前相比產(chǎn)量提高了10倍。

參考文獻(xiàn)：

[1] 龍 蘇，李法峰，陳 明，等.固氮球形芽孢桿菌與巨大芽孢桿菌的混合增效作用[J].核農(nóng)學(xué)報，2000，14（6）：337-341.

[2] 連 賓.硅酸鹽細(xì)菌的解鉀作用研究[M].貴陽：貴州科技出版社，1998.

[3] 鐘傳青，黃為一.不同種類解磷微生物的溶磷效果及其磷酸酶活性的變化[J].土壤學(xué)報，2005，42（2）：285-293.

[4] SEN R， SWAMINATHAN T. Application of response surface methodology to evaluate the optimum environmental conditions for the enhanced production of surfactin[J]. Applied Microbiology and Biotechnology，1997，47（4）：358-363.

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[6] 徐世榮，陳 驤，吳云鵬. 細(xì)菌芽孢形成機(jī)制在微生態(tài)制劑生產(chǎn)中的應(yīng)用。食品與生物技術(shù)學(xué)報，2007，26（4）：121-126.

[7] 周德慶.微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)手冊[M].上海：上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，1986.

[8] 杜連祥.工業(yè)微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)[M].天津：天津科學(xué)技術(shù)出版社，1992.

[9] 沈 萍，范秀容，李廣武.微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)[M].北京：高等教育出版社，1999.

1.1.2 培養(yǎng)基 固體培養(yǎng)基為LB培養(yǎng)基。種子培養(yǎng)基配方（g/L）：淀粉16，酵母抽提物4，K2HPO4 0.5，MgSO4 0.5；pH 7.0。發(fā)酵培養(yǎng)基配方（g/L）：淀粉15，豆粕25，KH2PO4 2，Na2HPO4 0.5，CaCO3 0.5，MgSO4 0.5，MnSO4 0.5。后期采用優(yōu)化后的配方。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 發(fā)酵培養(yǎng)條件 接種體積分?jǐn)?shù)為5%，發(fā)酵溫度為30 ℃，搖床轉(zhuǎn)速為200 r/min，發(fā)酵48 h。

1.2.2 Plackett-Burman試驗(yàn) 采用Minitab的Plackett-Burman兩水平法對培養(yǎng)基成分進(jìn)行考察，篩選影響生物量和芽孢產(chǎn)量的重要因素，確定最佳配方。以可溶性淀粉為碳源，以豆粕為氮源，設(shè)置豆粕濃度為X1、KH2PO4為X2、Na2HPO4為X3、淀粉為X4、CaCO3為X5、MgSO4為X6、MnSO4為X7（表1）。

1.2.3 最陡爬坡試驗(yàn) 根據(jù)Plackett-Burman試驗(yàn)得出的擬合方程安排最陡爬坡試驗(yàn)來確定因素取值中心點(diǎn)。擬合方程中各變量系數(shù)確定爬坡方向和變化步長，步長確定和試驗(yàn)條件相關(guān)。

1.2.4 中心組合設(shè)計和響應(yīng)面分析 對Plackett-Burman試驗(yàn)確定的因素，以最陡爬坡試驗(yàn)得到的中心點(diǎn)。根據(jù)中心組合設(shè)計結(jié)果來擬合數(shù)據(jù)，得到描述響應(yīng)值和自變量之間關(guān)系的二階模型，即：

Y=b0+biXj+bijXiXj+biiXi2+e

其中，Y是產(chǎn)物能力測量值，b0是b截距，bi是關(guān)鍵因素線性效果的系數(shù)，bii是關(guān)鍵因素的二次效應(yīng)的系數(shù)，bij是關(guān)鍵因素間交互作用的系數(shù)，Xi、Xj分別為各因子變量。

根據(jù)擬合的數(shù)學(xué)模型以及方差分析的結(jié)果，可以評價每個因子及其交互作用對過程的影響程度，利用響應(yīng)面圖和等高線圖直觀地描繪其結(jié)果，同時利用擬合的數(shù)學(xué)方程求解最優(yōu)的結(jié)果。

1.2.5 培養(yǎng)基優(yōu)化結(jié)果驗(yàn)證試驗(yàn) 用優(yōu)化后的培養(yǎng)基組分配制發(fā)酵培養(yǎng)基，以5%接種量接入裝液量為20 mL的500 mL三角瓶中，于30 ℃、200 r/min條件下培養(yǎng)30 h。發(fā)酵結(jié)束后測定發(fā)酵液中的芽孢量。

1.2.5 生物量和芽孢數(shù)測定 活菌數(shù)按常規(guī)平板計數(shù)法測定[7]，檢測芽孢數(shù)前，將菌液在80 ℃預(yù)處理20 min，再按照常規(guī)平板計數(shù)法測定[8，9]。

2 結(jié)果和討論

2.1 Plackett-Burman試驗(yàn)各因素參數(shù)的t-檢驗(yàn)分析結(jié)果

Plackett-Burman試驗(yàn)各因素參數(shù)的t-檢驗(yàn)分析結(jié)果見表2。由表2可知，淀粉和豆粕對巨大芽孢桿菌的生長和芽孢形成有顯著影響，可信度在95%以上。且兩者對芽孢形成的影響是正效應(yīng)。

2.2 最陡爬坡試驗(yàn)

最陡爬坡試驗(yàn)設(shè)計與結(jié)果見表3。由表3可得如下回歸方程：

Y=30.25+3.583 3X1+0.583 3X2-0.250 0X3+1.083 3X4-0.583 3X5+0.750 0X6-0.583 3X7

該方程擬合的R2=0.967 4，此多項(xiàng)式方程能很好地模擬和解釋Plackett-Burman的試驗(yàn)結(jié)果。

2.3 中心組合設(shè)計試驗(yàn)

根據(jù)Plackett-Burman試驗(yàn)可知，影響巨大芽孢桿菌芽孢產(chǎn)量的兩個重要因素分別是可溶性淀粉和豆粕。根據(jù)中心優(yōu)化組合方法，設(shè)計了2因素5水平的響應(yīng)面分析，試驗(yàn)設(shè)計見表4。由表4可知，開始時巨大芽孢桿菌芽孢產(chǎn)量隨著豆粕與淀粉濃度的升高而增加，在步移進(jìn)行至第三步時達(dá)到最高點(diǎn)，之后巨大芽孢桿菌芽孢產(chǎn)量開始下降。步移最高點(diǎn)時豆粕與淀粉的濃度分別為45 g/L和21 g/L，此點(diǎn)被用作下一步響應(yīng)面分析的中心點(diǎn)。

以可溶性淀粉和豆粕為自變量，以巨大芽孢桿菌的芽孢數(shù)為響應(yīng)值，根據(jù)分析結(jié)果得到的二次多項(xiàng)式回歸方程為：

Y=-676.546+9.442 65X1+49.778 7X2-0.079 74X12

-1.163 9X22-0.083 333X1X2

其中，Y為響應(yīng)值，X1為豆粕濃度，X2為淀粉濃度。

回歸方程各項(xiàng)方差分析表明，方程一次項(xiàng)和二次項(xiàng)X1和X2的P值均小于0.05，說明影響顯著。失擬項(xiàng)P=0.464>0.1，無失擬現(xiàn)象?；貧w方程的R2=0.997 4，調(diào)整值為0.995 5，說明回歸方程對試驗(yàn)結(jié)果具有較好的擬合能力。

利用Minitab軟件對回歸模型進(jìn)行響應(yīng)面分析，考察所擬合響應(yīng)面的形狀，得到各響應(yīng)面立體分析圖和相應(yīng)等高圖，見圖1和圖2。軟件分析可知該模型具有最大值，利用Minitab軟件響應(yīng)優(yōu)化器進(jìn)行計算可得，最大值處X1=48.85 g/L，X2=19.67 g/L，在此條件下理論預(yù)測得到的值為43.16×108 CFU/mL。

2.4 最佳培養(yǎng)基的驗(yàn)證

為了確定試驗(yàn)結(jié)果的可靠性，對上述優(yōu)化條件進(jìn)行了驗(yàn)證試驗(yàn)，共做了3組平行試驗(yàn)，結(jié)果測得巨大芽孢桿菌的芽孢數(shù)為42.2×108 CFU/mL，與預(yù)測值十分接近。

3 小結(jié)與討論

對巨大芽孢桿菌產(chǎn)芽孢培養(yǎng)基進(jìn)行了優(yōu)化研究，得到最佳培養(yǎng)基配方（g/mL）：淀粉19.67、豆粕48.85、KH2PO4 2、Na2HPO4 0.5、CaCO3 0.5、MgSO4 0.5、MnSO4 0.5，在此條件下，巨大芽孢桿菌生成芽孢的理論最高產(chǎn)量為43.16×108 CFU/mL，驗(yàn)證試驗(yàn)中最高值為42.2×108 CFU/mL，與理論預(yù)測相符，與優(yōu)化前相比產(chǎn)量提高了10倍。

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