廖冰潔+樊汶樵+周莉+張毅+陳弟詩+孫志芳+吳寶紅

摘要：在患“白內(nèi)障”棘腹蛙眼部、口腔和胃部分離到一株圓形或橢圓形、葡萄狀堆積的革蘭氏陽性菌，經(jīng)培養(yǎng)特性觀察和致病性實(shí)驗(yàn)，確定候選菌株CQWU201401為“白內(nèi)障”的病原；通過針對(duì)該菌株的生理生化特性鑒定和16S rDNA測(cè)序鑒定結(jié)果判定該候選菌株為金黃色葡萄球菌。采用藥敏紙片法對(duì)該菌株進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，在10種藥物中的僅對(duì)四環(huán)素有耐藥現(xiàn)象；針對(duì)該病原菌的分離鑒定和藥敏試驗(yàn)為臨床上防治該病提供了參考。

關(guān)鍵詞：棘腹蛙；“白內(nèi)障”；分離鑒定

中圖分類號(hào)：S947.2 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1007-273X（2014）08-0008-03

棘腹蛙（Paa boulengeri）又名石坑、石蛙等，是我國特有的珍稀兩棲動(dòng)物，主要分布在湖南、湖北、四川以及甘肅等省[1]。棘腹蛙個(gè)體大，肉質(zhì)鮮美，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高，是名貴的營(yíng)養(yǎng)滋補(bǔ)食品[2，3]。由于人為濫捕、水體污染、生態(tài)環(huán)境破壞等因素，野生棘腹蛙資源日趨匱乏，種群規(guī)模不斷縮小，已被《中國瀕危動(dòng)物紅皮書》列為易危物種[4]。近段時(shí)期，重慶地區(qū)部分棘腹蛙養(yǎng)殖場(chǎng)流行了一種致棘腹蛙眼睛表面出現(xiàn)白色薄膜，食欲廢絕，甚至導(dǎo)致患蛙死亡的疾病，給生產(chǎn)上帶來了極大的損失。為解決這一問題，本研究擬分離鑒定該病的病原，并針對(duì)性的進(jìn)行抗生素篩選為臨床治療提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

取重慶地區(qū)某養(yǎng)殖場(chǎng)數(shù)只具“白內(nèi)障”典型癥狀的棘腹蛙作為被檢病料。患病棘腹蛙體重100～120g，體長(zhǎng)40～50cm，剖檢后可見眼球外附著一層白色薄膜，眼睛鞏膜部有少量出血點(diǎn)，舌頭表層和口腔內(nèi)部有散在出血點(diǎn)，食道、胃和腸道出血。

健康棘腹蛙80只，購自重慶市某棘腹蛙養(yǎng)殖場(chǎng)，規(guī)格為每只100 g左右。

酵母提取物、胰蛋白胨等試劑購自O(shè)XOID公司；水解酪蛋白（M-H）瓊脂/肉湯購自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；兔血在無菌條件下采自健康家兔；細(xì)菌微量生化管（批號(hào)：140123）和藥敏試紙（批號(hào)：140227）購于杭州天和微生物試劑有限公司；DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)、2×Taq PCR Master Mix等購自北京天根生化科技有限公司；其他常規(guī)試劑由實(shí)驗(yàn)室自行配制。

1.2 方法

1.2.1 病原菌的分離 無菌蒸餾水沖洗病蛙體表后，在超凈操作臺(tái)中接種病蛙眼部病灶、口腔、腹水和部分內(nèi)臟器官等于LB固體和液體培養(yǎng)基，28 ℃培養(yǎng)24 h；同時(shí)做厭氧培養(yǎng)，觀察細(xì)菌生長(zhǎng)情況。對(duì)分離到的細(xì)菌進(jìn)行純化培養(yǎng)，并用5%兔血平板鑒定溶血性；挑取單個(gè)菌落革蘭氏染色鏡檢，純化后的候選菌株置-20 ℃保存。

1.2.2 致病性實(shí)驗(yàn) 用平板菌落計(jì)數(shù)法調(diào)整菌懸液濃度至5.0×108、5.0×107、5.0×106、5.0×105、5.0×104、5.0×103 、5.0×102CFU/mL。供試棘腹蛙分為8組，每組10只，暫養(yǎng)一周無任何病變后方可用于實(shí)驗(yàn)；接種組以0.2 mL/只的劑量分別以點(diǎn)眼和腹腔接種的方式接種上述7種濃度的菌懸液；對(duì)照組接種0.2 mL/只的無菌生理鹽水。試驗(yàn)期間外界條件與暫養(yǎng)時(shí)相同，隨時(shí)觀察棘腹蛙癥狀。出現(xiàn)棘腹蛙死亡即時(shí)撈出并剖檢，以不再發(fā)生死亡時(shí)為結(jié)束時(shí)間。從死亡棘腹蛙眼部和內(nèi)臟再次分離細(xì)菌并進(jìn)行鑒定。計(jì)算出出該候選菌株感染棘腹蛙的半數(shù)致死量（LD50）。

1.2.3 生理生化特性鑒定 取上述純化后的候選菌，接種于細(xì)菌微量生化反應(yīng)管，按照常規(guī)進(jìn)行葡萄糖、乳糖、麥芽糖、七葉苷、肌醇等項(xiàng)目的生理生化特性測(cè)定，實(shí)驗(yàn)結(jié)果主要參照《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》進(jìn)行判定。

1.2.4 16S rDNA鑒定 采用擴(kuò)增細(xì)菌16S rDNA的通用引物，其上、下游引物序列分別為：5-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3和5-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3。引物由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成。

陽性PCR產(chǎn)物測(cè)定結(jié)果提交GenBank數(shù)據(jù)庫進(jìn)行Blast比對(duì)。利用Mega軟件對(duì)與該序列類似度較高的序列進(jìn)行比對(duì)并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.2.5 藥敏試驗(yàn) 挑取純化后的候選菌株單個(gè)菌落于M-H肉湯中，28 ℃恒溫震蕩培養(yǎng)12 h。將培養(yǎng)物用生理鹽水稀釋為0.5倍麥?zhǔn)蠞舛群笥妹奘米诱喝【壕鶆蛲坎寂囵B(yǎng)基表面，然后用鑷子將紙片貼在瓊脂平板表面。每張紙片間距≥24 mm，紙片中心距平皿邊緣≥15 mm。28 ℃恒溫培養(yǎng)12～16 h后測(cè)量抑菌圈大小并參照杭州天和微生物試劑有限公司的藥敏試驗(yàn)判斷標(biāo)準(zhǔn)來判定結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)菌分離結(jié)果

在剖檢的患病棘腹蛙眼、口腔和胃分離到一株優(yōu)勢(shì)菌，命名為CQWU201401。該候選菌株在LB固體培養(yǎng)基上呈乳白色，光滑菌落。在兔全血平板上出現(xiàn)微弱溶血環(huán)。革蘭氏染色后在光學(xué)顯微鏡下可觀察到圓形或橢圓形、葡萄狀堆積排列的革蘭氏陽性菌。

2.2 致病性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

候選菌株接種棘腹蛙3 d后減少或停止進(jìn)食，7 d后陸續(xù)有病蛙死亡。死亡棘腹蛙剖檢可見眼部出現(xiàn)化膿癥狀，口腔和食道有輕微出血，胃部嚴(yán)重出血，與自然感染結(jié)果一致；從發(fā)病棘腹蛙眼部、口腔和胃仍能分離出與候選菌株生理生化特性一致的優(yōu)勢(shì)菌。候選菌株的LD50值為2.5×107 CFU/只。對(duì)照組棘腹蛙無任何異常（表1）。

摘要：在患“白內(nèi)障”棘腹蛙眼部、口腔和胃部分離到一株圓形或橢圓形、葡萄狀堆積的革蘭氏陽性菌，經(jīng)培養(yǎng)特性觀察和致病性實(shí)驗(yàn)，確定候選菌株CQWU201401為“白內(nèi)障”的病原；通過針對(duì)該菌株的生理生化特性鑒定和16S rDNA測(cè)序鑒定結(jié)果判定該候選菌株為金黃色葡萄球菌。采用藥敏紙片法對(duì)該菌株進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，在10種藥物中的僅對(duì)四環(huán)素有耐藥現(xiàn)象；針對(duì)該病原菌的分離鑒定和藥敏試驗(yàn)為臨床上防治該病提供了參考。

關(guān)鍵詞：棘腹蛙；“白內(nèi)障”；分離鑒定

中圖分類號(hào)：S947.2 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1007-273X（2014）08-0008-03

棘腹蛙（Paa boulengeri）又名石坑、石蛙等，是我國特有的珍稀兩棲動(dòng)物，主要分布在湖南、湖北、四川以及甘肅等省[1]。棘腹蛙個(gè)體大，肉質(zhì)鮮美，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高，是名貴的營(yíng)養(yǎng)滋補(bǔ)食品[2，3]。由于人為濫捕、水體污染、生態(tài)環(huán)境破壞等因素，野生棘腹蛙資源日趨匱乏，種群規(guī)模不斷縮小，已被《中國瀕危動(dòng)物紅皮書》列為易危物種[4]。近段時(shí)期，重慶地區(qū)部分棘腹蛙養(yǎng)殖場(chǎng)流行了一種致棘腹蛙眼睛表面出現(xiàn)白色薄膜，食欲廢絕，甚至導(dǎo)致患蛙死亡的疾病，給生產(chǎn)上帶來了極大的損失。為解決這一問題，本研究擬分離鑒定該病的病原，并針對(duì)性的進(jìn)行抗生素篩選為臨床治療提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

取重慶地區(qū)某養(yǎng)殖場(chǎng)數(shù)只具“白內(nèi)障”典型癥狀的棘腹蛙作為被檢病料。患病棘腹蛙體重100～120g，體長(zhǎng)40～50cm，剖檢后可見眼球外附著一層白色薄膜，眼睛鞏膜部有少量出血點(diǎn)，舌頭表層和口腔內(nèi)部有散在出血點(diǎn)，食道、胃和腸道出血。

健康棘腹蛙80只，購自重慶市某棘腹蛙養(yǎng)殖場(chǎng)，規(guī)格為每只100 g左右。

酵母提取物、胰蛋白胨等試劑購自O(shè)XOID公司；水解酪蛋白（M-H）瓊脂/肉湯購自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；兔血在無菌條件下采自健康家兔；細(xì)菌微量生化管（批號(hào)：140123）和藥敏試紙（批號(hào)：140227）購于杭州天和微生物試劑有限公司；DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)、2×Taq PCR Master Mix等購自北京天根生化科技有限公司；其他常規(guī)試劑由實(shí)驗(yàn)室自行配制。

1.2 方法

1.2.1 病原菌的分離 無菌蒸餾水沖洗病蛙體表后，在超凈操作臺(tái)中接種病蛙眼部病灶、口腔、腹水和部分內(nèi)臟器官等于LB固體和液體培養(yǎng)基，28 ℃培養(yǎng)24 h；同時(shí)做厭氧培養(yǎng)，觀察細(xì)菌生長(zhǎng)情況。對(duì)分離到的細(xì)菌進(jìn)行純化培養(yǎng)，并用5%兔血平板鑒定溶血性；挑取單個(gè)菌落革蘭氏染色鏡檢，純化后的候選菌株置-20 ℃保存。

1.2.2 致病性實(shí)驗(yàn) 用平板菌落計(jì)數(shù)法調(diào)整菌懸液濃度至5.0×108、5.0×107、5.0×106、5.0×105、5.0×104、5.0×103 、5.0×102CFU/mL。供試棘腹蛙分為8組，每組10只，暫養(yǎng)一周無任何病變后方可用于實(shí)驗(yàn)；接種組以0.2 mL/只的劑量分別以點(diǎn)眼和腹腔接種的方式接種上述7種濃度的菌懸液；對(duì)照組接種0.2 mL/只的無菌生理鹽水。試驗(yàn)期間外界條件與暫養(yǎng)時(shí)相同，隨時(shí)觀察棘腹蛙癥狀。出現(xiàn)棘腹蛙死亡即時(shí)撈出并剖檢，以不再發(fā)生死亡時(shí)為結(jié)束時(shí)間。從死亡棘腹蛙眼部和內(nèi)臟再次分離細(xì)菌并進(jìn)行鑒定。計(jì)算出出該候選菌株感染棘腹蛙的半數(shù)致死量（LD50）。

1.2.3 生理生化特性鑒定 取上述純化后的候選菌，接種于細(xì)菌微量生化反應(yīng)管，按照常規(guī)進(jìn)行葡萄糖、乳糖、麥芽糖、七葉苷、肌醇等項(xiàng)目的生理生化特性測(cè)定，實(shí)驗(yàn)結(jié)果主要參照《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》進(jìn)行判定。

1.2.4 16S rDNA鑒定 采用擴(kuò)增細(xì)菌16S rDNA的通用引物，其上、下游引物序列分別為：5-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3和5-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3。引物由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成。

陽性PCR產(chǎn)物測(cè)定結(jié)果提交GenBank數(shù)據(jù)庫進(jìn)行Blast比對(duì)。利用Mega軟件對(duì)與該序列類似度較高的序列進(jìn)行比對(duì)并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.2.5 藥敏試驗(yàn) 挑取純化后的候選菌株單個(gè)菌落于M-H肉湯中，28 ℃恒溫震蕩培養(yǎng)12 h。將培養(yǎng)物用生理鹽水稀釋為0.5倍麥?zhǔn)蠞舛群笥妹奘米诱喝【壕鶆蛲坎寂囵B(yǎng)基表面，然后用鑷子將紙片貼在瓊脂平板表面。每張紙片間距≥24 mm，紙片中心距平皿邊緣≥15 mm。28 ℃恒溫培養(yǎng)12～16 h后測(cè)量抑菌圈大小并參照杭州天和微生物試劑有限公司的藥敏試驗(yàn)判斷標(biāo)準(zhǔn)來判定結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)菌分離結(jié)果

在剖檢的患病棘腹蛙眼、口腔和胃分離到一株優(yōu)勢(shì)菌，命名為CQWU201401。該候選菌株在LB固體培養(yǎng)基上呈乳白色，光滑菌落。在兔全血平板上出現(xiàn)微弱溶血環(huán)。革蘭氏染色后在光學(xué)顯微鏡下可觀察到圓形或橢圓形、葡萄狀堆積排列的革蘭氏陽性菌。

2.2 致病性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

候選菌株接種棘腹蛙3 d后減少或停止進(jìn)食，7 d后陸續(xù)有病蛙死亡。死亡棘腹蛙剖檢可見眼部出現(xiàn)化膿癥狀，口腔和食道有輕微出血，胃部嚴(yán)重出血，與自然感染結(jié)果一致；從發(fā)病棘腹蛙眼部、口腔和胃仍能分離出與候選菌株生理生化特性一致的優(yōu)勢(shì)菌。候選菌株的LD50值為2.5×107 CFU/只。對(duì)照組棘腹蛙無任何異常（表1）。

摘要：在患“白內(nèi)障”棘腹蛙眼部、口腔和胃部分離到一株圓形或橢圓形、葡萄狀堆積的革蘭氏陽性菌，經(jīng)培養(yǎng)特性觀察和致病性實(shí)驗(yàn)，確定候選菌株CQWU201401為“白內(nèi)障”的病原；通過針對(duì)該菌株的生理生化特性鑒定和16S rDNA測(cè)序鑒定結(jié)果判定該候選菌株為金黃色葡萄球菌。采用藥敏紙片法對(duì)該菌株進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，在10種藥物中的僅對(duì)四環(huán)素有耐藥現(xiàn)象；針對(duì)該病原菌的分離鑒定和藥敏試驗(yàn)為臨床上防治該病提供了參考。

關(guān)鍵詞：棘腹蛙；“白內(nèi)障”；分離鑒定

中圖分類號(hào)：S947.2 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1007-273X（2014）08-0008-03

棘腹蛙（Paa boulengeri）又名石坑、石蛙等，是我國特有的珍稀兩棲動(dòng)物，主要分布在湖南、湖北、四川以及甘肅等省[1]。棘腹蛙個(gè)體大，肉質(zhì)鮮美，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高，是名貴的營(yíng)養(yǎng)滋補(bǔ)食品[2，3]。由于人為濫捕、水體污染、生態(tài)環(huán)境破壞等因素，野生棘腹蛙資源日趨匱乏，種群規(guī)模不斷縮小，已被《中國瀕危動(dòng)物紅皮書》列為易危物種[4]。近段時(shí)期，重慶地區(qū)部分棘腹蛙養(yǎng)殖場(chǎng)流行了一種致棘腹蛙眼睛表面出現(xiàn)白色薄膜，食欲廢絕，甚至導(dǎo)致患蛙死亡的疾病，給生產(chǎn)上帶來了極大的損失。為解決這一問題，本研究擬分離鑒定該病的病原，并針對(duì)性的進(jìn)行抗生素篩選為臨床治療提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

取重慶地區(qū)某養(yǎng)殖場(chǎng)數(shù)只具“白內(nèi)障”典型癥狀的棘腹蛙作為被檢病料。患病棘腹蛙體重100～120g，體長(zhǎng)40～50cm，剖檢后可見眼球外附著一層白色薄膜，眼睛鞏膜部有少量出血點(diǎn)，舌頭表層和口腔內(nèi)部有散在出血點(diǎn)，食道、胃和腸道出血。

健康棘腹蛙80只，購自重慶市某棘腹蛙養(yǎng)殖場(chǎng)，規(guī)格為每只100 g左右。

酵母提取物、胰蛋白胨等試劑購自O(shè)XOID公司；水解酪蛋白（M-H）瓊脂/肉湯購自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；兔血在無菌條件下采自健康家兔；細(xì)菌微量生化管（批號(hào)：140123）和藥敏試紙（批號(hào)：140227）購于杭州天和微生物試劑有限公司；DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)、2×Taq PCR Master Mix等購自北京天根生化科技有限公司；其他常規(guī)試劑由實(shí)驗(yàn)室自行配制。

1.2 方法

1.2.1 病原菌的分離 無菌蒸餾水沖洗病蛙體表后，在超凈操作臺(tái)中接種病蛙眼部病灶、口腔、腹水和部分內(nèi)臟器官等于LB固體和液體培養(yǎng)基，28 ℃培養(yǎng)24 h；同時(shí)做厭氧培養(yǎng)，觀察細(xì)菌生長(zhǎng)情況。對(duì)分離到的細(xì)菌進(jìn)行純化培養(yǎng)，并用5%兔血平板鑒定溶血性；挑取單個(gè)菌落革蘭氏染色鏡檢，純化后的候選菌株置-20 ℃保存。

1.2.2 致病性實(shí)驗(yàn) 用平板菌落計(jì)數(shù)法調(diào)整菌懸液濃度至5.0×108、5.0×107、5.0×106、5.0×105、5.0×104、5.0×103 、5.0×102CFU/mL。供試棘腹蛙分為8組，每組10只，暫養(yǎng)一周無任何病變后方可用于實(shí)驗(yàn)；接種組以0.2 mL/只的劑量分別以點(diǎn)眼和腹腔接種的方式接種上述7種濃度的菌懸液；對(duì)照組接種0.2 mL/只的無菌生理鹽水。試驗(yàn)期間外界條件與暫養(yǎng)時(shí)相同，隨時(shí)觀察棘腹蛙癥狀。出現(xiàn)棘腹蛙死亡即時(shí)撈出并剖檢，以不再發(fā)生死亡時(shí)為結(jié)束時(shí)間。從死亡棘腹蛙眼部和內(nèi)臟再次分離細(xì)菌并進(jìn)行鑒定。計(jì)算出出該候選菌株感染棘腹蛙的半數(shù)致死量（LD50）。

1.2.3 生理生化特性鑒定 取上述純化后的候選菌，接種于細(xì)菌微量生化反應(yīng)管，按照常規(guī)進(jìn)行葡萄糖、乳糖、麥芽糖、七葉苷、肌醇等項(xiàng)目的生理生化特性測(cè)定，實(shí)驗(yàn)結(jié)果主要參照《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》進(jìn)行判定。

1.2.4 16S rDNA鑒定 采用擴(kuò)增細(xì)菌16S rDNA的通用引物，其上、下游引物序列分別為：5-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3和5-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3。引物由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成。

陽性PCR產(chǎn)物測(cè)定結(jié)果提交GenBank數(shù)據(jù)庫進(jìn)行Blast比對(duì)。利用Mega軟件對(duì)與該序列類似度較高的序列進(jìn)行比對(duì)并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.2.5 藥敏試驗(yàn) 挑取純化后的候選菌株單個(gè)菌落于M-H肉湯中，28 ℃恒溫震蕩培養(yǎng)12 h。將培養(yǎng)物用生理鹽水稀釋為0.5倍麥?zhǔn)蠞舛群笥妹奘米诱喝【壕鶆蛲坎寂囵B(yǎng)基表面，然后用鑷子將紙片貼在瓊脂平板表面。每張紙片間距≥24 mm，紙片中心距平皿邊緣≥15 mm。28 ℃恒溫培養(yǎng)12～16 h后測(cè)量抑菌圈大小并參照杭州天和微生物試劑有限公司的藥敏試驗(yàn)判斷標(biāo)準(zhǔn)來判定結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)菌分離結(jié)果

在剖檢的患病棘腹蛙眼、口腔和胃分離到一株優(yōu)勢(shì)菌，命名為CQWU201401。該候選菌株在LB固體培養(yǎng)基上呈乳白色，光滑菌落。在兔全血平板上出現(xiàn)微弱溶血環(huán)。革蘭氏染色后在光學(xué)顯微鏡下可觀察到圓形或橢圓形、葡萄狀堆積排列的革蘭氏陽性菌。

2.2 致病性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

候選菌株接種棘腹蛙3 d后減少或停止進(jìn)食，7 d后陸續(xù)有病蛙死亡。死亡棘腹蛙剖檢可見眼部出現(xiàn)化膿癥狀，口腔和食道有輕微出血，胃部嚴(yán)重出血，與自然感染結(jié)果一致；從發(fā)病棘腹蛙眼部、口腔和胃仍能分離出與候選菌株生理生化特性一致的優(yōu)勢(shì)菌。候選菌株的LD50值為2.5×107 CFU/只。對(duì)照組棘腹蛙無任何異常（表1）。