劉遠志 陳兵剛 丁 渭 喬錄新 趙青霞 吳 昊 陳德喜 張玉林*

(1.首都醫(yī)科大學附屬北京佑安醫(yī)院感染中心，北京100069;2.山東省濱州市中心醫(yī)院感染內科，山東濱州251700;3.北京市肝病研究所，北京100069;4.河南省傳染病醫(yī)院感染科，鄭州450015)

中樞神經系統(tǒng)(central nervous system，CNS)機會性感染(opportunistic infections，OIs)是人類免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus，HIV)感染者最嚴重合并癥之一［1］。雖然高活性抗反轉錄病毒治療(highly active antiretroviral therapy，HAART)顯著改善HIV感染者生存期和生活質量，但是CNS OIs仍然是這類患者預后不良的重要因素［2-3］。

筆者之前報道［4-5］了我國河南獻血人群中樞神經系統(tǒng)HIV-1亞型主要是B或B'，針對gp120 C2-V5區(qū)序列分析提示外周血病毒準種變異性明顯高于CNS，HIV-1合并神經認知障礙者中樞HIV-1病毒準種變異性也明顯增高［6-7］。本研究中，筆者將對合并中樞神經系統(tǒng)機會性感染患者中樞HIV-1 gp120 C2-V5區(qū)序列進行分析，研究HIV-1病毒學特征，并探索其與中樞神經系統(tǒng)機會性感染的關系。

1 研究對象與方法

1.1 研究對象

研究對象為40例輸血感染HIV-1且處于艾滋病期人群。其中，24名來自河南省傳染病醫(yī)院的艾滋病患者確診合并中樞神經系統(tǒng)機會性感染。排除標準包括年齡小于18歲，有先天性或慢性神經系統(tǒng)疾病、慢性代謝疾病、腦血管疾病及腦瘤病史等。此外，16個未患中樞神經系統(tǒng)機會性感染來自相同人群的HIV-1感染者作為對照組。該項研究經首都醫(yī)科大學附屬北京佑安醫(yī)院倫理委員會審核批準，所有患者均簽署書面知情同意。

1.2 臨床評估和HIV-1病毒載量檢測

HIV-1感染通過酶聯(lián)免疫吸附試驗和免疫印跡法確診。依據(jù)《美國成人和青少年HIV合并機會性感染防治指南》［8］，根據(jù)患者臨床癥狀、體征、影像學和病原學檢查進行診斷。弓形蟲腦炎根據(jù)神經系統(tǒng)癥狀體征;頭部CT掃描顯示顱內多發(fā)環(huán)形病灶;血清抗弓形蟲IgG抗體進行性升高;結合弓形蟲肺部感染、心包炎和彌漫性弓形蟲病等進行診斷。隱球菌腦膜炎可出現(xiàn)發(fā)熱、頭痛、頸項強直、視力障礙和意識障礙等癥狀，腦脊液壓力顯著增高;腦脊液墨汁染色和血清乳膠凝集試驗陽性進行診斷。巨細胞病毒腦炎可根據(jù)神經系統(tǒng)癥狀隱匿或不典型，但較少出現(xiàn)發(fā)熱、頭痛癥狀;頭部CT和MRI檢查可見雙側大腦半球炎、腦室炎、腦膜炎和腦梗死、腦萎縮、腦積水等;增強掃描顯示室管膜強化，表現(xiàn)為環(huán)形病灶;主要結合血清巨細胞病毒抗原陽性及腦脊液PCR檢測綜合評估診斷。進行性多灶性腦白質病可出現(xiàn)偏癱或輕癱導致的肢體無力、步態(tài)不穩(wěn)、認知功能障礙和構音障礙癥狀;CT表現(xiàn)為腦白質多灶性低密度影;MRI檢查T2WI序列呈高信號，增強后病灶無強化或僅病灶周圍出現(xiàn)輕度強化;腦脊液JC病毒PCR檢測協(xié)助診斷。臨床和實驗室數(shù)據(jù)包括性別、年齡、HIV-1感染時間、HAART時間、血白細胞計數(shù)、腦脊液細胞計數(shù)、腦脊液生化指標等。CD4+T細胞計數(shù)通過流式細胞術進行(BD FACS CantoMⅡ)。血漿和腦脊液的HIV-RNA水平通過RT-PCR測量(羅氏Amplicor，v.1.5，檢測下限50 Copys/mL)。

1.3 腦脊液HIV-1 RNA gp120 C2-V5區(qū)擴增

CSF HIV-1 RNA純化提取使用QIAamp Viral RNA Mini Kit試劑盒(Qiagen，Duesseldorf，德國)，依照廠商提供的說明書操作;提取的RNA迅速通過SuperScriptⅢ First-Strand Synthesis System反轉錄試劑盒(Invitrogen，California，USA)反轉錄(RT-PCR)為cDNA，具體步驟按照生產廠家提供的說明書操作。注意操作過程中標本的交叉污染。上述cDNA通過PCR反應擴增其中的C2-V5區(qū)核苷酸序列，應用成對設計引物的巢式PCR，引物序列:外側正向引物:5'－atgggatcaaagcctaaagccatgtg－3'，外側反向引物:5'－gcgcccatagtgcttcctgctgctgc－3'，內側正向引物:5'－ctgttaaatggcagtctagc－3'，內側反向引物:5'－acttctccaattgtccctcat－3'。采用常規(guī)反應體系和反應程序。設立多組陰性對照，檢測實驗過程中可能出現(xiàn)的模板污染。PCR產物通過TA載體進行分子克隆(Takara大連，中國)。每一標本隨機選擇6～8個克隆，然后用ABI3730遺傳分析系統(tǒng)測序。

1.4 統(tǒng)計學方法

2 結果

2.1 一般資料和臨床特征

24例中樞神經系統(tǒng)機會性感染者和16個感染HIV-1的對照組患者都是在1994和1995年期間通過獻血染病，他們在2008年1月至2012年12月間作為中樞神經系統(tǒng)機會性感染者或是非中樞神經系統(tǒng)機會性感染者(對照組)參加研究，當時他們的CD4計數(shù)都低于200個 /mm3。24名中樞神經系統(tǒng)機會性感染者包含11名弓形蟲腦炎、5名隱球菌腦膜炎、6名巨細胞病毒腦炎和2名進行性多灶性腦白質病。依據(jù)美國疾病預防控制中心分類標準，24例實驗組患者均進入C3期，16例對照組患者屬于B3期。所有患者都進行免費聯(lián)合抗病毒治療，治療方案包括2個核苷反轉錄酶抑制劑(拉米夫定和齊多夫定)聯(lián)合一個非核苷反轉錄酶抑制劑(奈韋拉平)。24名中樞神經系統(tǒng)機會性感染者同時接受抗感染治療及對癥治療?；颊吣挲g、性別、HIV-感染時間、聯(lián)合抗反轉錄病毒治療(combined antiretroviral therapy，cART)時間、白細胞計數(shù)和腦脊液生化指標:白細胞計數(shù)、蛋白質、葡萄糖和氯化物詳見表1。其中實驗組患者男性15例，女性9例，平均年齡為(46.56±21.45)歲。實驗組與對照組之間年齡、性別比例、HIV-1感染時間和白細胞計數(shù)差異無統(tǒng)計學意義，但實驗組接受聯(lián)合抗反轉錄病毒治療時間較短。此外，實驗組腦脊液白細胞計數(shù)和蛋白質濃度較高，葡萄糖濃度較低。

表1 一般資料和臨床特征Tab.1 The participants'demographic and clinical characteristics (±s)

表1 一般資料和臨床特征Tab.1 The participants'demographic and clinical characteristics (±s)

HIV-1:human immunodeficiency virus type 1;cART:combined antiretroviral therapy;CSF:cerebro-spinal fluid;CNS:central nervous system;OIS:opportunistic infection;NS:not significant.

Item Control(n=16) CNS OIs(n=24)P Age/a 49.63±25.31 46.56±21.45 NS Male/n(%) 7(43.75) 15(62.5) NS HIV-1 infection time/a 16.44±2.38 17.34±1.81 NS cART time/months 16.38±6.45 3.26±1.73 P＜0.05 White blood cells/(×109·L－1) 6.45±3.16 5.87±2.56 NS White blood cells count in CSF/(×106·L－1) 3.47±2.64 23.54±13.68 P＜0.05 Protein in CSF/(g·L－1) 0.58±0.24 3.69±2.98 P＜0.05 Glucose in CSF/(mmol·L－1) 3.849±2.47 1.53±1.23 P ＜0.05 Chloride in CSF/(mmol·L－1) 128.470±70.54 103.22±81.46 NS

2.2 中樞神經系統(tǒng)機會性感染患者的腦脊液病毒載量明顯增高

實驗組血漿平均HIV載量(HIV RNA log10 copies/mL)為3.60±1.26，CSF為 6.09± 2.43;而對照組血漿平均HIV載量2.59±1.45，CSF為0.26 ±0.21。兩組間血漿HIV載量無差別，但實驗組CSF HIV載量明顯高于對照組(圖1A)。實驗組和對照組CD4細胞計數(shù)，差異無統(tǒng)計學意義(圖1B)。對照組腦脊液與血漿HIV載量(圖1C)，以及實驗組腦脊液和血漿中HIV載量都沒有線性相關性(圖1D)。同樣，對照組CSF HIV載量與CD4計數(shù)(圖1E)，以及實驗組CSF HIV載量與CD4計數(shù)之間無線性相關性(圖1F)。同時，實驗組CSF HIV載量和CSF炎性反應指標:白細胞計數(shù)、蛋白質、葡萄糖和氯化物之間也沒有相關性。

2.3 中樞神經系統(tǒng)機會性感染患者腦脊液HIV-1準種變異性增加

本研究從24例實驗組和16例對照組患者腦脊液中分離了病毒RNA，然后擴增C2-V5(env)區(qū)。在TA克隆法和測序后，實驗組總共獲得114個陽性克隆，包括弓形蟲腦炎58個，隱球菌性腦膜炎25個，巨細胞病毒腦炎23個和進行性多灶性腦白質病8個;對照組獲得76個陽性克隆。通過Mega 5.0軟件包將獲得的序列與從GenBank獲取的參考序列15_01B.TH99.99TH_MU2079_ACC_AF516184進行比對，建立相鄰進化樹(圖2A)。通過測定各序列與標準序列之間的核苷酸距離，并進行統(tǒng)計學分析，發(fā)現(xiàn)實驗組病毒變異性明顯高于對照組(P＜0.000 1)(圖2B)。

圖1 血漿、腦脊液病毒載量及CD4細胞計數(shù)之間關系Fig.1 The correlation of plasma viral load and cerebrospinal fluid viral load and CD4 count

圖2 HIV C2-V5區(qū)序列進化樹及兩組序列與參照株之間核苷酸距離比較Fig.2 Diversity of CSF HIV-1 quasispecies in patients with CNS OIs

3 討論

HIV通過感染CD4細胞侵犯機體免疫系統(tǒng)，最終可產生全身多系統(tǒng)機會性感染，其中中樞神經系統(tǒng)的機會性感染較為常見［9］，病原學種類多，病情危重，病死率高［10］。中樞神經系統(tǒng)機會性感染通常發(fā)生在腦脊液。CD4細胞計數(shù)小于200個 /mm3［2］者 HIV-1 RNA的檢測率在那些腦脊液CD4計數(shù)低于200個/mm3，以及血漿中能檢測出HIV-1 RNA的患者中較高［11］。此前也有報道［12］患有神經系統(tǒng)疾病的患者腦脊液病毒載量較高，但是血漿病毒載量并不高。此外，腦脊液病毒檢出率也與是否接受抗病毒治療有關。本研究中，筆者還發(fā)現(xiàn)神經系統(tǒng)機會性感染患者腦脊液病毒載量較高，但與血漿病毒載量和CD4細胞計數(shù)無明顯相關性?？共《局委煂δX脊液病毒載量影響似乎大于血漿(當然這需要大樣本的研究進一步證實)。此前有報道［13］腦脊液HIV-1 RNA的水平和腦脊液的單核細胞計數(shù)之間有緊密關系，但本研究并未發(fā)現(xiàn)這一點。

HIV病毒準種變異性與神經系統(tǒng)疾病的相關性尚不確定［14］。筆者既往報道［4-5］HIV 感染者血漿病毒C2-V5區(qū)變異性明顯高于腦脊液。HIV合并神經認知障礙患者中樞病毒變異性明顯增高［7］。HIV相關中樞神經損傷與外周感染的HIV透過血-腦脊液屏障進入并定植于 CNS，產生炎性反應密切有關［15］。由于表面缺乏HIV感染所必需的CD4受體，神經元本身一般不感染HIV。由此，感染HIV的炎性反應細胞(包括CD4+淋巴細胞，單核/巨噬細胞、小膠質細胞和星形膠質細胞)在HIV病毒與神經元之間建立起了損傷的紐帶。上述感染了HIV-1的炎性反應細胞可釋放病毒顆粒和炎性反應介質，進而通過神經元表面的N-甲基-D-天冬氨酸受體(N-methyl-D-aspartate receptor，NMDAR)和趨化因子受體等激活細胞表面和內質網(wǎng)鈣離子通道，導致細胞內鈣超載和超氧離子增多，誘導神經元凋亡［16-20］。筆者既往研究［4-5］發(fā)現(xiàn)中樞HIV-1病毒CCR5嗜性，變異性小于外周。gp120 V3環(huán)多肽可誘導原代培養(yǎng)的小鼠皮質神經元細胞凋亡，并抑制神經突起的形成［21］。艾滋病患者腦脊液超氧離子增加，尸檢大腦皮質組織標本氧化損傷明顯［7］。由此可見，HIV病毒啟動中樞神經炎性損傷，并扮演重要角色。在本研究中，筆者發(fā)現(xiàn)中樞神經系統(tǒng)機會性感染患者的腦脊液病毒膜區(qū)變異性明顯增高，這也許與中樞神經系統(tǒng)機會性感染的形成及病情進展相關。由此可見，病毒啟動——炎性反應介導——神經損傷正是HIV神經病變(包括中樞神經系統(tǒng)機會性感染性病變)發(fā)病機制的主要路徑。其中每一個環(huán)節(jié)的確切機制仍需深入研究，這也正是我們目前和將來的研究方向。

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