張麗+郭成金

摘要：首次通過對松茸菌絲體的液體培養(yǎng)方式的比較，選擇以間歇性手搖的方式進行篩選，以松茸菌絲體生物量（干質(zhì)量）為主要指標(biāo)，首先采用單因素試驗分別篩選出2種最適碳氮源，再結(jié)合L9（34）正交設(shè)計方法，最終得到最適液體培養(yǎng)基配方：蔗糖30.00 g/L，麥芽糖20.00 g/L，酵母粉2.50 g/L，麥麩25.00 g/L（浸提液），KH2PO4 2.50 g/L，MgSO4·7H2O 1.50 g/L，維生素B1 8 mg/L，pH值自然條件。25 ℃靜置培養(yǎng)12 h，再每隔12 h水平往復(fù)手搖約5 min，培養(yǎng)72 h，其生物量可達10.92 g/L。與前人試驗結(jié)果相比，該方式周期更短，生物量更高。

關(guān)鍵詞：松茸；間歇性手搖；菌絲體；生物量；液體培養(yǎng)基；正交設(shè)計；周期。

中圖分類號：S646.1+50.4+3 文獻標(biāo)志碼：A

文章編號：1002-1302（2014）08-0245-03

松茸[Tricholoma matsutake （S. Ito & S. Imai） Singer]別稱松口蘑，屬擔(dān)子菌門傘菌亞門傘菌綱傘菌亞綱傘菌目口蘑科口蘑屬^[1]，是一種珍稀瀕危的食藥用真菌，國家級二級保護植物，有極高的營養(yǎng)價值和經(jīng)濟價值^[2]。松茸是共生菌，世界范圍內(nèi)研究松茸人工栽培已有幾十年的歷史，然而至今仍無突破性的成果。目前，隨著松茸生理生態(tài)研究的深入，松茸菌絲的純培養(yǎng)及子實體的仿生態(tài)栽培已取得了一定的進展，但僅能做到接種式的半人工栽培，真正的人工栽培還沒有實現(xiàn)^[3-4]。目前，很多國內(nèi)外學(xué)者采用高新技術(shù)從分子生物學(xué)角度研究松茸外生菌根的形成機理、分子特性和它們的遺傳特征序列^[5-8]，以此作為分子標(biāo)記，既可研究松茸的起源和親緣關(guān)系，又可為建立松茸基因庫打下基礎(chǔ)，以備將來用以挽救其可能滅絕的命運^[3]。自日本學(xué)者洪田捻（1947）、廣江勇（1957）和小川真（1987）等先后報道了分離培養(yǎng)松茸菌絲體的方法、培養(yǎng)基、菌落形態(tài)和菌絲類型^[9]并為松茸菌種分離提供了成功的經(jīng)驗以來，人們采用不同的方法從不同的角度對松茸菌絲體純培養(yǎng)^[10-11]、液體發(fā)酵^[12-13]等進行了許多研究，通過對松茸菌絲體的獲得、擴繁及其鑒定證實了在合理控制試驗條件下可以進行松茸菌絲體液體擴繁，且擴繁后的菌絲體與原種依然保持種質(zhì)的一致性^[14]。筆者運用不同于前人的試驗設(shè)計，通過碳氮源單因素試驗，并結(jié)合L9（34）正交設(shè)計對松茸菌絲體最適液體培養(yǎng)基進行了系統(tǒng)的篩選，為松茸液體發(fā)酵及今后的育種等提供了理論依據(jù)及技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 供試菌種

松茸，由北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院提供，編號為ACC51071。

1.2 培養(yǎng)基

1.2.1 綜合培養(yǎng)基 棉籽皮200.00 g/L（浸提液）、馬鈴薯200.00 g/L（浸提液）、葡萄糖20.00 g/L、KH2PO4 3.00 g/L、MgSO4·7H2O 1.50 g/L、維生素B1 0.004 g/L、瓊脂18.00 g/L，pH值自然條件。

1.2.2 碳源初選培養(yǎng)基 酵母粉3.00 g/L，KH2PO4 3.00 g/L，MgSO4·7H2O 1.50 g/L，維生素B1 0.004 g/L，pH值自然條件。分別以葡萄糖 20.00 g/L、麥芽糖 20.00 g/L、蔗糖 20.00 g/L、馬鈴薯200.00 g/L（浸提液）、玉米20.00 g/L（浸提液）為供試碳源。

1.2.3 氮源初選培養(yǎng)基 葡萄糖20.00 g/L，KH2PO4 3.00 g/L，MgSO4·7H2O 1.50 g/L，維生素B1 4 mg/L，pH值自然。分別以酵母粉3.00 g/L、蛋白胨3.00 g/L、牛肉膏3.00 g/L、硝酸銨3.00 g/L、麥麩20.00 g/L（浸提液）為供試氮源。

1.3 試劑與儀器設(shè)備

SW-CJ-2FD 雙人單面凈化工作臺（江蘇蘇州凈化設(shè)備有限公司）；YXQG02手提式壓力蒸汽消毒器（山東新華醫(yī)療器械廠）；WDP型微生物多用培養(yǎng)箱（廣東省醫(yī)療器械廠）；BS224S電子分析天平（北京賽多利斯儀器系統(tǒng)股份有限公司）；AP-01D 真空泵（天津奧特塞恩斯儀器有限公司）；DHG-9240電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）。

1.4 試驗方法

1.4.1 菌種活化與提純復(fù)壯 將保存的松茸菌種提前3 d活化，在無菌條件下接種于斜面綜合培養(yǎng)基上，25 ℃培養(yǎng) 5 d，再挑取健壯的菌絲前端，接種于平板綜合培養(yǎng)基上，于 25 ℃ 培養(yǎng) 6 d，備用。

1.4.2 菌絲體液體培養(yǎng) 用打孔器在生長健壯的菌絲體前端，挑取大小相同約0.5 cm2的菌塊，接種于液體培養(yǎng)基中，每瓶5塊。25 ℃靜置培養(yǎng)12 h，再每隔12 h水平往復(fù)手搖約5 min，培養(yǎng)72 h，每個水平3次重復(fù)。

1.4.3 菌絲體干質(zhì)量測量 濾紙編號，分別用電子天平稱重，將培養(yǎng)84 h的松茸菌絲體抽濾后，于60 ℃烘箱中烘干至恒重，用電子天平再次稱重。

1.4.4 碳氮源培養(yǎng)基正交試驗 依據(jù)碳源、氮源單因素試驗的結(jié)果，各選擇2個較好的碳氮源，按L9（34）設(shè)計4因素3水平正交試驗（表1）進行復(fù)選，與KH2PO4 3.0 g/L、MgSO4·7H2O 1.50 g/L、維生素B1 0.004 g/L組成9個試驗配方，篩選出最佳碳氮源組合。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同液體培養(yǎng)方式對松茸菌絲體生長狀況的影響endprint

試驗初期筆者首次進行了3種液體培養(yǎng)方式的篩選，分別為靜置培養(yǎng)（圖1-a）、120 r/min搖床培養(yǎng)（圖1-b）和間歇性手搖培養(yǎng)（圖1-c），各72 h。由于松茸菌絲生長迅速，靜置培養(yǎng)12 h后菌絲體即可連成片，浮于液體表面，抽濾后菌絲體生物量誤差較大，且不利于獲取菌絲體片段。搖床培養(yǎng)的液體渾濁，菌絲細小黏稠，不宜抽濾和分離。間歇性手搖是接種后靜置培養(yǎng)12 h，再每隔12 h水平往復(fù)手搖約5 min，培養(yǎng)一段時間后的菌絲體分布均勻，清晰可見，較容易抽濾，且動靜相間法所培養(yǎng)的菌絲體更有利于原生質(zhì)體的制備和誘變育種^[15]，所以最終采取間歇性手搖方式進行后期試驗。

2.2 不同碳源對松茸菌絲體生物量的影響

碳源是構(gòu)成細胞基本骨架的營養(yǎng)物質(zhì)，同時也為基本生命過程提供能源，試驗結(jié)果（表3）表明，在5種供試碳源中，以蔗糖為碳源的菌絲體生物量最高，麥芽糖次之，再次為葡萄糖、玉米粒，馬鈴薯最低。統(tǒng)計學(xué)方差分析結(jié)果（表4）表明，F(xiàn)值為14.478>F0.01（4，10）=5.994^[16]，表明不同碳源培養(yǎng)基對松茸菌絲體生物量的影響在0.01水平上差異顯著。Duncans

3 結(jié)論

試驗結(jié)果表明，松茸菌絲體生長的最適液體培養(yǎng)基為蔗糖30.00 g/L、麥芽糖20.00 g/L、酵母粉2.50 g/L、麥麩 25.00 g/L（浸提液）、KH2PO4 2.50 g/L、MgSO4·7H2O 1.50 g/L、維生素B1 8 mg/L，pH值自然條件。25 ℃靜置培養(yǎng)12 h，再每隔12 h 水平往復(fù)手搖約5 min，培養(yǎng)72 h，其生物量可達 10.92 g/L，與前人試驗結(jié)果相比，本研究周期更短，生物量更高。采用間歇性手搖的方式培養(yǎng)，得到的菌絲體分散均勻，生物量高，便于日后的原生質(zhì)體制備和誘變育種。

參考文獻：

[1]戴玉成，楊祝良. 中國藥用真菌名錄及部分名稱的修訂[J]. 菌物學(xué)報，2008，27（6）：801-824.

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[9]劉振欽，高勇秀，王子權(quán). 松茸菌絲體分離培養(yǎng)研究初報[J]. 吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，1989，11（2）：13-16，120.

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[12]李長田，刁盈盈，毛欣欣，等. 松茸液態(tài)發(fā)酵菌絲生長量因子的研究[J]. 菌物學(xué)報，2012，31（2）：229-234.

[13]王淑珍，白 晨，高 雁，等. 松茸液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基的篩選與科學(xué)依據(jù)[J]. 食用菌，2000，22（6）：4-5.

[14]張微思，羅孝坤，張麗英，等. 松茸菌絲體的純培養(yǎng)及其鑒定[J]. 中國食用菌，2010，29（3）：34-36.

[15]曲鴻雁，郭成金.冬蟲夏草與蛹蟲草融合子菌絲體液體培養(yǎng)基篩選[J]. 中國釀造，2013，32（3）：106-109.

[16]杜榮騫.生物統(tǒng)計學(xué)[M]. 北京：高等教育出版社，2003：263-265.

[17]曾東方，陳 玢，高孟文. 不同氮源對松茸菌絲生長的影響[J]. 食用菌，2010，32（4）：10-11.

[18]趙秀芳. 不同碳氮源對松口蘑菌絲生長的影響[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2005，33（3）：429-429，431.

[19]劉西周，郭成金. 采用L9（34）正交設(shè)計方法篩選血耳菌絲體液體培養(yǎng)基[J]. 中國食用菌，2009，28（1）：36-38.

[20]楊民和，楊新美，陳立國.松茸的營養(yǎng)生理及培養(yǎng)基的篩選[J]. 菌物系統(tǒng)，2000，19（2）：272-277.endprint

試驗初期筆者首次進行了3種液體培養(yǎng)方式的篩選，分別為靜置培養(yǎng)（圖1-a）、120 r/min搖床培養(yǎng)（圖1-b）和間歇性手搖培養(yǎng)（圖1-c），各72 h。由于松茸菌絲生長迅速，靜置培養(yǎng)12 h后菌絲體即可連成片，浮于液體表面，抽濾后菌絲體生物量誤差較大，且不利于獲取菌絲體片段。搖床培養(yǎng)的液體渾濁，菌絲細小黏稠，不宜抽濾和分離。間歇性手搖是接種后靜置培養(yǎng)12 h，再每隔12 h水平往復(fù)手搖約5 min，培養(yǎng)一段時間后的菌絲體分布均勻，清晰可見，較容易抽濾，且動靜相間法所培養(yǎng)的菌絲體更有利于原生質(zhì)體的制備和誘變育種^[15]，所以最終采取間歇性手搖方式進行后期試驗。

2.2 不同碳源對松茸菌絲體生物量的影響

碳源是構(gòu)成細胞基本骨架的營養(yǎng)物質(zhì)，同時也為基本生命過程提供能源，試驗結(jié)果（表3）表明，在5種供試碳源中，以蔗糖為碳源的菌絲體生物量最高，麥芽糖次之，再次為葡萄糖、玉米粒，馬鈴薯最低。統(tǒng)計學(xué)方差分析結(jié)果（表4）表明，F(xiàn)值為14.478>F0.01（4，10）=5.994^[16]，表明不同碳源培養(yǎng)基對松茸菌絲體生物量的影響在0.01水平上差異顯著。Duncans

3 結(jié)論

試驗結(jié)果表明，松茸菌絲體生長的最適液體培養(yǎng)基為蔗糖30.00 g/L、麥芽糖20.00 g/L、酵母粉2.50 g/L、麥麩 25.00 g/L（浸提液）、KH2PO4 2.50 g/L、MgSO4·7H2O 1.50 g/L、維生素B1 8 mg/L，pH值自然條件。25 ℃靜置培養(yǎng)12 h，再每隔12 h 水平往復(fù)手搖約5 min，培養(yǎng)72 h，其生物量可達 10.92 g/L，與前人試驗結(jié)果相比，本研究周期更短，生物量更高。采用間歇性手搖的方式培養(yǎng)，得到的菌絲體分散均勻，生物量高，便于日后的原生質(zhì)體制備和誘變育種。

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[11]曹張軍，張興群，呂小鷹，等. 一個適合松茸菌絲生長的加富培養(yǎng)基[J]. 食用菌學(xué)報，2007，14（3）：41-43.

[12]李長田，刁盈盈，毛欣欣，等. 松茸液態(tài)發(fā)酵菌絲生長量因子的研究[J]. 菌物學(xué)報，2012，31（2）：229-234.

[13]王淑珍，白 晨，高 雁，等. 松茸液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基的篩選與科學(xué)依據(jù)[J]. 食用菌，2000，22（6）：4-5.

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[15]曲鴻雁，郭成金.冬蟲夏草與蛹蟲草融合子菌絲體液體培養(yǎng)基篩選[J]. 中國釀造，2013，32（3）：106-109.

[16]杜榮騫.生物統(tǒng)計學(xué)[M]. 北京：高等教育出版社，2003：263-265.

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[19]劉西周，郭成金. 采用L9（34）正交設(shè)計方法篩選血耳菌絲體液體培養(yǎng)基[J]. 中國食用菌，2009，28（1）：36-38.

[20]楊民和，楊新美，陳立國.松茸的營養(yǎng)生理及培養(yǎng)基的篩選[J]. 菌物系統(tǒng)，2000，19（2）：272-277.endprint

試驗初期筆者首次進行了3種液體培養(yǎng)方式的篩選，分別為靜置培養(yǎng)（圖1-a）、120 r/min搖床培養(yǎng)（圖1-b）和間歇性手搖培養(yǎng)（圖1-c），各72 h。由于松茸菌絲生長迅速，靜置培養(yǎng)12 h后菌絲體即可連成片，浮于液體表面，抽濾后菌絲體生物量誤差較大，且不利于獲取菌絲體片段。搖床培養(yǎng)的液體渾濁，菌絲細小黏稠，不宜抽濾和分離。間歇性手搖是接種后靜置培養(yǎng)12 h，再每隔12 h水平往復(fù)手搖約5 min，培養(yǎng)一段時間后的菌絲體分布均勻，清晰可見，較容易抽濾，且動靜相間法所培養(yǎng)的菌絲體更有利于原生質(zhì)體的制備和誘變育種^[15]，所以最終采取間歇性手搖方式進行后期試驗。

2.2 不同碳源對松茸菌絲體生物量的影響

碳源是構(gòu)成細胞基本骨架的營養(yǎng)物質(zhì)，同時也為基本生命過程提供能源，試驗結(jié)果（表3）表明，在5種供試碳源中，以蔗糖為碳源的菌絲體生物量最高，麥芽糖次之，再次為葡萄糖、玉米粒，馬鈴薯最低。統(tǒng)計學(xué)方差分析結(jié)果（表4）表明，F(xiàn)值為14.478>F0.01（4，10）=5.994^[16]，表明不同碳源培養(yǎng)基對松茸菌絲體生物量的影響在0.01水平上差異顯著。Duncans

3 結(jié)論

試驗結(jié)果表明，松茸菌絲體生長的最適液體培養(yǎng)基為蔗糖30.00 g/L、麥芽糖20.00 g/L、酵母粉2.50 g/L、麥麩 25.00 g/L（浸提液）、KH2PO4 2.50 g/L、MgSO4·7H2O 1.50 g/L、維生素B1 8 mg/L，pH值自然條件。25 ℃靜置培養(yǎng)12 h，再每隔12 h 水平往復(fù)手搖約5 min，培養(yǎng)72 h，其生物量可達 10.92 g/L，與前人試驗結(jié)果相比，本研究周期更短，生物量更高。采用間歇性手搖的方式培養(yǎng)，得到的菌絲體分散均勻，生物量高，便于日后的原生質(zhì)體制備和誘變育種。

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[5]Vaario L M，Heinonsalo J，Spetz P，et al. The ectomycorrhizal fungus Tricholoma matsutake is a facultative saprotroph in vitro[J]. Mycorrhiza，2012，22（6）：409-418.

[6]Kataoka R，Siddiqui Z A，Kikuchi J，et al. Detecting nonculturable bacteria in the active mycorrhizal zone of the pine mushroom Tricholoma matsutake[J]. Journal of Microbiology，2012，50（2）：199-206.

[7]Vaario L M，F(xiàn)ritze H，Spetz P，et al.Tricholoma matsutake dominates diverse microbial communities in different forest soils[J]. Appl Environ Microbiol，2011，77（24）：8523-8531.

[8]Ding X，Hou Y L. Identification of genetic characterization and volatile compounds of Tricholoma matsutake from different geographical origins[J]. Biochemical Systematics and Ecology，2012，44（44）：233-239.

[9]劉振欽，高勇秀，王子權(quán). 松茸菌絲體分離培養(yǎng)研究初報[J]. 吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，1989，11（2）：13-16，120.

[10]Hirato H，Kitamoto Y. Effect of physico-chemical characteristics of the culture substrate and nutritional conditions on mycelial growth in Tricholoma matsutake[J]. Mushroom Sci Biotechnol，1995（2）：17-22.

[11]曹張軍，張興群，呂小鷹，等. 一個適合松茸菌絲生長的加富培養(yǎng)基[J]. 食用菌學(xué)報，2007，14（3）：41-43.

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