謝曉蕾 李求春

摘要 成簇的規(guī)律間隔的短回文重復(fù)序列（clustered regularly interspacedshort palindromic repeat，CRISPR）為原核生物構(gòu)建了一種抵御外源DNA侵?jǐn)_的防御機(jī)制，近年來(lái)成為國(guó)內(nèi)外細(xì)菌研究者們的研究熱點(diǎn)。在介紹CRISPR系統(tǒng)的研究歷史、分布分類、結(jié)構(gòu)特征的基礎(chǔ)上，對(duì)其作用機(jī)制以及應(yīng)用前景方面進(jìn)行了綜述。

關(guān)鍵詞 CRISPR；原核生物；防御機(jī)制

中圖分類號(hào) S188 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼

A 文章編號(hào) 0517-6611（2014）31-10845-03

Reasch Progress on Structure and Mechanism of CRISPR

XIE Xiaolei，LI Qiuchun* （College of Bioscience and Biotechnology，Yangzhou University，Yangzhou，Jiangsu 225009）

Abstract Clustered regularly interspaced short palindromic repeats（CRISPR），which provides effective resistance against foreign nucleicacid elements has become a hot spot in the research of bacteriologists both at home and abroad.On the basis of introducing the research history，distribution clsssification，structure and characteristics，the mechanism and application prospects of CRISPRsystem were reviewed.

Key words CRISPR； Prokaryote； Defense mechanism

在生物進(jìn)化歷史中，細(xì)菌一直受到諸多外源因素的侵?jǐn)_，噬菌體是其中具有極大威脅的一種，因而細(xì)菌在生存壓力下進(jìn)化出了多種抵抗噬菌體干擾的機(jī)制，如DNA注入抑制、吸附抑制、無(wú)效感染等^[1]。在細(xì)菌體內(nèi)，基因干擾途徑可以通過(guò)基因序列保證自身基因的正常表達(dá)，同時(shí)維持基因組的完整性。該途徑的重要性表現(xiàn)在真核生物中即為RNA干擾，另外在很多細(xì)菌和古生菌中也存在類似的干擾途徑^[2]。短回文重復(fù)序列CRISPR及其相關(guān)Cas（CRISPR associated）基因?yàn)榇蠖鄶?shù)細(xì)菌以及古細(xì)菌提供了一套新的免疫防御系統(tǒng)，以抵御外界遺傳物質(zhì)的入侵，從而維持自身遺傳信息的完整性。任何免疫系統(tǒng)的基本要求之一就是能夠產(chǎn)生免疫記憶，從而能有效地應(yīng)對(duì)再次感染。CRISPRCas免疫系統(tǒng)的特征在于它能記錄入侵的外源DNA序列，并以間隔序列的形式將其整合到自身的DNA序列中，從而產(chǎn)生免疫記憶。間隔序列經(jīng)轉(zhuǎn)錄后形成一段短的反義RNA，可與再次入侵的外源DNA序列互補(bǔ)配對(duì)，并在Cas蛋白的作用下，使其降解^[3]，從而抑制外源DNA的轉(zhuǎn)錄和翻譯，使噬菌體無(wú)法在細(xì)菌體內(nèi)生存和繁殖。

1 CRISPR研究歷史

1987年，日本大阪大學(xué)課題組在研究E.coli K12的堿性磷酸酶時(shí)，在該酶的編碼基因附近觀察到一段串聯(lián)間隔重復(fù)序列，隨后研究中發(fā)現(xiàn)這種間隔重復(fù)序列廣泛存在于細(xì)菌和古生菌的基因組中[1，4]。MOJICA等^[5]于2000年提出把CRISPR作為重復(fù)序列家族的一類成員，并將其命名為Short Regularly Spaced Repeats （SRSRs）。直到2002年，JANSEN等^[6]才將其正式命名為clustered regularly interspaced short palindromic repects（CRISPR），以更準(zhǔn)確的描述這一重復(fù)序列的獨(dú)特結(jié)構(gòu)特征。隨著CRISPR的發(fā)現(xiàn)，CRISPR的功能逐漸被揭示。2005年，3個(gè)研究小組均發(fā)現(xiàn)CRISPR的間隔序列與宿主菌染色體外的遺傳物質(zhì)高度同源，推測(cè)其可能作為細(xì)菌的免疫系統(tǒng)以抵抗外源遺傳物質(zhì)的入侵^[7-11]。BARRANGOU等^[12]首次在嗜熱鏈球菌（Streptococcus thermophilus）中發(fā)現(xiàn)并通過(guò)試驗(yàn)證實(shí)，細(xì)菌能通過(guò)CRISPR系統(tǒng)抵抗噬菌體的入侵。隨后MARRAFFINI等^[13]也發(fā)現(xiàn)在葡萄球菌中CRISPR系統(tǒng)能夠阻止外源基因的水平轉(zhuǎn)移，同時(shí)防止耐藥性的產(chǎn)生，從此揭開了CRISPR系統(tǒng)作用機(jī)制研究的序幕。2013年，CRISPR介導(dǎo)的基因定位編輯技術(shù)出現(xiàn)，研究人員利用這一系統(tǒng)對(duì)人類細(xì)胞、小鼠、大鼠、斑馬魚、細(xì)菌、果蠅、農(nóng)作物等多種生物的基因進(jìn)行定向缺失、插入、激活或抑制等遺傳改造操作，從而證明了 CRISPR 技術(shù)的廣泛應(yīng)用價(jià)值。

2 CRISPR分布與分類

最近更新的CRISPR數(shù)據(jù)庫(kù)顯示，在已完成全基因組測(cè)序的90%古生菌和約40%細(xì)菌中均可鑒定出至少一個(gè)CRISPR位點(diǎn)。不同菌株中的CRISPR位點(diǎn)數(shù)量不同，一個(gè)原核細(xì)胞基因組中通常存在1至幾個(gè)CRISPR位點(diǎn)^[7]。其中詹氏甲烷球菌（Methanocaldococcus jannaschii）的染色體上存在18個(gè)CRISPR位點(diǎn)，在目前已研究的原核生物中排第一位^[14]。CRISPR位點(diǎn)大多定位在染色體上，只有個(gè)別出現(xiàn)在質(zhì)粒中^[15]。

根據(jù)Cas基因核心原件序列的不同，CRISPR/Cas免疫系統(tǒng)可分為3種類型，每一種類型具有很多亞型。目前應(yīng)用最廣泛的是II型，也是3種類型中最為簡(jiǎn)單的一類。I型系統(tǒng)最為復(fù)雜，需要6個(gè)Cas蛋白參與，其中Cas3蛋白對(duì)CRISPR功能的發(fā)揮至關(guān)重要，該蛋白具有解旋酶活性及DNA酶活性，是干擾階段的主要作用酶^[16]。Ⅱ型系統(tǒng)的組成相對(duì)較簡(jiǎn)單，以Cas9蛋白為核心。干擾階段，RNAseⅢ在Cas9蛋白存在的情況下發(fā)揮作用，Cas9蛋白協(xié)助crRNA（CRISPR RNA）的成熟，并參與外源DNA的剪切^[17]。在Ⅲ型系統(tǒng)中，Cas6主要參與crRNA的成熟，加工過(guò)后的crRNA被運(yùn)送至特殊的Cas剪切復(fù)合體中發(fā)揮導(dǎo)向作用^[18]。

3 CRISPR結(jié)構(gòu)

CRISPR主體為CRISPR基因座（CRISPR locus），基因座上游含有一段前導(dǎo)序列（leader sequence，LS）以及與CRISPR功能相關(guān)的基因（CRISPRassociated genes，Cas genes），三者共同構(gòu)成了CRISPR系統(tǒng)。

3.1 CRISPR基因座

CRISPR基因座由簡(jiǎn)短穩(wěn)定的同向重復(fù)序列（direct repect，DR）和長(zhǎng)度相近的非重復(fù)的間隔序列（spacer）間隔排列而成，稱為RS結(jié)構(gòu)。其中重復(fù)序列的片段長(zhǎng)度在21～48 bp^[19]，且含有5～7 bp的回文序列，通常能形成穩(wěn)定的莖環(huán)結(jié)構(gòu)，間隔序列的長(zhǎng)度在26～72 bp，可能來(lái)源于噬菌體、質(zhì)粒等外源DNA序列。

3.2 cas基因

cas基因是存在于CRISPR位點(diǎn)附近的一系列基因，cas基因簇通常由4～10個(gè)保守基因組成^[20]，它表達(dá)出的cas蛋白對(duì)CRISPR防御機(jī)制的實(shí)現(xiàn)不可或缺。cas基因根據(jù)其保守程度可分為核心cas基因、亞型特異性cas基因和重復(fù)序列相關(guān)未知蛋白（repeatassociatedmysteriousproteins，RAMP） 組件基因^[21]。cas1～6基因廣泛存在于各種CRISPR亞型中，故被稱為核心cas基因，其編碼蛋白的功能現(xiàn)已初步得到證實(shí)，例如，Cas1和Cas2蛋白在所有CRISPR類型中均存在，主要在獲取新的重復(fù)序列過(guò)程中發(fā)揮作用^[22]，Cas3則具有核酸酶和解旋酶的功能，主要作用是剪切目標(biāo)基因^[23]。

3.3 Leader序列

前導(dǎo)序列由300～500 bp堿基組成，位于CRISPR的5′端，與第一個(gè)重復(fù)序列直接相連，是一段在物種內(nèi)相對(duì)保守的AT富集的區(qū)域^[24]。研究發(fā)現(xiàn)，新的RS總是插入前導(dǎo)序列和第一個(gè)重復(fù)序列之間，表明前導(dǎo)序列是新插入序列的識(shí)別位點(diǎn)，也有研究指出，它能夠作為啟動(dòng)子，啟動(dòng)CRISPR基因座的轉(zhuǎn)錄^[7]。

4 CRISPR/Cas系統(tǒng)作用機(jī)理

CRISPR/Cas是一種防御系統(tǒng)，用以保護(hù)細(xì)菌和古細(xì)菌不受外來(lái)物質(zhì)的侵害。這些生物基因組中的CRISPR位點(diǎn)能表達(dá)出與入侵病毒基因組序列匹配的crRNA，當(dāng)微生物再次感染這種病毒時(shí)，crRNA能通過(guò)互補(bǔ)配對(duì)與病毒基因組結(jié)合，并表達(dá)出相關(guān)的Cas酶，這些酶能夠切割病毒DNA，從而阻止病毒的基因表達(dá)。研究證明，CRISPR作用機(jī)制可大致分為3個(gè)階段：適應(yīng)階段、表達(dá)階段和干擾階段^[25]。

適應(yīng)階段：在外源物質(zhì)入侵宿主菌后，外來(lái)噬菌體或質(zhì)粒上的一小段DNA序列（前間區(qū)序列，protospacers）會(huì)以非同源重組的方式被整合到宿主菌的基因組中，整合的位置位于前導(dǎo)序列與第一個(gè)重復(fù)序列之間^[12]，且每插入一段外源序列都會(huì)伴隨著一次重復(fù)序列的復(fù)制，從而形成新的RS結(jié)構(gòu)。這一過(guò)程使得宿主CRISPR含有外源序列信息，為干擾階段發(fā)揮作用提供基礎(chǔ)。宿主對(duì)外源DNA序列的選擇也并非隨機(jī)的，研究發(fā)現(xiàn)，在前間區(qū)序列附近含有一些特定序列稱為前間區(qū)序列鄰近序列（protospacer adjacent motifs，PAMs），如嗜熱鏈球菌的NNAGAAW序列^[26]，不同CRISPR亞型對(duì)于PAM的識(shí)別具有特異性。目前，對(duì)于CRISPR攝取外源基因的作用機(jī)制尚不清楚，有待進(jìn)一步研究。

表達(dá)階段：CRISPR基因座首先被轉(zhuǎn)錄成一段長(zhǎng)鏈的RNA，稱為CRISPR RNA前體（PrecrRNA），同時(shí)，Cas蛋白將形成一個(gè)具有內(nèi)切酶功能的復(fù)合物，特異性地將crRNA切割加工成小的成熟crRNA。成熟的crRNA會(huì)與Cas蛋白復(fù)合物結(jié)合形成具有特殊功能的Cas/crRNA作用復(fù)合體，在干擾階段發(fā)揮作用。

干擾階段：當(dāng)宿主再次接觸到外界噬菌體或質(zhì)粒時(shí)，crRNA便會(huì)與其同源的外源核酸特異性結(jié)合，而后通過(guò)Cas/crRNA作用復(fù)合體將外源核酸切割成碎片，使其無(wú)法行使功能，從而達(dá)到保護(hù)宿主基因組的目的。

5 CRISPR的應(yīng)用

5.1 基因定點(diǎn)改造

近年來(lái)，RNA干擾（RNAi）、鋅指核酸酶（ZFNs）、轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)因子核酸酶（TALENs）已應(yīng)用于多種類型的細(xì)胞和生物模型的基因改造，而CRISPR/Cas作為一種全新的基因定點(diǎn)改造技術(shù)引起了國(guó)內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注。

RNAi是一種相對(duì)快速、廉價(jià)、高通量的基于全基因組的基因定向敲除技術(shù)。然而，該技術(shù)的敲除效果仍不夠理想，不同批次試驗(yàn)以及不同實(shí)驗(yàn)室的試驗(yàn)結(jié)果都會(huì)有所差異，同時(shí)也存在不可預(yù)知的脫靶情況，所以該方法目前僅用于需要暫時(shí)抑制基因發(fā)揮功能的試驗(yàn)中，因此局限性大，實(shí)用性不強(qiáng)。

ZFNs，又名鋅指蛋白核酸酶，是一種人工改造的核酸內(nèi)切酶，由一個(gè)DNA 識(shí)別域和一個(gè)非特異性核酸內(nèi)切酶構(gòu)成。該技術(shù)能夠?qū)Π谢蜻M(jìn)行定點(diǎn)切割和基因敲除，可顯著提高同源重組率，是一種高效成熟的基因改造技術(shù)。然而ZNFs雖然具有較高的特異性和精確性，但也會(huì)發(fā)生極低概率的脫靶事件^[27]。

TALENs是一種嶄新的分子生物學(xué)工具。研究發(fā)現(xiàn)，來(lái)自植物細(xì)菌黃單孢桿菌（Xanthomonas sp.）TAL 蛋白的核酸結(jié)合域的氨基酸序列與其靶位點(diǎn)的核酸序列有恒定的對(duì)應(yīng)關(guān)系，因而利用 TAL 的序列模塊，即可組裝成特異的蛋白結(jié)構(gòu)域以結(jié)合任意 DNA 序列，從而達(dá)到定向改造內(nèi)源基因的目的。目前，TALEN 的研究尚處于起步階段，其優(yōu)點(diǎn)很明顯，但在識(shí)別的特異性方面和免疫性方面也存在一定的局限性。

ZFNs和TALENs都是利用蛋白質(zhì)來(lái)定位靶序列，這些蛋白質(zhì)通常很難生成而且成本昂貴。而CRISPRs利用的是RNA，使得設(shè)計(jì)它們變得較為容易，因而具有很好的應(yīng)用前景。

2013 年 1 月份美國(guó)2家實(shí)驗(yàn)室在《Science》雜志發(fā)表了基于 CRISPRCas 技術(shù)在細(xì)胞系中進(jìn)行基因敲除的新方法，該技術(shù)與以往的技術(shù)不同，是利用位點(diǎn)特異性的crRNA將Cas9 核酸酶帶到基因組上的具體靶位點(diǎn)，從而對(duì)特定基因位點(diǎn)進(jìn)行切割。該技術(shù)又迅速被運(yùn)用到基因敲除小鼠和大鼠動(dòng)物模型的構(gòu)建中，這意味著一種全新的基因定點(diǎn)改造系統(tǒng)（CRISPR/Cas9）已經(jīng)出現(xiàn)，其特點(diǎn)是制作簡(jiǎn)單，成本低，作用高效。

5.2 分子分型

對(duì)于同一個(gè)物種，CRISPR位點(diǎn)的重復(fù)序列絕大多數(shù)非常保守^[28-29]；而間隔序列則具有很強(qiáng)的多態(tài)性，即使在同一物種的不同菌株間，間隔序列也往往不同，該性質(zhì)使得CRISPR位點(diǎn)可以作為細(xì)菌分子分型的一個(gè)高分辨率的標(biāo)準(zhǔn)^[8-9]。SCHOULS等^[30]采用CRISPR分型方法對(duì)184株空腸彎曲菌進(jìn)行了分型，分型結(jié)果與AFLP、MLST一致性較高。此外，法國(guó)研究者對(duì)來(lái)源于130個(gè)血清型的783株沙門菌的CRISPR進(jìn)行了研究，結(jié)果表明，CRISPR序列的多態(tài)性與血清型和多位點(diǎn)序列型有著密切的聯(lián)系，說(shuō)明CRISPR對(duì)于沙門菌具有較高的分辨率，可用于分型研究。同時(shí)還建立了間隔序列數(shù)據(jù)庫(kù)，為沙門菌分型和基因分型提供數(shù)據(jù)支持，也為菌株溯源追蹤提供信息^[31]。CRISPR分型方法與傳統(tǒng)的分型方法相比，操作簡(jiǎn)便，對(duì)于基因多態(tài)性較低的細(xì)菌分辨率較高，而對(duì)于基因多態(tài)性較高的細(xì)菌可將CRISPR與其他分型方法相結(jié)合。Liu等將MLST與CRISPR 2種方法相結(jié)合建立了一種新的CRISPRMVLST分型方法，通過(guò)對(duì)沙門菌的2個(gè)毒力基因SseL、FimH和CRISPR序列的研究，對(duì)來(lái)源于9個(gè)血清型的171株沙門菌進(jìn)行了分型， CRISPR序列的加入顯著提高了個(gè)別疾病爆發(fā)菌株的區(qū)分能力，另外，該分型方法對(duì)腸炎沙門菌的區(qū)分能力要高于PFGE^[32]。這表明CRISPR可以作為一種新的分型方法，并具有廣闊的運(yùn)用前景，另外 CRISPR中的間隔序列提供了細(xì)菌所處的外界環(huán)境信息，也可以為細(xì)菌的溯源追蹤提供信息。

6 結(jié)語(yǔ)

CRISPR/Cas系統(tǒng)作為原核細(xì)胞的適應(yīng)性免疫系統(tǒng)，不僅具有特異性和記憶性，還具有可遺傳性。CRISPR的間隔序列高度可變、迅速進(jìn)化^[32-33]，新間隔序列的獲得需要很多因素的作用及相關(guān)蛋白的輔助。間隔序列的獲得使得細(xì)菌能夠很快適應(yīng)外界環(huán)境，也有研究指出，在宿主CRISPR位點(diǎn)中重復(fù)序列與間隔序列構(gòu)成的結(jié)構(gòu)有時(shí)也會(huì)被刪除[9，20，26，33]，被刪除的部分大多是位于CRISPR 3′端較為保守的間隔序列。這些間隔序列的刪除可能是因?yàn)镃RISPR的重復(fù)序列間發(fā)生了同源重組所導(dǎo)致的^[34]，對(duì)CRISPR位點(diǎn)的大小和轉(zhuǎn)錄長(zhǎng)度的控制具有重要的作用。CRISPR在參與原核細(xì)胞的獲得性免疫的同時(shí)，在細(xì)菌和噬菌體兩者的共同進(jìn)化過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。事實(shí)上，在前間區(qū)序列中或前間區(qū)序列鄰近序列中，單一核苷酸的改變能使噬菌體逃避CRISPR免疫機(jī)制^[33]。盡管目前對(duì)CRISPR作用機(jī)制具有大致的了解，但現(xiàn)階段還存在許多問(wèn)題有待更深入的研究和探索。

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