史恒瑞 董平

【摘要】間充質(zhì)干細(xì)胞屬于多潛能干細(xì)胞，其多向分化的能力在臨床治療中有廣泛的應(yīng)用價(jià)值。但通過(guò)目前的研究發(fā)現(xiàn)，間充質(zhì)干細(xì)胞在增殖過(guò)程中存在著隨著體外培養(yǎng)時(shí)間增加增殖潛力和多向分化潛力逐漸喪失的問(wèn)題。因此，如何使間充質(zhì)干細(xì)胞在體外培養(yǎng)時(shí)可以穩(wěn)定地增殖逐漸成為研究的熱點(diǎn)。下面從目前常見(jiàn)的幾種間充質(zhì)干細(xì)胞增殖的方法就間充質(zhì)干細(xì)胞增殖的研究進(jìn)展作一綜述。

【關(guān)鍵詞】間充質(zhì)干細(xì)胞 增殖

【中圖分類號(hào)】R-1 【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】B【文章編號(hào)】1004-4949(2014)07-0605-01

間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells,MSC）是干細(xì)胞的一個(gè)分支，其來(lái)源于發(fā)育早期的中胚層和外胚層，系多潛能干細(xì)胞，其主要存在于結(jié)締組織及器官間質(zhì)中，尤以骨髓中含量最為豐富，在體內(nèi)或體外特定的誘導(dǎo)條件下，可以分化為脂肪、骨、軟骨、肌肉、肌腱、韌帶、神經(jīng)、肝、心肌、內(nèi)皮等多種組織細(xì)胞，這種多向分化潛能和極強(qiáng)的可塑性使其在組織工程、基因治療和免疫治療方面有著巨大的應(yīng)用前景。但人體內(nèi)的間充質(zhì)干細(xì)胞畢竟有限，且MSC在體外傳代、增殖過(guò)程中存在著增殖能力和多向分化能力逐漸喪失的問(wèn)題［6-9］，無(wú)法完全滿足臨床治療的需要，所以，如何獲得量大質(zhì)優(yōu)的間充質(zhì)干細(xì)胞就成為其成功應(yīng)用于臨床治療的瓶頸。本文就不同來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞促增殖方法的角度就間充質(zhì)干細(xì)胞增殖的研究進(jìn)展做一綜述。

1人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞

人羊膜是來(lái)源于胎兒的胚胎早期產(chǎn)物，位于胎盤的最內(nèi)層，厚約0.02-0.05毫米，其透明、韌性佳，無(wú)血管、神經(jīng)和淋巴管等組織，組織結(jié)構(gòu)分為上皮層、基底膜層、致密層、纖維母細(xì)胞層及海綿層，隨孕婦分娩排出體外，是生產(chǎn)的廢棄物。人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞（human amniotic mesenchymal stem cells,hAMSCs）即存在于人羊膜中，具有獲取相對(duì)簡(jiǎn)單、不增加額外創(chuàng)傷、幾乎不受倫理學(xué)限制、來(lái)源豐富、免疫原性低、增殖能力強(qiáng)及多向分化潛能等優(yōu)勢(shì)［1］，有望成為組織工程中理想的種子細(xì)胞。但人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞同樣存在著缺陷，其在體外傳代、增殖過(guò)程中會(huì)逐漸喪失其自我增殖能力及多向分化潛能。為此，張一折等［2］將β-catenin-綠色熒光蛋白重組腺病毒擴(kuò)增后，轉(zhuǎn)染人羊膜間充干細(xì)胞，在熒光倒置顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效率并采用CCK-8法測(cè)定細(xì)胞的生長(zhǎng)狀況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)β-catenin-綠色熒光蛋白在細(xì)胞中高表達(dá)，且由于β-catenin的高表達(dá)刺激了人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖。此外，李彩虹等［3］將人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)至第三代，經(jīng)過(guò)不同濃度的表皮生長(zhǎng)因子處理后采用MTT法測(cè)量細(xì)胞的存活率，通過(guò)計(jì)數(shù)穿過(guò)transwell小室的細(xì)胞數(shù)測(cè)定表皮生長(zhǎng)因子對(duì)細(xì)胞遷徙能力的影響，并用表皮生長(zhǎng)因子受體的抑制劑AG1478及P13K的抑制劑LY294002檢測(cè)其對(duì)細(xì)胞遷徙能力的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)表皮生長(zhǎng)因子處理后的細(xì)胞增殖和遷徙能力均得到一定程度上的增加，為人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞更好地治療皮膚創(chuàng)傷及傷口愈合提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。王兆福等［4］發(fā)現(xiàn)將兩個(gè)個(gè)體來(lái)源的人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞混合培養(yǎng)后增殖情況高于單獨(dú)培養(yǎng)的細(xì)胞，但未做更深入的研究。陳亭等［5］將人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞分別置于體積分?jǐn)?shù)為5﹪02和20﹪02條件下培養(yǎng)并做成骨誘導(dǎo)，觀察細(xì)胞在不同氧濃度下生長(zhǎng)情況及成骨分化情況，得出結(jié)論：與常氧組相比，低氧更能促進(jìn)人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖及成骨分化.并大膽推測(cè)這可能是由于低氧情況下細(xì)胞產(chǎn)生的乳酸明顯減少所導(dǎo)致的。周倩等［10］將人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞分別在孔板靜態(tài)及微載體動(dòng)態(tài)培養(yǎng)條件下擴(kuò)增及成骨誘導(dǎo)，發(fā)現(xiàn)在微載體動(dòng)態(tài)誘導(dǎo)培養(yǎng)條件下可獲得較高的細(xì)胞數(shù)和較好的成骨誘導(dǎo)分化效果，提高了堿性磷酸酶活性與鈣基質(zhì)含量，流體刺激與包被的I型膠原均可促進(jìn)人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化，且兩者聯(lián)合應(yīng)用時(shí)促進(jìn)作用更明顯。因此，基于微載體的動(dòng)態(tài)培養(yǎng)體系可以促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞在骨組織再生工程中的應(yīng)用。

2骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow derived mesenchymal stem ceils，BMSCs)不僅具有干細(xì)胞多向分化潛能，還具有低免疫源性、易于獲取等特點(diǎn)，并易于外源基因的轉(zhuǎn)染和表達(dá)，因此，它已成為細(xì)胞治療和基因治療等領(lǐng)域中能有效發(fā)揮作用的理想工程細(xì)胞［11］。但是骨髓中BMSCs含量極其稀少，BMSCs在體外增殖亦較慢，而且隨著傳代次數(shù)的增加，細(xì)胞表型就會(huì)逐漸喪失［12-13］。因此，如何實(shí)現(xiàn)少量取樣且大批量獲取是BMSCs滿足臨床實(shí)驗(yàn)研究的當(dāng)務(wù)之急。為此，劉紅等［14］ 運(yùn)用siRNA干擾技術(shù)沉默低氧誘導(dǎo)因子-1α 基因，將細(xì)胞分成6組，分別采用四甲基偶氮唑鹽(MTT)法、流式細(xì)胞儀和乳酸脫氫酶(1actic acid dehydrogenase，LDH)活力測(cè)定等方法，檢測(cè)各組BMSCs的增殖、凋亡和壞死情況；Western blot和real-time PCR檢測(cè)各組BMSCs中HIF-1α 、葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)子-1(glucose transporter，GLUT-1)及血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)的mRNA和蛋白的表達(dá)，得出結(jié)論：低氧預(yù)處理可促進(jìn)BMSCs的體外增殖，減輕壞死，其機(jī)制可能與低氧預(yù)處理后HIF-1α 表達(dá)增加及上調(diào)其下游基因GLUT-1和VEGF表達(dá)有關(guān)。王立維等［15］通過(guò)研究得出了與上述實(shí)驗(yàn)相似的結(jié)論：大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植在低氧(體積分?jǐn)?shù)1%O2)下增殖和遷移能力增強(qiáng)。另外，任立杰等［16］為尋求能在體外快速、大量的增殖骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，采用了鋅及堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子單獨(dú)或聯(lián)合加入到培養(yǎng)基中，觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀況，結(jié)果證實(shí)，鋅和堿性成纖維因子均有促進(jìn)體外培養(yǎng)的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖的作用，聯(lián)合應(yīng)用鋅和堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子促增殖作用最強(qiáng)，而且可以保持骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的生物學(xué)活性，可以作為體外擴(kuò)增培養(yǎng)骨髓，基質(zhì)細(xì)胞的最佳培養(yǎng)條件。有研究表明［22］：改良富血小板血漿對(duì)人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖的促進(jìn)作用具有濃度依賴性，且10%改良富血小板血漿可以較好地保持人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的免疫原性。隨著中藥學(xué)的發(fā)展，其獨(dú)特的藥理學(xué)作用也越來(lái)越受到人們的關(guān)注，王明寧等［17］利用香丹注射液促進(jìn)了大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖，這個(gè)發(fā)現(xiàn)也為科研人員開(kāi)辟了新的思路。繼王明寧之后，陸續(xù)有報(bào)道稱淫羊藿苷［18］、麝香酮［19］、獨(dú)參湯［20］、復(fù)方接骨中藥［21］均對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞有促增值的作用。

3臍血間充質(zhì)干細(xì)胞

臍血是嬰兒出生后，留在胎盤和臍帶中的血液，臍血中含有大量的造血干細(xì)胞，同時(shí)還含有豐富的造血基質(zhì)細(xì)胞（基質(zhì)細(xì)胞泛指間充質(zhì)來(lái)源的非造血干細(xì)胞）?；|(zhì)細(xì)胞是造血干細(xì)胞賴以生存的微環(huán)境，在造血調(diào)控中發(fā)揮重要的作用。臍血間充質(zhì)干細(xì)胞即是其中的一種，它具有不同于造血干細(xì)胞的生物學(xué)特性。臍血間充質(zhì)干細(xì)胞與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞相比，具有一些特殊的優(yōu)勢(shì)：臍血來(lái)源最廣泛，對(duì)供者最安全。 采集臍血對(duì)產(chǎn)婦和新生兒均無(wú)任何不良影響。有研究表明［23］：臍血干細(xì)胞端粒和端粒酶活性均長(zhǎng)于和高于骨髓中的干祖細(xì)胞,因此移植后的壽命更長(zhǎng)，可以更持久地維持機(jī)能。Terai等［24］發(fā)現(xiàn)臍血干細(xì)胞通過(guò)轉(zhuǎn)染攜帶人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶的逆轉(zhuǎn)錄病毒以延長(zhǎng)壽命。臍血間充質(zhì)干細(xì)胞為較原始的間充質(zhì)干細(xì)胞，具有更強(qiáng)的增殖、分化能力；而且細(xì)胞的未發(fā)育成熟，特別是免疫重建后T細(xì)胞的功能較弱，因此引起的移植物抗宿主病較弱［25］。盡管臍血間充質(zhì)干細(xì)胞擁有如此多的優(yōu)點(diǎn)，但在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)：臍血間充質(zhì)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)成功率較低，如何提高臍血間充質(zhì)干細(xì)胞的貼壁粘附及生長(zhǎng)需要進(jìn)一步的探索。杜江榕等［26］發(fā)現(xiàn)：在培養(yǎng)基中加入5-100ng/ml的表皮生長(zhǎng)因子（EGF）對(duì)臍血間充質(zhì)干細(xì)胞具有促增殖的效應(yīng)，且作用強(qiáng)度呈劑量依賴性。另有報(bào)道［27］稱：在培養(yǎng)基中添加0.15g/L的還原性谷胱苷肽可以明顯促進(jìn)臍血間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖，并且在增殖的同時(shí)不影響臍血間充質(zhì)干細(xì)胞的表面標(biāo)志分子CD29/CD44/CD45等，通過(guò)此法有望為復(fù)雜疾病的干細(xì)胞治療提供足量的細(xì)胞。顏小華等［28］通過(guò)控制變量、分組培養(yǎng)后發(fā)現(xiàn)：黃岑苷體可有效促進(jìn)人臍血單個(gè)核細(xì)胞的增殖，并推測(cè)可能與在一定程度上激活即刻早期基因核轉(zhuǎn)錄因子K+B，進(jìn)而促使細(xì)胞提高分泌白細(xì)胞介素6水平有關(guān)。王哲等［29］報(bào)道：在每升培養(yǎng)基中加入10、20、50、100微摩爾普羅布考可促進(jìn)細(xì)胞的增殖，降低細(xì)胞ROS含量，增加SOD和GSH-Px活性。

鄭穎娟等［30］ 體外培養(yǎng)臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞，經(jīng)重組腺相關(guān)病毒作為載體介導(dǎo)堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子基因轉(zhuǎn)染，分組培養(yǎng)后，通過(guò)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子后細(xì)胞的生長(zhǎng)速度明顯增快，細(xì)胞周期G0/G1 期減少，S 期細(xì)胞數(shù)增多，說(shuō)明通過(guò)重組腺相關(guān)病毒作為載體介導(dǎo)堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子基因轉(zhuǎn)染能促進(jìn)體外培養(yǎng)的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞增殖，對(duì)其培養(yǎng)有優(yōu)化作用。除在培養(yǎng)基中添加額外成份外，有學(xué)者則將研究重點(diǎn)放在了培養(yǎng)細(xì)胞的大環(huán)境上，據(jù)文獻(xiàn)［31］報(bào)道：恒磁場(chǎng)對(duì)人臍血間充質(zhì)干細(xì)胞增殖的影響與磁感應(yīng)強(qiáng)度有關(guān),0.05mT的磁場(chǎng)促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖，0.1mT的磁場(chǎng)對(duì)間充質(zhì)干細(xì)胞無(wú)明顯影響，0.5mT和1.0mT的磁場(chǎng)抑制間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖,但促進(jìn)增殖的內(nèi)在機(jī)制并未深入研究。

綜上所述，目前國(guó)內(nèi)外大量對(duì)于促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞體外大量增殖的研究，但對(duì)于采用何種方法存在不小的爭(zhēng)議，大量的研究結(jié)果也沒(méi)有系統(tǒng)的闡述促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞增殖的內(nèi)在機(jī)制。因此，明確間充質(zhì)干細(xì)胞增殖的內(nèi)在機(jī)制并建立一套標(biāo)準(zhǔn)化的培養(yǎng)體系來(lái)實(shí)現(xiàn)間充質(zhì)干細(xì)胞的大量增殖顯得十分必要。

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