作者簡(jiǎn)介：姓名：朱美抒性別：女出生年月：1979年4月職位：主治醫(yī)生 【摘要】目的 利用轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(transforming growth factor,TGFβ1)受體抑制劑LY2109761作用于成纖維細(xì)胞，觀察其對(duì)細(xì)胞核內(nèi)過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ（PPARγ）表達(dá)的影響，探討其潛在的抗衰老作用。方法 體外培養(yǎng)人成纖維細(xì)胞，利用MTT法篩選適宜濃度的LY2109761作用于成纖維細(xì)胞，用Western-blot、RT-PCR檢測(cè)對(duì)PPARγ表達(dá)的影響。結(jié)果 TGF-β受體抑制劑LY2109761能顯著增加PPARγ的表達(dá)，并呈劑量依賴效應(yīng)。與對(duì)照組相比，LY2109761處理組PPARγ的表達(dá)量明顯增多(p<0.01)；且LY2109761處理組的PPARγ基因的表達(dá)量顯著增加(p<0.01)。結(jié)論 TGFβ1受體抑制劑LY2109761可誘導(dǎo)PPARγ的表達(dá)增多，具有一定潛在的抗衰老作用。

【關(guān)鍵詞】 過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ 轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β 成纖維細(xì)胞

【中圖分類號(hào)】R619 【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】B【文章編號(hào)】1004-4949(2014)07-0121-02

過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ(peroxisorne proliferator-activated receptorγ,PPARγ)系一類可以被過(guò)氧化物酶體增殖劑激活的核轉(zhuǎn)錄因子超家族，參與機(jī)體的多種病理生理功能的調(diào)控，如糖尿病、炎癥反應(yīng)、細(xì)胞周期等［1-4］。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，PPARγ隨著年齡的增加，表達(dá)量減少［5］。PPARγ具有一定的潛在抗衰老的作用。而激活TGFβ1信號(hào)通路能引起成纖維細(xì)胞出現(xiàn)一系列衰老表型，而其下游機(jī)制作用因子尚不明確。本課題組前期研究證實(shí)TGF-β1和PPARγ存在負(fù)相關(guān)關(guān)系，由此我們提出TGF-β1-PPARγ調(diào)控軸的概念。本研究旨在觀察TGFβ1受體抑制劑LY2109761對(duì)PPARγ表達(dá)的影響，近一步分析 TGFβ1對(duì)PPARγ的調(diào)控。

1材料與方法

1.1材料 成纖維細(xì)胞購(gòu)于中科院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫(kù)。胎牛血清和高糖DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自Gibco公司，LY2109761購(gòu)自selleck公司。Trizol、Real-time PCR試劑盒、SYBR購(gòu)于TAKARA公司，引物購(gòu)美國(guó)Invitrogen公司。TGFβ1和PPARγ抗體均購(gòu)自Santa Cruz公司，蛋白濃度檢測(cè)試劑盒購(gòu)于Bio-Rad公司，全細(xì)胞裂解試劑盒購(gòu)于凱基公司。

1.2細(xì)胞株培養(yǎng) 將成纖維細(xì)胞株接種于含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基（加青霉素10U/ml和鏈霉素100U/ml），置于5%CO2、37培養(yǎng)箱，培養(yǎng)細(xì)胞至融合約為80%時(shí)出傳代，待細(xì)胞處于指數(shù)生長(zhǎng)期是進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)胞增殖測(cè)定：MTT法測(cè)定。胰酶消化細(xì)胞制成細(xì)胞懸液，并調(diào)整至1.5X104/ml，每孔100μl接種于96孔板，24h后分別加入終濃度為0、0.1μM/L、0.5μM/L、1μM/L、5μM/L、10μM/L的LY2109761每組重復(fù)6孔，然后分別培養(yǎng)24h、48h、72h后測(cè)定OD值。

1.3.2 Western-Blot檢測(cè)相關(guān)蛋白：全細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞，提取蛋白，Lowery法測(cè)定蛋白濃度。加上樣buffer煮蛋白。然后依次跑膠、轉(zhuǎn)膜、封閉、一抗孵育、洗膜、二抗孵育、洗膜、顯影操作。以β-激動(dòng)蛋白（β-actin）做內(nèi)參。

1.3.3 RT-PCRRT-PCR提取總RNA按照相關(guān)試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，本實(shí)驗(yàn)采用10μl體系進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，Real-time PCR按照說(shuō)明書(shū)使用20μl體系。相對(duì)表達(dá)量用 2 –△△Ct法計(jì)算，β-actin做內(nèi)參。。

1.3.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析：數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。使用spss17.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，采用分析包括t檢驗(yàn)和方差分析。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)(MTT)：不同濃度的LY2109761處理成纖維細(xì)胞，隨著LY2109761濃度的增加，細(xì)胞活力降低。在藥物濃度達(dá)到5μM/L時(shí)，與對(duì)照組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)，結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2LY2109761 5μM/L處理細(xì)胞后PPARγ蛋白表達(dá)量及mRNA水平變化趨勢(shì)相同。成纖維細(xì)胞經(jīng)LY2109761處理后，PPARγ蛋白增多，mRNA轉(zhuǎn)錄增多。差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)。結(jié)果見(jiàn)圖2。

B

圖2A：對(duì)照組成纖維細(xì)胞與5μM/L的LY2109761處理組中PPARγ表達(dá)量。

B：對(duì)照組成纖維細(xì)胞與5μM/L的LY2109761處理組中PPARγ的mRNA相對(duì)表達(dá)量。注：與對(duì)照組比較* p<0.05

3 討論

成纖維細(xì)胞是疏松結(jié)締組織的主要細(xì)胞成分，由胚胎時(shí)期的間充質(zhì)細(xì)胞分化而來(lái)，它對(duì)不同程度的細(xì)胞變性、壞死和組織缺損以及骨創(chuàng)傷的修復(fù)有著十分重要的作用［6］。最新研究表明成纖維細(xì)胞可以降低年齡老化對(duì)皮膚的影響。

近年來(lái)一些新的研究發(fā)現(xiàn)，PPARγ隨著年齡的增加，表達(dá)量減少［5］，PPARγ具有一定的潛在抗衰老的作用。TGFβ1的激活能引起一系列的衰老表型。本研究通過(guò)TGFβ1受體抑制劑，抑制TGFβ1的功能后發(fā)現(xiàn)，PPARγ表達(dá)增多，且基因水平和蛋白水平表達(dá)均增多，即抑制TGFβ1信號(hào)通路的能夠增加PPARγ的表達(dá)量。TGFβ1受體抑制劑能夠增加PPARγ的表達(dá)，具有一定潛在的抗衰老作用。

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