吳乃君 劉穎 金秀平 陳晶 馬紹杰 盛佳曦 魏劍芬

【摘要】 目的 觀察胰島素抵抗的的水平變化，探討胰島素抵抗脂肪細胞的分子機制。方法 體外培養(yǎng)前脂肪細胞, 并誘導其分化成熟,地塞米松誘導成熟脂肪細胞形成胰島素抵抗，利用RT-PCR 技術(shù)檢測和葡萄糖轉(zhuǎn)運子4表達變化。結(jié)果 地塞米松作用于3T3-L1脂肪細胞葡萄糖消耗量明顯降低, 地塞米松誘導的胰島素抵抗狀態(tài)下AMPK、PPARγ和GLUT4 mRNA表達水平顯著下調(diào)。結(jié)論 地塞米松降低3T3-L1脂肪細胞葡萄糖消耗量產(chǎn)生胰島素抵抗，提示其表達水平下降可能是3T3-L1脂肪細胞胰島素抵抗原因之一。

【關(guān)鍵詞】地塞米松;3T3-L1脂肪細胞;胰島素抵抗;腺苷酸活化蛋白激酶;過氧化物酶增殖受體γ;葡萄糖轉(zhuǎn)運子4

【Abstract】Objective To observe the changes of insulin resistance level, to investigate the molecular mechanism of insulin resistance adipocytes. Cultured preadipocytes in vitro, and induce its differentiation induced by dexamethasone in mature adipocytes,insulin resistance, change 4 expression was measured by RT-PCR technique and glucose transporter. Results dexamethasone effects on glucose consumption of 3T3-L1 cells decreased significantly, state AMPK, PPAR γ and GLUT4 mRNA expression was significantly lower in the dexamethasone induced insulin resistance. Conclusion dexamethasone reduced glucose consumption of 3T3-L1 fatty cells produce insulin resistance, suggesting that the gene expression level decreased may be one reason of insulin resistance in 3T3-L1 adipocytes

【key words 】dexamethasone; 3 t3 - L1 fat cells; Insulin resistance; Amp activated protein kinase; Receptor gamma peroxidase proliferation; The glucose transporter

【中圖分類號】R587.1 【文獻標識碼】B【文章編號】1004-4949(2014)07-0027-01

*基金資助：河北省科技廳《二甲雙胍對同型半胱氨酸及脂源性激素的影響研究》資助，課題編號122777104；唐山市科技局《二甲雙胍對同型半胱氨酸的影響研究》資助，課題編號13130266Z。

肥胖、胰島素抵抗是2型糖尿病發(fā)病的病生理基礎(chǔ)。肥胖是外部表象，內(nèi)在根源在于脂肪細胞體積、數(shù)量的變化及糖、脂代謝紊亂。本研究選取3T3-L1前脂肪細胞為實驗對象, 采用地塞米松誘導建立胰島素抵抗的脂肪細胞模型，觀察地塞米松對3T3-L1脂肪細胞的糖代謝 影響，從分子水平探討3T3-L1脂肪細胞胰島素抵抗的分子機制。

1材料與方法

1.1實驗材料

3T3-L1前脂肪細胞株由天津血液病研究所惠贈。二甲基亞楓、地塞米松、IBMX、油紅O均購自美國Sigma公司；胰島素購自丹麥Novo Nordisk公司、DMEM 培養(yǎng)基購自賽默飛世爾生物化學制品有限公司；葡萄糖測定試劑盒-氧化酶法購自盛科博源公司；熒光定量PCR試劑盒購自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司。

1.2實驗方法

1.2.1體外擴增、培養(yǎng)

大鼠前脂肪細胞（3T3-L1），培養(yǎng)基采用含15% 胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，T25塑料培養(yǎng)瓶在37℃，5%CO2的孵育箱內(nèi)，培養(yǎng)方法為貼壁法，當80%-90%細胞融合時，進行傳代培養(yǎng)，加入完全DMEM培養(yǎng)液，吹打混勻，48小時換液一次。

1.2.2誘導、分化、油紅O染色證實成熟脂肪細胞

取3代細胞，對3T3-L1前脂肪細胞株進行誘導分化。8-12天后顯微鏡下觀察可見80％-90％3T3-L1細胞呈成熟脂肪細胞表型。

1.2.3 地塞米松作用在成熟的3T3-L1脂肪細胞，建立胰島素抵抗細胞模型

把分化好的細胞按實驗設(shè)計分空白組和模型組, 模型組加入1umo l/L 地塞米松建立胰島素抵抗, 48小時換液一次, 分別在48小時，96小時取上清液, 用葡萄糖檢測試劑盒測定培養(yǎng)基中葡萄糖含量，胰島素抵抗的程度以培養(yǎng)基中葡萄糖消耗量反映。

1.2.4胰島素抵抗狀態(tài)下的3T3-L1脂肪細胞AMPK、PPARγ、和GLUT4 mRNA水平測定

在96孔板中, 將誘導分化成熟的3T3-Ll 脂肪細胞分為空白組、模型組，空白組加入等體積細胞培養(yǎng)液。模型組每孔加1μmol/L地塞米松誘導胰島素抵抗，共同孵育96小時，當細胞胰島素抵抗達最佳狀態(tài)時取上清液，檢測培養(yǎng)基中葡萄糖含量（采用葡萄糖試劑盒檢測GOD一POD法)，提取RNA，采用熒光定量PCR試劑盒監(jiān)測AMPK、PPARγ、和GLUT4 mRNA。

AMPKα引物:

上游：5—CCTTTACCACGGTTGATTTCTC—3

下游：5—CAGGCTCTACTTTGATCGCACT—3

PPARr引物：

上游：5—GTACTGTCGGTTTCAGAAGTGCC—3

下游：5—TCCGCCAACAGCTTCTCCT—3

GLUT4引物：

上游：5—TCTCGGTGCTCTTAGTAG—3

下游：5—CCAATCTCAAAGAAGGCCACAAA—3

GAPDH引物：

上游：5—GGTGAAGGTCGGTGTGAACG—3

下游：5—GCTCCTGGAAGATGGTGATGG—3

1.3統(tǒng)計學方法

所有數(shù)據(jù)采用SPSS13.0軟件包進行統(tǒng)計分析，計量資料以均數(shù)士標準差（ X±s）表示，組間差異用t檢驗，P<0.05有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 3T3-L1脂肪細胞形態(tài)的觀察：

未誘導分化的3T3-L1前脂肪細胞呈為梭形成纖維細胞，胞漿內(nèi)沒有脂滴，胞核清晰。在誘導分化的第5天，鏡下可見細胞形態(tài)變圓、體積增大，細胞內(nèi)在細胞核周圍可見少量脂肪小滴。第10-12天呈成熟的脂肪細胞形態(tài)，在細胞核周圍有大量圓形脂肪滴聚集，細胞更圓更亮，油紅O染色后胞漿內(nèi)脂滴呈紅色，胞核呈藍色，證實為成熟脂肪細胞。

2.2培養(yǎng)基上清葡萄糖測定

3T3-L1脂肪細胞誘導分化成熟后，給予地塞米松作用，分別測48h，96h空白組及模型組細胞培養(yǎng)上清葡萄糖濃度，空白組48h葡萄糖OD值1.4798±0.0026，96小時葡萄糖OD值1.4755±0.003，模型組48h葡萄糖OD值2.2218±0.0437，96小時葡萄糖OD值2.5342±0.0076，模型組葡萄糖濃度高于空白組（P<0.05），模型組葡萄糖濃度96h高于48小時（P<0.05），可見96h胰島素抵抗達最佳。

3討論

糖尿病發(fā)病率逐年上升，肥胖及胰島素抵抗是糖尿病發(fā)病中心環(huán)節(jié)。由于取材、生存能力差等因素，目前脂肪細胞研究多采用3T3-L1脂肪細胞，本實驗參考AnilKumar ［1］的方法，對3T3-L1前脂肪細胞株進行誘導分化。實驗結(jié)果顯示，地塞米松降低了3T3-L1脂肪細胞的葡萄糖糖轉(zhuǎn)運，推測其可能通過抑制脂肪細胞的葡萄糖攝取降低胰島素敏感性，誘導3T3-L1脂肪細胞產(chǎn)生胰島素抵抗，這與國內(nèi)文獻報道相近［1］。從培養(yǎng)基中轉(zhuǎn)運葡萄糖入細胞的量降低, 殘存在培養(yǎng)基中的葡萄糖比對照組明顯增多，胰島素抵抗形成。

參考文獻

［1］郭曉農(nóng)，楊具田， 牛峰等.胰島素抵抗3T3-L1脂肪細胞模型的建立及鑒定［J］.中藥材，2008,31（2）：258-261［2］吳乃君，1973年9月出生，女，河北省唐山市人，副主任醫(yī)師，博士學位，研究方向：糖尿病及慢性并發(fā)癥。