袁瓊嘉，張金梅，鄧文騫，王富鴻，李 雪，王 璐

衰老是生物體不可避免的過程，伴隨著衰老的進行各種器官的功能也會下降，其中，腦衰老就表現(xiàn)為學(xué)習(xí)記憶能力的衰退，這已成為影響眾多老年人生活質(zhì)量的主要原因之一。如何延緩衰老、提高老年人的學(xué)習(xí)記憶能力成為眾多科學(xué)研究的熱點。自由基理論是目前衰老研究的一個熱點，該學(xué)說認(rèn)為機體內(nèi)存在一套完整的產(chǎn)生和清除自由基的動態(tài)平衡體系，老年人的防御功能減弱，腦自由基的清除能力降低，會導(dǎo)致過多的自由基聚集導(dǎo)致細(xì)胞膜、細(xì)胞器受損，誘導(dǎo)神經(jīng)元凋亡，使其功能嚴(yán)重破壞，從而使學(xué)習(xí)記憶能力下降［18］。因此，減少自由基產(chǎn)生，增強機體抗氧化能力成為延緩衰老的一個重要手段。超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase，SOD）和谷胱甘肽過氧化酶（Glutathione peroxidase，GSH-PX）是機體內(nèi)兩種重要的抗氧化酶，丙二醛（Malondialdehyde，MDA）是脂質(zhì)過氧化物的代謝產(chǎn)物，可間接反映自由基對機體的損傷程度，是目前常用來反映機體抗氧化能力的指標(biāo)［19］。適宜的體育鍛煉則能夠加快自由基的清除，增強機體抗氧化能力［24，26］。研究已經(jīng)證明海馬是空間學(xué)習(xí)記憶形成的重要區(qū)域，學(xué)習(xí)記憶形成的神經(jīng)基礎(chǔ)是突觸的可塑性（包括結(jié)構(gòu)可塑性和功能可塑性）。而在突觸可塑性中，神經(jīng)細(xì)胞粘附分子（Neural cell adhesion molecule，NCAM）起了非常重要的調(diào)節(jié)作用［14］，NCAM的正常表達不僅是海馬形態(tài)保持和功能發(fā)育的必要條件，而且參與了海馬學(xué)習(xí)記憶的形成過程［13］。有研究發(fā)現(xiàn)長期的中等負(fù)荷運動能夠上調(diào)成年大鼠NCAM基因的表達［10］。然而，運動對大鼠衰老過程中腦功能的影響，以及這種影響是否與NCAM基因的表達的變化相關(guān)，尚不得而知。

本研究旨在通過對大鼠在衰老過程中進行有氧運動干預(yù)，觀察有氧運動對大鼠腦衰老、學(xué)習(xí)記憶能力和海馬NCAM表達情況的影響。為揭示有氧運動干預(yù)腦衰老、提高學(xué)習(xí)記憶能力及其機制提供神經(jīng)生物學(xué)的實驗數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物分組及實驗方案

4月齡雄性（SPF）級SD大鼠48只，體重409±32g。購于成都達碩生物科技有限公司，動物生產(chǎn)許可證CSXK（川）2008-24。動物分籠飼養(yǎng)，自由飲食，自然光照，動物房內(nèi)溫度26±3℃，相對濕度為40%～60%，國家標(biāo)準(zhǔn)嚙類動物飼料喂養(yǎng)。大鼠購進后，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，先隨機分為生理鹽水對照組（C組）、D-半乳糖衰老模型組（D組）、D-半乳糖致衰老＋有氧運動干預(yù)組（DS組）3個大組。為期6周的衰老造模結(jié)束以后，每組再隨機分為2個小組:一組自然喂養(yǎng)7天，為“N”組，另一組進行7天的Morris水迷宮實驗，為“M”組，分別記錄為:CN、DN、DSN、CM、DM、DSM組。

D-半乳糖（sigma公司）注射采用腹腔注射法，根據(jù)大鼠的體重，D組采用100mg／kg／d（用生理鹽水將D-半乳糖稀釋成5%濃度，即注射量為2ml／kg／d）的注射劑量，每天1次，持續(xù)6周，同時，C組進行同劑量的生理鹽水注射，DS組上午進行D-半乳糖注射，晚上進行有氧運動，60 min／天，6天／周，共6周。游泳訓(xùn)練在玻璃游泳缸（150cm×60cm×100cm）內(nèi)進行，水深80cm，水溫32±2℃［4］。

1.2 Morris水迷宮行為學(xué)訓(xùn)練和測試

1.2.1 定位航行實驗

每次訓(xùn)練將大鼠面向池壁依次從4個象限的固定入水點放入水中，電腦追蹤記錄大鼠從入水到登上站臺所需要的時間（潛伏期）；如果大鼠在2min內(nèi)沒有找到站臺，將其引導(dǎo)至站臺，停留10s，潛伏期為120s。連續(xù)訓(xùn)練6天，記錄每只大鼠每天每個象限的潛伏期。

1.2.2 空間探索實驗

第7天將迷宮內(nèi)站臺拆除，依次從第1～4象限的入水點將大鼠放入池中，記錄每個象限1min內(nèi)大鼠穿越原站臺的次數(shù)。

1.3 動物取材及樣本處理

各組大鼠按照造模設(shè)計時間分別處死，斷頭取腦，在冰冷的生理鹽水中漂洗，除去血液，濾紙拭干，于冰上切割，剝離海馬。將海馬、大腦皮質(zhì)分裝入凍存管中，迅速放入液氮中保存。

1.4 自由基指標(biāo)檢測

大腦皮質(zhì)蛋白含量、SOD酶活性、GSH-PX酶活性、MDA含量測定分別采用考馬斯亮藍蛋白測定試劑盒、SOD WST-1法測定試劑盒、微量還原型谷胱甘肽測定試劑盒、MDA測定試劑盒進行測定。以上試劑盒均由南京建成科技有限公司提供，實驗操作方法嚴(yán)格按照說明書進行。

1.5 Real-time PCR檢測海馬NCAM基因的mRNA表達

采用Trizol法提取總的RNA:取適量海馬組織，按50～100mg／ml Trizol加入Trizol；使用分光光度計（Thermo Scientific NanoDrop 2000）檢測mRNA含量，估算其純度和濃度，用2%的瓊脂糖凝膠檢測總RNA的完整性；采用iScriptTM DNA Synthesis Kit試劑盒（BIO-RAD）將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA；采用SsoAdvancedTM SYBR○RGreen Supermix試劑盒（BIO-RAD）進行Real-time PCR反應(yīng)。引物序列（TaKaRa寶生物工程有限公司）:NCAM（擴增長度171 bp）上游:5′-Agg AgA AAT CAg CgT Tgg AgA-3′，下游:5′-TTg Tag ATg gTg Agg gTA gAg gA-3；β-actin（擴增長度99bp）上游:5′-CgT AAA gAC CTC TAT gCC AAC A-3′，下游:5′-Tag gAg CCA ggg CAg TAA TC-3′。反應(yīng)結(jié)束后，數(shù)據(jù)處理采用2-△△CT（Livak）方法，在進行數(shù)據(jù)分析以前，先驗證目標(biāo)基因NCAM和參照基因β-actin擴增效率都接近100%，之后就可以運用2-△△CT法進行不同樣本中目標(biāo)基因表達水平的相對差異，數(shù)據(jù)由Bio-Rad CFX Manager system自動分析得出，圖像由軟件自動生成。

1.6 Western blotting檢測海馬NCAM基因的蛋白表達

海馬稱重，1mg加入20μl RIPA裂解液（1ml RIPA裂解液＋10μl PMSF溶液）提取蛋白，測定蛋白濃度，然后用裂解液進行總蛋白定量，用蛋白將上樣緩沖液稀釋成1×，于100℃水浴鍋中變性10min，-20℃保存?zhèn)溆?；進行SDS-PAGE凝膠電泳，然后轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素薄膜（PVDF），將PVDF膜置于5%脫脂奶粉中室溫封閉1h，用同樣濃度的脫脂奶粉稀釋一抗（ab9018）（1∶1000），4℃封閉過夜；用山羊抗小鼠lgG／辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗檢測目標(biāo)蛋白。應(yīng)用Quantity One分析軟件，用條帶軌跡定量分析法（TraceTracking）對圖片上的條帶進行灰度值分析，將上述目的基因掃描值與各自的β-actin表達產(chǎn)物掃描值相比，以其比值作為目的蛋白的表達量。

1.7 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 17.0進行統(tǒng)計。實驗結(jié)果均以“均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。組間差異采用重復(fù)測量方差分析，處理前先對測量數(shù)據(jù)進行球形檢驗，如檢驗結(jié)果P＞0.05，用單因素方差分析進行處理；如檢驗結(jié)果P＜0.05，對重復(fù)測量方差分析檢驗結(jié)果中時間點F值的自由度調(diào)整后進行處理。取P＜0.05時差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般情況觀察

與C組相比，D組大鼠精神不振、行動遲緩、嗜睡、皮毛卷曲枯黃、無光澤，毛發(fā)脫落嚴(yán)重。

2.2 自由基檢測結(jié)果

由表1可見，DN組SOD、GSH-PX活性顯著性低于DSN、CN組（P＜0.01），而 MDA含量非常顯著性高于DSN、CN組（P＜0.01），其他各組之間相比均無顯著性差異（P＞0.05）。

表1 本研究大鼠大腦皮質(zhì)自由基的表達一覽表Table 1 Expression of Free Radicals of Rat Cerebral Cortex（U／mg，，n＝5）

表1 本研究大鼠大腦皮質(zhì)自由基的表達一覽表Table 1 Expression of Free Radicals of Rat Cerebral Cortex（U／mg，，n＝5）

注:▲表示與CN組相比P＜0.01，★表示與DN組相比P＜0.01，◆表示與CM組相比P＜0.01，●表示與DN組相比P＜0.01。

CN組 DN組 DSN組 CM組 DM組 DSM組SOD 143.30±15.03105.00±11.00▲ 134.00±21.68★ 142.00±16.23113.00±7.84◆ 150.00±7.56●GSH-PX 30.90±1.34 23.20±4.10▲ 29.70±4.72★ 27.30±4.07 20.70±1.28◆ 29.50±4.23●MDA 0.49±0.07 0.69±0.15▲ 0.39±0.03★ 0.47±0.04 0.67±0.08◆ 0.51±0.04●

2.3 Morris水迷宮行為學(xué)檢測結(jié)果

2.3.1 Morris水迷宮定位航行平均潛伏期結(jié)果

由圖1可見，各組大鼠的潛伏期隨著訓(xùn)練次數(shù)增加逐漸縮短。Morris水迷宮訓(xùn)練期間，各組大鼠第2～6天潛伏期均顯著短于第1天（P＜0.05），第3～6天也顯著短于第2天（P＜0.05），第3～6天CM、DSM 組間無顯著差異（P＞0.05）。

2.3.2 Morris水迷宮空間探索實驗結(jié)果

由表2可以看出，CM組大鼠穿越站臺次數(shù)非常顯著性多于DM（P＜0.01），DSM組大鼠穿越站臺次數(shù)顯著性多于 DM（P＜0.05）。

圖1 本研究各組大鼠水迷宮定位航行平均潛伏期變化趨勢示意圖Figure 1.The Average Incubation Trends of Rats Water Maze Place Navigation

表2 本研究大鼠穿越站臺次數(shù)一覽表Table 2 The Through Number of Space Exploration of Rats（）

表2 本研究大鼠穿越站臺次數(shù)一覽表Table 2 The Through Number of Space Exploration of Rats（）

注:★表示與CM組相比P＜0.01，▲表示與DM組相比P＜0.05。

站臺穿越次數(shù)CM組4.27±1.10 DM組 2.62±1.45★DSM組 3.91±1.76▲

2.4 大鼠海馬NCAM mRNA及蛋白表達檢測結(jié)果

2.4.1 海馬NCAM mRNA實驗結(jié)果

表3顯示，CN、DSN組NCAM mRNA表達非常顯著性上調(diào)于DN組（P＜0.01）；CM、DSM組也非常顯著性上調(diào)于DM 組（P＜0.01）。

2.4.2 海馬NCAM蛋白表達實驗結(jié)果

表4顯示，CN、DSN組表達非常顯著性上調(diào)于DN組（P＜0.01）；CM、DSM 非常顯著性上調(diào)于DM組（P＜0.01），且 DSM 組顯著性上調(diào)于CM 組（P＜0.05）。圖3為各組大鼠NCAM蛋白及內(nèi)參蛋白β-actin的western blot條帶。

表3 本研究各組大鼠海馬NCAM基因mRNA表達量一覽表Table 3 The Express Quantity of NCAM mRNA of Rat Hippocampal（）

表3 本研究各組大鼠海馬NCAM基因mRNA表達量一覽表Table 3 The Express Quantity of NCAM mRNA of Rat Hippocampal（）

注:▲表示與CN組相比P＜0.01，★表示與DN組相比P＜0.01，◆表示與CM組相比P＜0.01，●表示與DM組相比P＜0.01。

CN組 DN組 DSN組 CM組 DM組 DSM組NCAM 1.39±0.08 0.31±0.04▲ 1.16±0.08★ 1.34±0.03 0.37±0.05◆ 1.37±0.09●

表4 本研究大鼠海馬NCAM基因蛋白表達量一覽表Table 4 The Express Quantity of NCAM Protein of Rat Hippocampal（）

表4 本研究大鼠海馬NCAM基因蛋白表達量一覽表Table 4 The Express Quantity of NCAM Protein of Rat Hippocampal（）

注:▲表示與CN組相比P＜0.01，★表示與DN組相比P＜0.01，◆表示與CM組相比P＜0.05，●表示與DM組相比P＜0.01。

CN組 DN組 DSN組 CM組 DM組 DSM組NCAM 0.78±0.03 0.26±0.06▲ 0.80±0.04★ 0.87±0.04 0.36±0.04◆ 0.96±0.07●

圖3 本研究各組大鼠海馬NCAM蛋白的表達示意圖Figure 3.The Express Quantity of NCAM Protein of Rat Hippocampal in Every Group

3 分析與討論

自由基衰老學(xué)說由1956年英國學(xué)者哈曼（Harman D）提出，該學(xué)說認(rèn)為細(xì)胞代謝過程中不斷產(chǎn)生自由基是引起人類衰老的主要原因［18］。自由基是生物體新陳代謝過程中產(chǎn)生的一類具有氧化活性的帶負(fù)電的離子，自由基的過度堆積，會破壞細(xì)胞的結(jié)構(gòu)，引起脂質(zhì)過氧化，干擾人體正常的生理活動，最終導(dǎo)致疾病和衰老［25］。人體有一套清除體內(nèi)自由基的防御系統(tǒng)，其中，SOD以及GSH-PX是體內(nèi)清除自由基的主要酶類。SOD廣泛存在于生物體的各種組織中，能催化體內(nèi)自由基O-2（超氧陰離子自由基）歧化，而O-2可使脂質(zhì)過氧化，損傷細(xì)胞膜，促使機體衰老。SOD和GSH-PX等協(xié)同可以將體內(nèi)大部分的O-2反應(yīng)掉。GSH-PX是機體內(nèi)催化分解H2O2的酶，可以分解體內(nèi)較多的過氧化物，減輕機體組織細(xì)胞內(nèi)過氧化損傷，起到保護細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和功能的作用［21］，但是隨著年齡的增大，SOD、GSH-PX等酶的活性降低，導(dǎo)致自由基清除能力減弱，過量的過氧化物堆積會造成機體生物膜的損傷，促使更多脂質(zhì)過氧化的反應(yīng)，使體內(nèi)脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA水平升高，MDA本身會對生物膜造成損傷，因此MDA含量的高低是機體氧自由基損傷程度的重要標(biāo)志［17］。

在衰老相關(guān)研究中，衰老模型的建立較為關(guān)鍵，常用有自然衰老模型和藥物致衰老模型，而腹腔注射D-半乳糖致衰老模型是國內(nèi)外常用的藥物衰老動物模型，其原理是機體半乳糖濃度升高會導(dǎo)致代謝紊亂，破壞并消耗機體抗氧化防御系統(tǒng)，使體內(nèi)自由基脂質(zhì)過氧化反應(yīng)加劇，引起過氧化效應(yīng)，產(chǎn)生大量氧自由基，導(dǎo)致機體的衰老［5-7］。本研究通6周的衰老模型之后，從一般情況觀察，D組與C組相比，大鼠精神不振、行動遲緩、嗜睡、皮毛卷曲枯黃、無光澤，毛發(fā)脫落嚴(yán)重表現(xiàn)出明顯衰老癥狀。通過自由基檢測，D組大鼠大腦皮質(zhì)SOD活性、GSH-PX活性顯著性低于C組，MDA含量顯著性高于C組，本研究結(jié)果可以證明本次D-半乳糖腦衰老造模成功。

運動對機體自由基代謝的影響主要包括兩個方面:一方面是機體對自由基清除能力的影響，一方面是對自由基生成量的影響［9］。有實驗證明:有氧運動對腦自由基代謝有著積極的影響，如，6周的跑臺運動增高了大腦皮層和海馬的SOD、GSH-PX的活性，降低了 MDA、LPO的含量［2］；適度的有氧運動提高大腦的抗氧化能力，抑制脂質(zhì)過 氧 化 反 應(yīng)［1，4，8］。MDA 作 為 脂 質(zhì) 過 氧 化 的 代 表 產(chǎn) 物 ，是衡量機體自由基反應(yīng)強度的敏感指標(biāo)。它的含量反映了機體脂質(zhì)過氧化的速率和強度，間接反映體內(nèi)自由基的水平［16，22］。本研究發(fā)現(xiàn)，與 DN組相比，進行了有氧運動干預(yù)的DSN組大鼠SOD、GSH-PX的活性顯著的升高，同時，脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA的含量降低了，表明6周的有氧運動能夠顯著提升機體的抗氧化能力，從而對D-半乳糖誘導(dǎo)的衰老過程起到積極的干預(yù)作用。

然而這種運動干預(yù)能否對衰老過程中伴隨的腦功能的下降起到積極的影響？研究者采用Morris水迷宮實驗進行了驗證。Morris水迷宮是英國著名的心理學(xué)家Morris設(shè)計并應(yīng)用于研究腦學(xué)習(xí)記憶機制的一種實驗手段，已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于學(xué)習(xí)記憶、老年癡呆、海馬／外海馬研究、智力與衰老等多個學(xué)科的科學(xué)研究，在世界上已經(jīng)得到廣泛地認(rèn)可，平均潛伏期是檢測大鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力的重要指標(biāo)［11］。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，各組大鼠的潛伏期隨著訓(xùn)練次數(shù)的增加逐漸縮短，說明大鼠在學(xué)習(xí)過程中能夠產(chǎn)生短時記憶，并改善再次學(xué)習(xí)過程；各組大鼠第2天平均潛伏期與第1天相比均有顯著性差異，表明3個組的大鼠空間學(xué)習(xí)記憶的初步形成都是在第1天訓(xùn)練之后；這可能是短時記憶的形成階段；在第2天和第3天之間波動較大，此時可能是記憶進入泛化階段，空間記憶不穩(wěn)定，而C組大鼠的學(xué)習(xí)效果明顯優(yōu)于采用了D-半乳糖致衰老的D組，提示大鼠衰老過后對新鮮事物的學(xué)習(xí)速度有所下降。第4天以后變化趨勢開始趨于平穩(wěn)，可能是由于學(xué)習(xí)已經(jīng)進入自動化階段；第6天時各組大鼠的潛伏期間無明顯差異，表明經(jīng)過6天的重復(fù)練習(xí)，大鼠基本都能夠產(chǎn)生學(xué)習(xí)效果。第7天的空間探索實驗是為了探討各組大鼠的記憶能力是否有差別，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，DM組大鼠穿越站臺次數(shù)顯著性少于CM組，表明衰老減弱了大鼠的空間記憶能力，而DSM組大鼠的平臺穿越次數(shù)顯著性高于DM組，提示在衰老過程中進行有氧運動鍛煉可以提高空間學(xué)習(xí)記憶能力，對這種衰老引起的腦功能下降起到一定的延緩作用。結(jié)合對各組大鼠腦抗氧化能力的檢測結(jié)果，提示運動這種改善腦功能的機制可能是通過提高神經(jīng)細(xì)胞的抗氧化能力，從而減少腦衰老過程中海馬神經(jīng)元的凋亡，達到延緩腦的衰老。然而，學(xué)習(xí)和記憶是一個信息長期儲存的復(fù)雜過程，其具體機制尚未明了，目前普遍接受的是突觸連接的加強對信息的儲存有利，那么運動是否也是通過改善突觸聯(lián)系來影響大鼠學(xué)習(xí)記憶能力，研究者進行了進一步的研究。

NCAM屬于細(xì)胞粘附分子免疫球蛋白超家族成員之一，是神經(jīng)發(fā)育的關(guān)鍵因子，在軸突和樹突的生長以及突觸可塑性中起著關(guān)鍵的作用。海馬是學(xué)習(xí)記憶產(chǎn)生的關(guān)鍵部位，NCAM的正常表達不但能夠維持海馬的形態(tài)正常 ，對 其 功 能 的 保 持 更 是 意 義 重 大［15，23］。 如 果 將 小 鼠NCAM-180基因敲除，其神經(jīng)細(xì)胞的遷移干擾和損害了海馬精細(xì)細(xì)胞結(jié)構(gòu)，致使苔蘚纖維不能正常成束、神經(jīng)纖維末端分布錯亂等，進而影響了學(xué)習(xí)記憶的形成［20］，而通過轉(zhuǎn)基因手段提高細(xì)胞外域NCAM的表達水平能夠提高皮質(zhì)可塑性，改善記憶能力［12］，國內(nèi)也有研究者報道通過觀察腦損傷后海馬ChAT和NCAM的含量的變化，發(fā)現(xiàn)腦損傷后認(rèn)知障礙變化趨勢與海馬ChAT和NCAM的含量變化趨勢相似［3］。這些報道均表明，NCAM的表達水平，尤其是在大腦海馬區(qū)域的表達，對于個體的學(xué)習(xí)記憶能力有著顯著的影響。而運動能否改變NCAM的表達水平？在前期研究中，研究者發(fā)現(xiàn)7周的中等負(fù)荷運動能夠明顯改善正常大鼠NCAM蛋白的表達［10］。本研究試圖探討運動與衰老所致的學(xué)習(xí)記憶下降及NCAM表達的關(guān)系。結(jié)果發(fā)現(xiàn)伴隨著腦的衰老，學(xué)習(xí)記憶能力的下降，海馬的NCAM的表達水平也下降。6周的有氧運動干預(yù)可以明顯改善NCAM的表達，減少其下降水平，這與行為學(xué)測試結(jié)果相一致，提示衰老過程中的有氧運動干預(yù)可能是通過維持海馬NCAM基因的正常持續(xù)表達，從而改善衰老大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力，然而，鑒于學(xué)習(xí)記憶過程的復(fù)雜性，以及運動對于機體影響的廣泛性，這可能僅僅是其中的原因之一，更為具體的機制仍有待進一步研究。

4 結(jié)論

衰老過程中的有氧運動干預(yù)可以提高大鼠腦SOD、GSH-PX的活性，抑制MDA的生成，并且改善大鼠的空間學(xué)習(xí)記憶能力；運動可能是通過上調(diào)NCAM的基因的表達影響衰老大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力。

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