張 亮，韓志強(qiáng)

(1.黑龍江省家畜繁育指導(dǎo)站，哈爾濱 150069;2.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院，黑龍江 大慶 163319;3.黑龍江省農(nóng)墾科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所 150038)

家畜胚胎移植是繼人工授精之后，在家畜繁殖學(xué)領(lǐng)域的又一項(xiàng)有重大影響的生物技術(shù)。胚胎移植，特別是凍胚移植對(duì)家畜的引種、改良以及良種擴(kuò)繁意義重大，越來(lái)越受到人們的重視。在歐洲，冷凍胚胎的使用率己達(dá)到47.8%，玻璃化冷凍胚胎可獲得接近鮮胚的移植妊娠率[1]，與慢速冷凍[2]的移植妊娠率相似。以冷凍胚胎代替活畜引種，不但可以節(jié)省人力、物力、財(cái)力，同時(shí)可一次大量引進(jìn)，而且可以把引種過(guò)程中疾病傳播的幾率降到最低限度[3]。在國(guó)內(nèi)，目前綿羊胚胎移植的移植妊娠率還不太理想，仍有許多問(wèn)題亟待解決。本研究探討了移植時(shí)采用不同胚胎類(lèi)型對(duì)妊娠率的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

選擇具有兩個(gè)以上正常情期，健康無(wú)疾病，繁殖機(jī)能正常的東北半細(xì)毛羊(3～5歲)，共400只。

1.2 試驗(yàn)時(shí)間

2005年8月15日～10月15日。2011年7～8月。

1.3 主要試驗(yàn)藥物與儀器

氟孕酮陰道海綿栓、腹腔內(nèi)窺鏡、體視顯微鏡、可移動(dòng)手術(shù)車(chē)、常規(guī)手術(shù)器械以及抗生素等。

1.4 受體同期處理方法

在繁殖季節(jié)，給受體羊陰道內(nèi)植入孕酮海綿栓，埋植13 d。在撤栓24 h后放入試情公羊試情，記錄24～72 h內(nèi)發(fā)情的羊只，視為同期處理有效。以發(fā)情始期記為第0天，在第6天對(duì)受體羊移植。

在原核移植實(shí)驗(yàn)時(shí)，以受體埋栓當(dāng)天記第0天，在埋栓的第9天早對(duì)受體進(jìn)行撤栓，同時(shí)肌注200～250 IU孕馬血清促性腺激素(PMSG)。

1.5 胚胎來(lái)源

本試驗(yàn)的進(jìn)口冷凍胚胎來(lái)自澳大利亞公司的肉用品種薩?？搜虻腁級(jí)胚胎;鮮胚和自制冷凍胚胎來(lái)自本場(chǎng)的薩福克羊，先超數(shù)排卵，然后部分胚胎采用玻璃化冷凍，制成冷凍胚胎。以上胚胎均為囊胚。

原核胚由超數(shù)排卵獲得，供體為東北細(xì)毛羊。原核胚是在轉(zhuǎn)基因試驗(yàn)中，經(jīng)過(guò)原核注射的。

1.6 胚胎解凍

從液氮罐中取出裝有胚胎的細(xì)管，在空氣中停留10 s，同時(shí)拔掉細(xì)管口的活塞，然后放入32℃水中20 s，剪開(kāi)細(xì)管口，推出胚胎，放入I液6 min，I液為蔗糖+Holding液+乙二醇(1∶1∶1);再放入 II液6 min，II液為乙二醇+Holding液(1∶1);再在顯微鏡下檢查其數(shù)量和級(jí)別，待用。

自制凍胚也采用上述方法解凍。

1.7 胚胎移植

采用腹腔內(nèi)窺鏡手術(shù)法移植。在受體羊的腹部，乳房前5 cm處的腹中線對(duì)側(cè)各開(kāi)1個(gè)1 cm的小口，利用腹腔內(nèi)窺鏡配合鈍性宮鉗，觀察受體羊卵巢上的卵泡、黃體發(fā)育情況，并根據(jù)黃體情況移植。將胚胎移入卵巢上黃體發(fā)育良好的一側(cè)子宮角的前1/3處。原核胚從輸卵管傘移入。術(shù)后對(duì)創(chuàng)口進(jìn)行縫合，注射青、鏈霉素各一支。

1.8 妊娠的確定

在移植母羊中，以最后產(chǎn)羔、可見(jiàn)流產(chǎn)、早產(chǎn)、死產(chǎn)為確定妊娠母羊數(shù)。

1.9 數(shù)據(jù)分析

采用Excel中的數(shù)據(jù)分析軟件和利用《生物統(tǒng)計(jì)附試驗(yàn)設(shè)計(jì)》(第二版)進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同囊胚類(lèi)型對(duì)妊娠率的影響

本次試驗(yàn)對(duì)82只同期發(fā)情的綿羊進(jìn)行胚胎移植，比較了三種類(lèi)型胚胎的妊娠效果。其妊娠率分別為鮮胚組59.46%、自制凍胚組21.43%、進(jìn)口凍胚組35.48%，鮮胚組與兩凍胚組妊娠率差異均顯著(P＜0.05)，兩凍胚組差異不顯著(P＞0.05)(表1)。

表1 不同胚胎類(lèi)型對(duì)妊娠率的影響

從胚胎類(lèi)型對(duì)胚胎移植效果的試驗(yàn)結(jié)果可以看出，鮮胚移植明顯好于凍胚移植。這個(gè)結(jié)果與王素梅等[4]的結(jié)果相似。其鮮胚妊娠率與王金文等[5]取得的54.17%鮮胚妊娠率相似的結(jié)果。雖然自制凍胚組的妊娠率低于進(jìn)口凍胚組，但差異不顯著，說(shuō)明可以代替進(jìn)口凍胚用于今后的凍胚生產(chǎn)，為今后生產(chǎn)凍胚奠定了基礎(chǔ)。

目前，乙二醇作為防凍劑可獲得接近鮮胚的移植妊娠率[6]。但本次顯著低于鮮胚移植，胚胎冷凍保存方面還有待于提高。

2.2 囊胚和原核胚對(duì)妊娠率的影響

本試驗(yàn)比較了囊胚和原核胚移植的效果。見(jiàn)表2。

表2 不同胚胎對(duì)妊娠率和產(chǎn)羔效率的影響

從結(jié)果來(lái)看，原核胚的移植效果遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于囊胚移植效果。其主要原因有三方面:1)在構(gòu)建轉(zhuǎn)基因原核胚的過(guò)程中，原核注射對(duì)胚胎產(chǎn)生了損傷，甚至死亡。2)在原核胚發(fā)育到囊胚的過(guò)程中，胚胎發(fā)育阻滯和早期胚胎死亡的現(xiàn)象。3)也有可能在辨認(rèn)原核胚和未受精卵時(shí)發(fā)生誤判，在移植的原核胚中有未受精卵。

在實(shí)際生產(chǎn)中，囊胚移植效果更易掌握。所以在常規(guī)綿羊胚胎移植中采用囊胚移植更能節(jié)省受體羊的費(fèi)用，更利于生產(chǎn)應(yīng)用。

3 結(jié)論

在綿羊胚胎移植中，鮮胚移植好于凍胚移植，自制凍胚接近進(jìn)口凍胚的移植水平，為日后的胚胎生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。

在綿羊胚胎移植中，原核胚的移植效果遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于囊胚移植效果，囊胚更適合用于生產(chǎn)。

[1] Brail G，Traldi A L，Connie Y，et al.Successful direct transfer of vitrified sheep embryos [J].Therionenolony，2001，56:299-305.

[2] Heyman Y，Vincent C，Gamier V，et al.Transfer of frozen thawed embryos in Sheep [J].Vet Rec，1987，120:83-85.

[3] 付靜濤，朱士恩.綿羊同期發(fā)情與冷凍胚胎移植技術(shù)的研究[J].中國(guó)畜牧雜志，2005，41(8):32-33、57

[4] 王素梅，元美玉.非繁殖季節(jié)胚胎因素對(duì)綿羊胚胎移植影響的研究 [J].中國(guó)畜牧獸醫(yī)，2005，32(7):30-31

[5] 王金文，張果平，李煥玲.杜泊綿羊超數(shù)排卵與胚胎移植試驗(yàn) [J].中國(guó)草食動(dòng)物，2006，26(1):14-15

[6] Brebion P，Baril G，Cognie Y，et al.Embryo transfer in sheep and goat[J].Ann Zoot，1992，41:331-339.