呂貴斌

為研究復(fù)方郁金散治療雞大腸桿菌病療效情況，實驗中對某疑似雞大腸桿菌病的病例進(jìn)行病原分離鑒定，確定其病原為致病性大腸桿菌。在此基礎(chǔ)上，選用復(fù)方郁金散、白頭翁散、黃連解毒湯、五味消毒飲、公英散進(jìn)行中藥藥敏實驗。從中發(fā)現(xiàn)，復(fù)方郁金散對大腸桿菌高敏感。且用復(fù)方郁金散對患有大腸桿菌病的雞只進(jìn)行治療，取得較好效果。

一、材料

1.病料 疑似大腸桿菌病的雞、小白鼠。

2.實驗藥物 中藥方劑復(fù)方郁金散（郁金150克、黃柏90克、黃芩90克、梔子80克、白芍80克、茯苓80克、訶子60克、甘草60克、黃連30克），黃連解毒湯，五味消毒飲，公英散，白頭翁湯。

3.儀器及培養(yǎng)基 ①儀器。超凈工作臺、冰箱、高壓滅菌器、恒溫培養(yǎng)箱、生化培養(yǎng)箱、顯微鏡、天平、酒精燈。②培養(yǎng)基。普通瓊脂培養(yǎng)基、麥康凱培養(yǎng)基、三糖鐵培養(yǎng)基、伊紅美蘭培養(yǎng)基、五糖發(fā)酵管、蛋白胨水培養(yǎng)基、葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基、枸櫞酸鹽培養(yǎng)基、尿素瓊脂培養(yǎng)基。

二、方法

1.病料分離培養(yǎng) 無菌采集發(fā)病雞糞便，劃線接種于伊紅美蘭培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)24小時，觀察其生長情況。取伊紅美蘭瓊脂上菌落的一部分進(jìn)行革蘭氏染色，油鏡下檢查菌體形態(tài)染色特點，對分離菌進(jìn)行初步鑒定。

2.生化實驗 取可疑菌落另一部分在三糖鐵斜面表面劃線，之后深部穿刺。①五糖發(fā)酵實驗。取三糖鐵培養(yǎng)基上的可疑菌落分別接種葡萄糖、乳糖、麥芽糖、甘露醇、蔗糖，37℃培養(yǎng)，24～48小時后觀察其生長情況，并記錄結(jié)果。②吲哚實驗。取三糖鐵上可疑菌落接種至蛋白胨水培養(yǎng)基中，置37℃恒溫培養(yǎng)48～72小時，取出，沿管壁緩慢加入吲哚試劑1毫升，觀察結(jié)果。③甲基紅實驗。取三糖鐵上可疑菌落接種至葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基中，置37℃恒溫培養(yǎng)24～48小時，取出，滴加數(shù)滴甲基紅試劑至培養(yǎng)液中，搖勻觀察結(jié)果。④二乙酰實驗。取三糖鐵上可疑菌落接種至葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基中，置37℃恒溫培養(yǎng)48～72小時，取出，加入二乙酰試劑甲液0.6毫升，乙液0.2毫升，搖勻，靜置15～20分鐘觀察結(jié)果。⑤枸櫞酸鹽實驗。取三糖鐵上可疑菌落接種至枸櫞酸鹽培養(yǎng)基斜面上，經(jīng)37℃恒溫培養(yǎng)24～48小時，觀察結(jié)果。⑥尿素實驗。取三糖鐵上可疑菌落，接種尿素瓊脂斜面，不穿刺到底部，下部留作對照。37℃恒溫培養(yǎng)24～48小時，觀察結(jié)果。

3.動物回歸試驗 取相同條件下小白鼠10只，分為2組，每組5只。第一組5只小白鼠腹腔注射大腸桿菌液1.5毫升，另一組5只小白鼠腹腔注射同等劑量的生理鹽水，作為對照組，正常情況下飼養(yǎng)，進(jìn)行觀察。

4.中藥藥敏實驗 ①普通營養(yǎng)瓊脂制備。將玻璃平皿洗凈晾干。用干燥滅菌箱120℃滅菌1小時。將消毒好的瓊脂趁熱通過玻璃棒引入平皿，每皿需20～25毫升瓊脂液，瓊脂厚度3～4毫米，倒完蓋上平皿，涼透放入冰箱備用。②藥敏片制備。將濾紙片用打孔器或剪刀剪成小圓形或小正方形，用干燥滅菌箱滅菌備用。③接種病原大腸桿菌。死雞內(nèi)臟大腸桿菌含菌量很高，因此可以直接用接種環(huán)蘸取病死雞內(nèi)臟組織（肝、心包、氣囊等），然后均勻涂布于瓊脂表面，但注意不要劃破瓊脂，然后在平皿底壁中心及四周用鋼筆寫上藥物名稱（一般一個平皿做5種藥物）。④中藥藥液制備。復(fù)方郁金散、白頭翁散、黃連解毒湯、五味消毒飲、公英散，每種中藥準(zhǔn)確稱取10克粉碎后，用紗布包好，放入1000毫升燒杯內(nèi)，煎藥時間按藥性不同確定。根據(jù)煎藥時間不同，加入200～400毫升自來水，浸泡1小時，然后用電爐分別煎30分鐘，過濾。沉渣再加1∶8或1∶5自來水繼續(xù)煎30分鐘，過濾。將滅菌干燥好的藥敏片浸入煎煮好的復(fù)方郁金散、白頭翁散、黃連解毒湯、五味消毒飲、公英散藥液中。浸入數(shù)分鐘后，再用細(xì)針頭蘸取藥片貼到瓊脂上（與所寫藥名的位置對應(yīng)），最后放入恒溫箱37℃培養(yǎng)，18～20小時觀察結(jié)果。⑤藥物敏感性判定。抑菌圈直徑與藥物敏感性關(guān)系如下：抑菌直徑>20毫米為極敏感；抑菌直徑在15～20毫米為高敏感；抑菌直徑在10～14毫米為中敏感；抑菌直徑<10毫米為低敏感；抑菌直徑為0不敏感。

三、結(jié)果

1.涂片染色鏡檢 革蘭氏染色鏡檢，見到革蘭氏陰性、散在的小桿菌。

2.菌落形態(tài)及培養(yǎng) 伊紅美蘭瓊脂上為許多圓形或橢圓形黑色略帶金屬光澤的菌落。

3.大腸桿菌的生化結(jié)果

4.動物回歸實驗結(jié)果 注射生理鹽水的小白鼠精神狀態(tài)良好，無發(fā)現(xiàn)任何發(fā)病癥狀。注射大腸桿菌液的小白鼠第一天死亡1只，第二天死亡2只，第三天死亡1只，1只耐過。取發(fā)病死亡的小白鼠的心臟、肝臟組織，進(jìn)行革蘭氏染色涂片鏡檢，鏡下為單在或成對、散在的粉紅色菌落。

5.中藥藥敏實驗結(jié)果 從恒溫培養(yǎng)箱取出瓊脂平板，用帶有刻度的尺子測量抑菌圈直徑，復(fù)方郁金散抑菌圈直徑為18毫米，對大腸桿菌高敏感；白頭翁散抑菌圈直徑為12毫米，對大腸桿菌中敏感；黃連解毒湯抑菌圈直徑14毫米，對大腸桿菌中敏感；公英散抑菌圈直徑8毫米，對大腸桿菌低敏感；五味消毒飲未見有抑菌圈出現(xiàn)，對大腸桿菌不敏感。

通過本次試驗研究，對可疑大腸桿菌病雞的病原菌進(jìn)行分離培養(yǎng)鑒定，染色特性，培養(yǎng)特性，生化特性，動物回歸實驗與大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)特性基本一致。由此可確定為大腸桿菌。

四、臨床治療

用大劑量復(fù)方郁金散對患有大腸桿菌病的雞只進(jìn)行治療，有效降低雞只死亡率及發(fā)病率。城子坦某雞場今年暴發(fā)兩次大腸桿菌病，均用復(fù)方郁金散對雞群進(jìn)行治療。第一批雞場共1萬只雞，1000只雞發(fā)病，用復(fù)方郁金散治療，治愈980只，死亡20只。第二批共9000只雞，發(fā)病500只，治愈470只，死亡30只。與其他藥物相比，治愈率較高，死亡率很低。

五、結(jié)論

1.通過分離培養(yǎng)鑒定、涂片鏡檢、生化試驗、動物回歸試驗，確為致病性大腸桿菌。

2.藥敏實驗結(jié)果顯示復(fù)方郁金散對大腸桿菌高敏感。

3.臨床治療，用復(fù)方郁金散對雞進(jìn)行治療，表明復(fù)方郁金散治療效果較好。