吳家斌，余細(xì)蓮

（江西農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，江西 南昌 330045）

姜片吸蟲病是布氏姜片吸蟲寄生于人和豬的小腸內(nèi)引起的一種人畜共患病，嚴(yán)重危害著兒童健康及仔豬生長發(fā)育[1、2]。為減少經(jīng)濟(jì)損失，從教學(xué)科研入手探尋姜片吸蟲病診斷、防治的新方法，標(biāo)本制作在寄生蟲病的教學(xué)科研中發(fā)揮著十分重要作用[3]。寄生蟲標(biāo)本特別是蠕蟲標(biāo)本制作，常因采集活蟲體標(biāo)本的時(shí)間、數(shù)量等條件因素的限制，不能及時(shí)全部進(jìn)行染色制片，采用不同固定液保存后，待需要時(shí)進(jìn)行染色制片。吸蟲類染色標(biāo)本制作過程包括固定、染色、脫水、透明和封片等5個步驟。但具體到不同蟲種，實(shí)際操作步驟亦有所不同。本試驗(yàn)以福爾馬林固定20多年的姜片吸蟲和德氏蘇木素染液，蟲體較大而肥厚，染色標(biāo)本制作難度較大。目前，未見有關(guān)姜片吸蟲染色片制作的報(bào)道。本研究旨以長期固定的較大肥厚蟲體，制作永久性染色標(biāo)本提供理論依據(jù)。

1 材料

1.1 蟲體

福爾馬林固定20多年的姜片吸蟲（江西農(nóng)大動科院寄生蟲實(shí)驗(yàn)室提供）。

1.2 染料及藥品

蘇木素、無水酒精、二甲苯、36%鹽酸、濃氨水、甘油、銨明礬、中性樹膠。

1.3 器具

解剖鏡、數(shù)碼相機(jī)、托盤天平、玻片鑷、1.5mm厚載玻片、3mm厚載玻片（自制）、蓋玻片（自制）擦鏡紙、定性濾紙（直徑12cm）、燒杯（500mL、250mL）、刻度吸管（10mL），洗耳球（中號）量筒（100mL）、扁形稱量瓶（50mL）、玻璃漏斗（直徑12cm）、鐵三角架、棕色試劑瓶（250mL）、文件夾子（中號）、滴管（膠頭）。

2 方法

2.1 溶液的制備

2.1.1 脫水液。洗耳球及刻度吸管分別吸取無水酒精6mL、10mL、16mL、18mL、19mL、20mL于扁形稱量瓶中，又分別吸取蒸餾水14mL、10mL、4mL、2mL、1mL、0mL依次兌加，配制30%、50%、80%、90%、95%、100%酒精溶液標(biāo)記備用。

2.1.2 染色液。天平稱取蘇木素2g，倒入含有12.5mL 95%酒精的500mL燒杯中，向其中加入200mL的飽和銨明礬溶液(約含銨明礬11%），將此混合液曝露于日光及空氣中3～7d或更長時(shí)間,待其充分氧化成熟，再分別加入甘油、甲醇各50mL保存，并待其顏色充分變暗，經(jīng)定性濾紙置鐵三角架上的玻璃漏斗中過濾，濾液用燒杯接裝后倒入棕色試劑瓶中標(biāo)記備用。

2.1.3 退色液。洗耳球及刻度吸管分別吸取無水酒精、蒸餾水、鹽酸各35mL、15mL、1mL于250mL燒杯中混勻，倒出約20mL于扁形稱量瓶中標(biāo)記備用。

2.1.4 透明液。倒出約20mL二甲苯于扁形稱量瓶中標(biāo)記備用。

2.2 蟲體固定液的脫去

玻片鑷取出福爾馬林固定多年的姜片吸蟲于燒杯中，加滿清水浸泡24h后分別移入70%、50%、30%酒精浸泡各1h。

2.3 蟲體制薄

玻片鑷取出已脫去固定液的1條蟲體于兩塊自制載玻片之間，以文件夾子夾住，使蟲體受力逐漸增大、均勻，整體浸泡水中24h或更長時(shí)間，觀察蟲體相當(dāng)薄時(shí)可卸掉文件夾子取下蟲體進(jìn)行染色制片。

2.4 試驗(yàn)分組

蟲體染色、透明時(shí)間，綜合參考唐愛芬、肖芳萍、徐會梅、孔繁瑤[4～7]對吸蟲標(biāo)本制作方法改進(jìn)設(shè)定。試驗(yàn)共分9組，每組3個蟲體重復(fù)。染色時(shí)間設(shè)為16h、22h、28h，每個染色時(shí)間又分16h、22h、28h不同透明時(shí)間。

2.5 染色標(biāo)本制作[4]

洗耳球、刻度吸管吸取染色液2mL于扁形稱量瓶中，兌加20mL蒸餾水將染色液稀釋10倍；蟲體置染色液中分別經(jīng)16h、22h、28h取出，蒸餾水沖洗后分別通過30%、50%、70%酒精依次經(jīng)35min、40min、45min脫水；移入退色液（酸酒精）中，退色時(shí)間以觀察蟲體表面呈淡紅色，內(nèi)部構(gòu)造呈深紅色，顏色深淺分明為好；蟲體分別移入80%、90%、95%、100%依次經(jīng)40min、30min、50min、60min后再移入二甲苯中透明，透明時(shí)間分別為16h、22h、28h；取出蟲體置載玻片上，滴加適量中性樹膠，加蓋自制蓋玻片封固。

2.6 標(biāo)本效果評定

解剖鏡下觀察姜片吸蟲形態(tài)結(jié)構(gòu)，每個蟲體按口吸盤、腹吸盤、盲腸、卵黃腺、梅氏腺、卵巢、子宮及睪丸8個器官結(jié)構(gòu)清晰度給分，清晰的給2分，隱約可見的給1分，不見的給0分，每組3個蟲體重復(fù)，每組蟲體總得分為48分（2×8×3＝48），以每組蟲體器官結(jié)構(gòu)的清晰度為效果評判標(biāo)準(zhǔn)（清晰度＝實(shí)得分／總得分×100%）。

3 結(jié)果

3.1 染色、透明時(shí)間對各組蟲體器官結(jié)構(gòu)清晰度影響情況

染色16h、22h、28h中的透明22h的清晰度分別以89.6%、83.3%和75%為最高，其中又以染色16h、透明22h時(shí)清晰度89.6%為最高，標(biāo)本效果最好；3個染色時(shí)間內(nèi)的3個透明時(shí)間姜片吸蟲的8種器官結(jié)構(gòu)以卵黃腺清晰度均為100%為最高易著色，卵巢、盲腸清晰度最低（詳見表1和圖1）。

表1 染色、透明時(shí)間對各組蟲體器官結(jié)構(gòu)清晰度影響情況

圖1 染色、透明時(shí)間對各組蟲體標(biāo)本清晰度影響情況

3.2 染色標(biāo)本制作要點(diǎn)

試驗(yàn)研究表明，按以下步驟、方法制作染色標(biāo)本，效果較好（詳見表2）。

表2 姜片吸蟲染色標(biāo)本制作技術(shù)要點(diǎn)

3.3 染色效果觀察

腹吸盤位于蟲體前端，呈漏斗狀，大小是口吸盤的4～6倍?？谖P后接咽和食道及兩條盲端的腸管，腸管彎曲不分枝，直達(dá)蟲體末端。腹吸盤的后方有彎曲的子宮，子宮內(nèi)充滿蟲卵。卵巢位于子宮與梅氏腺之間，呈佛手狀。卵黃腺呈顆粒狀密布于蟲體兩側(cè)，卵黃腺管與梅氏腺相連。兩個高度分支的睪丸前后排列在蟲體后部中間（詳見圖2、圖3）。

圖2 姜片吸蟲染色標(biāo)本（10×1倍）

圖3 姜片吸蟲各器官結(jié)構(gòu)（5×4倍）

4 分析與討論

4.1 試驗(yàn)特點(diǎn)

蟲體固定液脫去、蟲體制薄、染色、脫水、脫色、透明、裝片等步驟，仍處于摸索試驗(yàn)階段，每個步驟順序及處理時(shí)間均直接影響制片效果。尤其染色對象是福爾馬林固定20多年的姜片吸蟲，蟲體較大、較厚，彈性差、易破損，蟲體制薄受壓后染液及透明液難于滲透，染色標(biāo)本制作難度增加，合理調(diào)整染色及透明時(shí)間是染色標(biāo)本制作關(guān)鍵。

4.2 體會

各種蟲體標(biāo)本可長久地浸于甲醛液中保存，但在染色前均須重新放置于70%、50%、30%酒精后才能用于染色；蟲體制薄是長期浸于甲醛液中姜片吸蟲染色片制作關(guān)鍵，采用文件夾子逐漸施壓蟲體，漸漸變薄，不然蟲體易破碎；染色使用的染液是德氏蘇木素染液，其染色時(shí)間染色時(shí)間為16h；脫色以肉眼觀察蟲體表面為淡紅色，時(shí)間約為5～12min；通過30%、50%、70%、80%、90%、95%、100%酒精脫水時(shí)間依次為 35min、40min、45min、40min、30min、50min、60min；透明時(shí)間為22h；制片效果較好。

4.3 出現(xiàn)的問題及解決辦法

比對課本介紹的制作方法進(jìn)行標(biāo)本制作，標(biāo)本的顏色過淺，不易在顯微鏡下觀察。經(jīng)研究分析，顏色過淺原因：一是由于肥厚蟲體制薄受壓后細(xì)胞間隙變小，染液不易滲透而著色困難，二是染色時(shí)間較短、脫色時(shí)間較長，調(diào)整時(shí)間后標(biāo)本的著色效果良好。其次，標(biāo)本觀察中出現(xiàn)結(jié)構(gòu)層次不明顯、界限模糊的現(xiàn)象，改善透明時(shí)間后，標(biāo)本的結(jié)構(gòu)層次明顯。再次，有的標(biāo)本制成后發(fā)現(xiàn)有的蟲體邊緣破損和起霧現(xiàn)象，破損原因是蟲體固定時(shí)間較長彈性較差，制薄受壓過大過急。而起霧原因是酒精梯度脫水時(shí)間不當(dāng)，改善后問題被解決。

[1]李國清主編，獸醫(yī)寄生蟲學(xué)(雙語版)[M].北京：中國農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社,2006(7):113～114.

[2]汪明主編，獸醫(yī)寄生蟲學(xué).[M].第3版，北京：中國農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社,2004(1):266.

[3]趙輝元主編，家畜寄生蟲與防制學(xué)[M].長春：吉林科學(xué)技術(shù)出版社，1996(7).

[4]唐芬.肝片形吸蟲制片標(biāo)本的制作技術(shù)[J].山東畜牧獸醫(yī).2009,30(3):9～11.

[5]肖芳萍.不同保存期吸蟲標(biāo)本胭脂紅染色時(shí)間的比較[J].中國獸醫(yī)科技，2002(32)：41.

[6]徐會梅.片形吸蟲標(biāo)本制作方法改進(jìn)[J].山東畜牧獸醫(yī)，2006(1).47～48.

[7]孔繁瑤主編.家畜寄生蟲學(xué)(第1版)[M].北京：中國農(nóng)業(yè)學(xué)出版社，1981(6):472～473.